李可昕 王翔 劉莘然 劉洋

〔摘要〕 目的 提取獲得柳葉白前粗多糖（CSP90），對其單糖組成、形貌特征和抗氧化活性進(jìn)行分析。方法 通過水提醇沉法提取CSP90，利用HPLC測定單糖組成，通過掃描電子顯微鏡分析形貌特征，并測定CSP90對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的清除作用。結(jié)果 CSP90的糖含量和蛋白質(zhì)含量分別為94.7%和2.86%，主要由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，其微觀結(jié)構(gòu)的聚集狀態(tài)部分呈凹凸不平的不規(guī)則薄碎片狀結(jié)構(gòu)，邊緣不平整，而部分結(jié)構(gòu)呈光滑連綿的薄片，伴有一些分支，說明CSP90呈無定形結(jié)構(gòu)。在1.6 mg·mL-1的濃度下，CSP90與抗壞血酸（VC）對DPPH自由基的清除率分別為96.5%和97.6%，表明CSP90具有較好的DPPH自由基清除活性。結(jié)論 CSP90含有多種單糖，并且對DPPH自由基的清除能力較好，有望被開發(fā)成一種天然的抗氧化劑。

〔關(guān)鍵詞〕 柳葉白前;多糖;單糖;形貌特征;抗氧化性

〔中圖分類號〕R284;R285? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.06.003

Study on Composition， Morphological Characteristics and Antioxidant Activity of Crude Polysaccharide from Cynanchum Stauntonii

LI Kexin1， WANG Xiang1， LIU Xinran2， LIU Yang3*

（1. Graduate School， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 301617， China; 2. School of Chinese Materia Medica， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 301617， China; 3. Chinese Medical College， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 301617， China）

〔Abstract〕 Objective The crude polysaccharides were extracted and purified from Cynanchum stauntonii （CSP90）， and the monosaccharide composition， morphological characteristics and antioxidant activities were analyzed. Methods CSP90 was obtained by water extraction and alcohol precipitation. The monosaccharides composition of CSP90 was determined by high-performance liquid chromatography （HPLC）. The morphological characteristics were analyzed by scanning electron microscopy. While the 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH） radical scavenging activity of CSP90 was further determined. Results The sugar and protein contents of CSP90 were 94.7% and 2.86%， respectively. CSP90 was mainly composed of glucose， galactose， and arabinose. Some of the microstructures of CSP90 were irregular and thin fragments with uneven edges， while some of the microstructures were smooth and continuous slices with some branches， indicating that CSP90 had an amorphous structure. At a concentration of 1.6 mg·mL-1， the scavenging rates of DPPH radical by CSP90 and ascorbic acid （VC） were 96.5% and 97.6%， indicating that CSP90 had better DPPH radical scavenging activity. Conclusion CSP90 contained a variety of monosaccharides and had a good DPPH radical scavenging ability. It is hoped that CSP90 will be developed into a natural antioxidant.

〔Keywords〕 Cynanchum stauntonii; polysaccharide; monosaccharide; morphological characteristics; antioxidant activity

人體在生命活動(dòng)中會(huì)不斷地產(chǎn)生自由基，健康的人體中自由基的產(chǎn)生與清除維持著動(dòng)態(tài)平衡，一旦平衡被破壞，人體就可能受到氧化損傷[1]。研究[2]表明，炎癥、衰老等常常與人體產(chǎn)生的過量自由基有關(guān)，所以為保證人體健康，人們不斷開發(fā)具有抗氧化作用的藥品、食品和保健品。多糖是一種由單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子化合物，常分布于天然植物、動(dòng)物及微生物中，是生命活動(dòng)中不可缺少的物質(zhì)[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[3-4]發(fā)現(xiàn)多糖具有抗炎、抗腫瘤、抗高血壓、抗氧化及提高免疫力等作用，其中抗氧化作用一直是多糖藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

藥典收載的白前來源有兩種，包括蘿藦科植物柳葉白前[Cynanchum stauntonii （Decne.） Schltr.ex

Lévl.]和芫花葉白前[Cynanchum glaucescens（Decne.） Hand.-Mazz.]，以根莖和根入藥，具有降氣、消痰、止咳的作用，常用于治療肺氣壅實(shí)、咳嗽痰多等癥狀[5]?，F(xiàn)有報(bào)道中關(guān)于柳葉白前的成分研究主要集中于甾體類、高級脂肪酸、植物甾醇和揮發(fā)性成分，而對于白前多糖的研究較少[6-8]。當(dāng)前藥材市場中常常將白薇、白射干、徐長卿和老瓜頭藥材與白前混用[9]，鑒定這些藥材的化學(xué)成分能夠減少用藥的錯(cuò)誤，保證臨床用藥的安全性。為進(jìn)一步發(fā)掘柳葉白前多糖成分的組成和活性，本研究通過水提醇沉法提取粗多糖，采用HPLC進(jìn)行單糖組成分析，同時(shí)利用掃描電子顯微鏡觀察多糖的形貌特征，并進(jìn)行初步的體外抗氧化檢測，為進(jìn)一步研究柳葉白前多糖提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 材料、儀器與試劑

柳葉白前藥材購自河北安國中藥材市場，由南開大學(xué)郭遠(yuǎn)強(qiáng)教授對飲片進(jìn)行了物種鑒定，確定為蘿藦科植物柳葉白前的干燥根及根莖。I2000型數(shù)字電子天平（深圳市無限量衡器有限公司）;紫外分光光度計(jì)（PerkinElmer公司）;Quanta 200掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）;LC-3000高效液相色譜儀（北京創(chuàng)新恒通科技有限公司）。甘露糖（批號：DST180130-047，純度≥98.0%）、葡萄糖醛酸（批號：DST190226-016，純度≥98.0%）、半乳糖醛酸（DST190325-065，純度≥98.0%）、葡萄糖（批號：DST180817-041，純度≥98.0%）、半乳糖（批號：DST190320-168，純度≥98.0%）、巖藻糖（批號：DST-180325-566，純度≥98.0%）均購于德思特生物技術(shù)有限公司（成都）;鼠李糖（批號：815A035，純度≥98.0%）、木糖（批號：1228A023，純度≥98.0%）、阿拉伯糖（批號：718G043，純度≥99.0%）購于Solarbio科技有限公司（北京）。三氟乙酸（TFA）（批號：T103291）和VC（批號：A103533）購自阿拉丁試劑有限公司（上海），1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）（批號：P109105）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海），乙腈為色譜純，其他化學(xué)藥品和試劑均為分析純。

1.2? 柳葉白前多糖的提取與純化

采用水提醇沉法對柳葉白前多糖進(jìn)行提取，稱取柳葉白前藥材500 g，在室溫下經(jīng)水浸泡12 h后，以1∶10的料液比在90 ℃煎煮提取3次，每次3 h。過濾除去藥材殘?jiān)?，合并上清液并減壓濃縮得到600 mL溶液。得到的濃縮液經(jīng)過無水乙醇沉淀至終濃度為90%，在4 ℃放置12 h后，離心得到139 g 90-沉淀。將90-沉淀溶解在1 600 mL蒸餾水中，加入400 mL Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，劇烈振搖后，靜置5 h等待分層。分層結(jié)束后，棄去中下層的蛋白和有機(jī)試劑，再加入400 mL Sevag試劑重復(fù)除蛋白2次。濃縮上層的多糖溶液，分裝進(jìn)透析袋中（截留分子量：8 kDa），經(jīng)去離子水透析2 d后，將透析袋內(nèi)液體通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至30 mL，真空凍干后即得柳葉白前粗多糖，標(biāo)記為CSP90。

1.3? 糖含量的測定

采用改良苯酚-硫酸法[10]測定CSP90的糖含量：吸取0.4 mg·mL-1葡萄糖溶液各加0、20、40、60、80、100、120、140、160 μL于試管內(nèi)，加蒸餾水補(bǔ)足至200 μL備用。配制0.1 mg·mL-1 CSP90樣品溶液，取200 μL備用。向葡萄糖溶液和CSP90溶液中各加入100 μL苯酚溶液，搖勻，迅速加入1 mL濃硫酸，搖勻，室溫靜置30 min，在490 nm處測定吸光度。實(shí)驗(yàn)平行測定3次，記錄數(shù)據(jù)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=3.060 3 x+0.024 3，R2=0.999 8，依據(jù)樣品的吸光度計(jì)算出糖含量。

1.4? 蛋白質(zhì)含量測定

參照劉玉明等[11]的方法配置成含有0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250、4.7%乙醇和8.5%磷酸的混合溶液備用。配制1 mg·mL-1的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃保存?zhèn)溆?。吸?、0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08、0.10 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，加入蒸餾水補(bǔ)足至0.1 mL。再避光加入5 mL考馬斯亮藍(lán)混合溶液，充分混勻。將溶液在30 ℃反應(yīng)5 min，冷卻至室溫后，于595 nm處測定吸光度。同時(shí)配制5 mg·mL-1的CSP90樣品溶液，取0.1 mL按上述步驟處理，測定吸光值。實(shí)驗(yàn)平行測定3次，記錄數(shù)據(jù)。以蛋白溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.905 9 x+0.032 6，R2=0.999 9，依據(jù)樣品的吸光度計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。

1.5? 全波長掃描檢測

全波長掃描常用來測定多糖中是否有蛋白質(zhì)和核酸殘留，當(dāng)多糖溶液在260 nm和280 nm中未觀察到吸收峰時(shí)，說明多糖中不含核酸和蛋白質(zhì)[12]。配制0.2 mg·mL-1的CSP90溶液，通過紫外分光光度計(jì)在200～400 nm進(jìn)行全波長掃描，分析得到圖譜。

1.6? 單糖組成分析

單糖組成依據(jù)Zhang等[13]的方法進(jìn)行檢測，根據(jù)圖譜中的色譜峰時(shí)間和峰面積計(jì)算出樣品的單糖組成及比例。將4 mg CSP90與2 mL TFA（2 mol·L-1）在120 ℃下油浴6 h，得到多糖水解液，再加入100 μL PMP甲醇溶液（0.5 mol·L-1）和100 μL NaOH溶液（0.3 mol·L-1），標(biāo)記為樣品溶液，備用。標(biāo)準(zhǔn)品的處理如下：配置2 mmol·L-1甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖的單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液各50 μL，分別加入500 μL NaOH溶液（0.3 mol·L-1）和500 μL PMP甲醇溶液（0.5 mol·L-1），混勻后備用。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液在70 ℃的水浴鍋中反應(yīng)30 min，冷卻后，在樣品溶液中加入105 μL鹽酸（0.3 mol·L-1）溶液，標(biāo)準(zhǔn)品溶液中各加入510 μL鹽酸（0.3 mol·L-1）溶液中和，再分別加入等體積的氯仿溶液，劇烈震搖后，離心，去除氯仿層，反復(fù)萃取兩次。取上層水相經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液經(jīng)HPLC分析（Kromasil 100-5-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液-乙腈（83∶17）為流動(dòng)相，進(jìn)樣體積為20 μL，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長設(shè)定為250 nm。將CSP90和標(biāo)準(zhǔn)單糖的圖譜進(jìn)行對比分析。

1.7? 形貌特征分析

掃描電子顯微鏡是一種觀察大分子物質(zhì)形貌特征的重要工具，通過捕獲樣品表面的電子信號形成圖像，成像清晰，立體效果好[14]。參照張淑杰等[15]的方法，采用掃描電鏡對CSP90的形貌特征進(jìn)行分析。將凍干的CSP90樣品用導(dǎo)電膠帶粘在樣品臺(tái)上，并鍍上一層金粉。通過掃描電子顯微鏡在15 kV加速電壓下捕獲圖像，放大倍數(shù)選擇400、800和1 600倍，選取適當(dāng)?shù)囊曇斑M(jìn)行拍照記錄。

1.8? DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力的試驗(yàn)根據(jù)Wang等[16]的方法，稍做改動(dòng)。分別配制0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg·mL-1濃度的VC溶液及CSP90樣品溶液，0.1 mmol·L-1的DPPH-無水乙醇溶液。配置樣品組A1為1 mL CSP90+1 mL DPPH-乙醇溶液，A2為1 mL CSP90+1 mL無水乙醇溶液;對照組A1為1 mL VC+1 mL DPPH-乙醇溶液，A2為1 mL VC+1 mL無水乙醇溶液;空白組A0為1 mL去離子水+1 mL DPPH-乙醇溶液。將各組溶液混合均勻后，室溫暗處理30 min，用紫外分光光度計(jì)在517 nm處測定吸光度。實(shí)驗(yàn)平行測定3次，記錄數(shù)據(jù)。通過Graphpad軟件（Prism 7.0）計(jì)算半數(shù)清除率（IC50）。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式：RCSP90=[A0-（A1-A2）]/A0×100%;RVC=[A0-（A1-A2）]/A0×100%。

2 結(jié)果

2.1? CSP90中糖含量和蛋白含量

以柳葉白前藥材重量（500 g）為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算CSP90的提取率為5.56%。CSP90的糖含量測定通過苯酚-硫酸法進(jìn)行顯色，紫外分光光度計(jì)測定吸光度，對3次重復(fù)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算出CSP90的糖含量為94.7%，說明提取的多糖純度較高。通過考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白質(zhì)的含量，對3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算出CSP90中蛋白質(zhì)含量為2.86%。

2.2? CSP90中核酸與蛋白質(zhì)殘留檢測

通過紫外分光光度儀對0.2 mg·mL-1的CSP90溶液在200～400 nm進(jìn)行全波長掃描，如圖1所示，在260 nm處無明顯吸收，說明核酸含量接近于0;在280 nm處有微弱吸收，說明有少量蛋白質(zhì)殘存，這與蛋白質(zhì)含量計(jì)算結(jié)果也相符合。

2.3? CSP90的單糖組成檢測

通過HPLC對CSP90進(jìn)行單糖分析，與標(biāo)準(zhǔn)單糖的色譜圖對比，如圖2所示，根據(jù)出峰時(shí)間和峰面積計(jì)算出CSP90含有的單糖及摩爾比例為甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=0.03∶0.02∶0.04∶1.00∶0.12∶0.37。CSP90中葡萄糖的含量最高，占總糖的比例達(dá)到65.81%;其次是阿拉伯糖的含量，占20.27%;半乳糖、半乳糖醛酸、甘露糖、鼠李糖含量分別為7.63%、2.88%、1.97%、1.43%。

2.4? CSP90的形貌特征檢測

通過掃描電鏡觀察CSP90的形態(tài)特征和微觀結(jié)構(gòu)。如圖3A、3B所示，在放大400倍下，發(fā)現(xiàn)部分CSP90微觀結(jié)構(gòu)的聚集狀態(tài)呈凹凸不平的不規(guī)則薄碎片狀結(jié)構(gòu)，邊緣不平整，而部分結(jié)構(gòu)呈光滑連綿的薄片，伴有一些分支。在放大800倍下（圖3C），觀察到部分多糖呈光滑平整的薄片形狀同時(shí)可見分支呈長桿柱狀。繼續(xù)放大1 600倍下（圖3D），觀察到部分多糖表面厚度不均，有凹陷、波峰，可見圓球狀顆粒。

2.5? CSP90體外抗氧化能力檢測

對CSP90進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)，以VC為陽性對照，設(shè)置0.05～1.6 mg·mL-1濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4所示，CSP90具有一定的DPPH自由基清除能力，并且隨著濃度的增加，清除能力有所增強(qiáng)。隨著濃度從0.05 mg·mL-1增加到0.8 mg·mL-1，CSP90對DPPH自由基的清除率從46.5%增加到93.4%。在1.6 mg·mL-1的濃度下，CSP90與VC對DPPH自由基的清除率分別為96.5%和97.6%，表明在此濃度下兩者清除能力的差別很小。通過Graphpad軟件計(jì)算IC50值為0.083 mg·mL-1，CSP90對DPPH自由基具有良好的清除作用。

3 討論

通過掃描電鏡觀察CSP90的微觀結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分多糖呈光滑平整的薄片狀，說明分子之間作用較強(qiáng)，結(jié)合緊密[17-18]。Shi等[19]從大葉冬青中純化出一種均一多糖（ILP50-2），通過掃描電鏡進(jìn)一步觀察微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ILP50-2在聚合狀態(tài)下呈分支不規(guī)則網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表面不平整，表明多糖具有無定形結(jié)構(gòu)，在放大400倍和800倍下觀察，發(fā)現(xiàn)ILP50-2厚度不均勻，呈凹陷和凸起，推測可能是ILP50-2的分支結(jié)構(gòu)引起的。觀察IL50-2和CSP90的掃描電鏡圖譜有部分相似，推測CSP90中的部分多糖也存在分支結(jié)構(gòu)。

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，在乙醇溶液中呈紫色，在此體系中加入抗氧化劑后，DPPH自由基可以很容易地接受抗氧化劑提供的氫原子，形成穩(wěn)定的分子后紫色溶液就會(huì)變成無色或淺黃色[16，20]。初步的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CSP90的IC50值為0.083 mg·mL-1，在較低的濃度下就有較好的DPPH自由基清除活性，有望被開發(fā)為一種天然的抗氧化劑。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為更深入的研究柳葉白前多糖的結(jié)構(gòu)和活性提供了理論依據(jù)。

水提醇沉法提取多糖具有提取液澄明，操作簡單，成本低，儀器設(shè)備常見的優(yōu)點(diǎn)[21]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了越來越多提取多糖的新型方法，包括微波萃取法，加速溶劑萃取法，生物酶解法等等[21-23]。相比于水提醇沉法，新型提取法具有提取效率高，提取效果好的優(yōu)點(diǎn)[21]。期望今后的實(shí)驗(yàn)可以采用更多新型方法提取得到柳葉白前多糖，對比水提醇沉法進(jìn)行分析，繼續(xù)優(yōu)化柳葉白前多糖的提取工藝。

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