呂邵娃 邱茜 楊志偉 李慶華 王秋紅 匡海學(xué)

〔摘要〕 目的 研究婦康栓對(duì)婦科疾病致病菌的抑菌活性及對(duì)厭氧消化鏈球菌生物膜的影響。方法 采用濾紙片法測(cè)量供試藥液作用于菌株的抑菌圈直徑;采用倍比稀釋法檢測(cè)菌株的最小抑菌濃度（minimum bacteriostatic concentration， MIC）及最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration， MBC）;采用熒光染色法對(duì)厭氧消化鏈球菌生物膜的形成抑制情況進(jìn)行紅綠熒光定量分析。結(jié)果 婦康栓對(duì)白色念珠菌、新生隱球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、厭氧消化鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、紅色毛癬菌及陰道加德納氏菌均有不同程度的抑制作用，尤其是對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制作用強(qiáng)于其他菌株。抑菌結(jié)果表明藥物對(duì)厭氧消化鏈球菌的抑制作用最強(qiáng)。在熒光顯微鏡下可清楚觀察，與對(duì)照組相比，各給藥組綠色熒光百分比減少，生物膜總量降低（P<0.05）。結(jié)論 婦康栓具有抑菌活性，特別是對(duì)厭氧消化鏈球菌具有較強(qiáng)的抑制作用，并具有破壞生物膜的能力。表明婦康栓對(duì)婦科疾病主要致病菌有抑制作用，為進(jìn)一步臨床用藥提供理論指導(dǎo)。

〔關(guān)鍵詞〕 婦康栓;體外抑菌;婦科炎癥;厭氧消化鏈球菌;生物膜

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.06.004

Study on Antibacterial Activity in Vitro and Effect of Fukang Suppository on Bacterial Biofilm

LV Shaowa1，2， QIU Qian1，2， YANG Zhiwei3， LI Qinghua3， WANG Qiuhong1，4， KUANG Haixue1，2*

（1. Key Laboratory of Basic and Applied Research of Northern Medicine， Ministry of Education， Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine， Harbin， Heilongjiang 150040， China; 2. Key Laboratory of Basic Research on Pharmacodynamic Substances of Traditional Chinese Medicine and Natural Medicine， Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine， Harbin， Heilongjiang 150040， China; 3. Heilongjiang Province Rich East Pharmaceutical Company Limited， Mudanjiang

157000， Heilongjiang， China; 4. College of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou， GuangDong 510000， China）

〔Abstract〕 Objective To study the antibacterial activity of Fukang Suppository on pathogenic bacteria of gynecological diseases and its effect on the biofilm of anaerobic digestion streptococcus. Methods The diameters of inhibition zone of test solution to bacteria was measured by the paper filtering method. The minimum bacteriostatic concentration （MIC） and minimum bactericidal

concentration （MBC） of Fukang Suppository were determined by dilution method. The inhibition of biofilm formation in anaerobic digestion streptococcus was quantitatively analyzed by fluorescence staining. Results Fukang Suppository had different

degree of inhibitory effect on candida albicans， cryptococcus neoforme， staphylococcus aureus， escherichia coli， streptococcus anaerobic digestion， streptococcus hemolytis-β， trichophyton rubrum and Gardnerella vaginalis. The inhibitory effect of the drug on the gram positive bacteria was the strongest. The results of bacteriostasis showed that the drug had the strongest inhibitory effect on anaerobic digestion streptococcus. It can be observed clearly under fluorescence microscope， compared with the control group， the percentage of green fluorescence and the total amount of biofilm in each group were decreased （P<0.05）. Conclusion Fukang Suppository had antibacterial activity， especially against the anaerobic digestion streptococcus， and had the ability to destroy the biofilm. It is proved that Fukang Suppository has an inhibitory effect on the main pathogenic bacteria of gynecological diseases， which provides theoretical guidance for further clinical medication.

〔Keywords〕 Fukang Suppository; inhibition in vitro; gynecological inflammation; anaerobic digestion streptococcus; biological membrane

婦康栓是以核桃楸（Juglans mandshurica Maxim.）的成熟種仁采用干餾法得到的餾油為主藥，硬脂酸聚烴氧40酯為基質(zhì)，混合制成黑褐色鴨嘴形栓劑。核桃楸中含有醌、黃酮、糖苷、鞣質(zhì)和三萜類化合物[1]，具有抗腫瘤、抗氧化、殺菌和止痛等多種作用[2-3]。從核桃楸外果皮提取分離出的活性成分對(duì)多種病原微生物有抑制作用，然而關(guān)于核桃楸成熟種仁的研究報(bào)道較少[4]。婦康栓作為陰道外用藥用于治療赤白帶下、少腹墜痛、子宮糜爛等多種常見婦科疾病，但其是否通過抑菌起到對(duì)宮頸炎、陰道炎及盆腔炎的治療作用尚不清楚。本文通過研究婦康栓對(duì)婦科疾病常見致病菌的體外抗菌活性，旨在為其臨床合理應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料

1.1? 藥品

婦康栓（批號(hào)：1804003，黑龍江省富東制藥有限公司）;鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液（批號(hào)：20180211，廣東彼迪藥業(yè)有限公司）;氟康唑氯化鈉注射液（批號(hào)：K180805012，四川科倫藥業(yè)股份有限公司）;甲硝唑氯化鈉注射液（批號(hào)：1812035M，安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司）;青霉素V鉀片（批號(hào)：E190908，浙江亞太藥業(yè)股份有限公司）;硬脂酸聚烴氧40酯（批號(hào)：1804003，黑龍江省富東制藥有限公司）;吖啶橙（批號(hào)：A8120，北京索來寶科技有限公司）;溴化乙錠（批號(hào)：E1021，北京索來寶科技有限公司）;氯化三苯四氮唑（批號(hào)：M2128-1G，美國(guó)Sigma公司）。

1.2? 菌株

白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株（批號(hào)：186382）、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（批號(hào)：310011）、新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株（批號(hào)：337347）、大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)株（批號(hào)：125988）、陰道加德納氏菌標(biāo)準(zhǔn)株（批號(hào)：337545）、乙型溶血性鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株（批號(hào)：336670）、厭氧消化鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株（批號(hào)：337100）、紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株（批號(hào)：340195）均購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.3? 培養(yǎng)基

改良馬?。≒DA）培養(yǎng)基（批號(hào)：20171026）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)：20130730）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20130731）均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;YM培養(yǎng)基（批號(hào)：HB0297）購(gòu)自海博生物技術(shù)有限公司;哥倫比亞血平板培養(yǎng)基（批號(hào)：20191203）購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.4? 儀器

SHINVA型手提式壓力蒸汽滅菌器（東新華醫(yī)療器械股份有限公司）;HH-400型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）;JA2003型電子天平（上海天平儀器有限公司）;CO2CELL 50L型CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)MMM公司）;HD-650型超凈工作臺(tái)（吳江市偉峰有限公司）;KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;UTB190型激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1? 試劑的制備

用分析天平稱量一定量的婦康栓加熱融解后用無菌水配制成含婦康栓質(zhì)量濃度分別為1.66、0.83、0.41、0.20、0.10、0.05、0.02 g/mL的藥液作為供試藥液，相當(dāng)于含核桃楸餾油200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.12 mg/mL;配制氟康唑?qū)φ掌啡芤嘿|(zhì)量濃度為0.20 mg/mL作為白色念珠菌、新生隱球菌的陽性對(duì)照藥物;配制甲硝唑?qū)φ掌啡芤嘿|(zhì)量濃度為0.10 mg/mL作為陰道加德納氏菌、紅色毛癬菌的陽性對(duì)照藥物;配制左氧氟沙星對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL作為金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌的陽性對(duì)照藥物;配制青霉素對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL作為厭氧消化鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌的陽性對(duì)照藥物。配制1.46 g/mL硬脂酸聚烴氧40酯水溶液作陰性對(duì)照藥物。

2.2? 菌種活化及菌懸液配制

在無菌條件下，將安瓿管表面消毒后在安全柜中打開，用酒精燈灼燒頂部后迅速滴上無菌水使之破裂，隨后用鑷子將其敲碎。移取0.5 mL無菌水加入凍干管中，充分溶解后直接吸取菌液200 μL到相對(duì)應(yīng)的平板上均勻涂布，并將平板置于各菌種對(duì)應(yīng)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24～48 h。其中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，紅色毛癬菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，厭氧消化鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、陰道加德納氏菌用哥倫比亞血平板培養(yǎng)，新生隱球菌、白色念珠菌用YM培養(yǎng)基培養(yǎng)。取過夜培養(yǎng)后平板上的菌種，用無菌生理鹽水配制菌液，并與標(biāo)準(zhǔn)的0.5麥?zhǔn)媳葷嵋哼M(jìn)行比濁，制成含1×106～1×107 cfu/mL的菌懸液。

2.3? 婦康栓體外抑菌活性的測(cè)定

2.3.1? 供試菌株的抑菌圈測(cè)定? 滅菌后，將直徑5 mm圓形濾紙片分別放在藥液（氟康唑溶液、左氧氟沙星溶液、青霉素溶液、甲硝唑溶液、婦康栓溶液、硬脂酸聚烴氧40酯水溶液）中浸泡2 h，烘干備用。取200 μL上述8種供試菌菌懸液接種于培養(yǎng)基表面，涂布均勻，制成含菌平板。然后用已浸過藥液的藥敏濾紙片緊貼在含菌培養(yǎng)皿上，各濾紙間距離均等[5]。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑D，并觀察抑菌圈的透明程度和邊緣整齊程度。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，每次3個(gè)平行，數(shù)據(jù)取平均值。

2.3.2? 最小抑菌濃度的測(cè)定? 取96孔聚苯乙烯板，各孔加入100 μL液體培養(yǎng)基、100 μL菌懸液，除空白組加入無菌水溶液以及陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組加入相對(duì)應(yīng)的陽性藥液、硬脂酸聚烴氧40酯水溶液外，其余各組分別加入已配好的不同稀釋度供試藥液100 μL。每個(gè)稀釋度對(duì)應(yīng)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。置于各菌種對(duì)應(yīng)培養(yǎng)條件下恒溫培養(yǎng)18 h后取出。不同菌種重復(fù)以上操作。肉眼借助倒置顯微鏡觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，無細(xì)菌生長(zhǎng)孔的最低藥物濃度為MIC[6]。

2.3.3? 最殺菌濃度（minimum bacteriostatic concentration， MBC）的測(cè)定? 將藥品有效抑菌濃度的藥液和對(duì)照組對(duì)應(yīng)的濃度藥液100 μL移種至不含藥物的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，以無菌載玻棒均勻涂布，標(biāo)記平板，置于菌種適宜的培養(yǎng)條件下恒溫倒置培養(yǎng)18 h后取出[7]。觀察菌落并計(jì)數(shù);以菌落數(shù)少于5個(gè)（2個(gè)復(fù)孔的平均值）的藥物最低質(zhì)量濃度為MBC。

2.4? 藥物對(duì)細(xì)菌生物膜影響

取厭氧消化鏈球菌菌懸液100 μL加入肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取1 mL培養(yǎng)基加入帶有滅菌蓋玻片的6孔板中37 ℃搖床上震蕩過夜培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)基，PBS溶液沖洗，分別加入濃度為1.66、0.83、0.41、0.20、0.10、0.05、0.02 g/mL的婦康栓藥液1 mL，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，過夜培養(yǎng)。吸去各孔中的藥液，PBS溶液分別沖洗，每次間隔1 min，棄去孔中液體。在暗室吖啶橙（AO）和溴化乙錠（EB）熒光染色液按1∶1混合染液滴加在長(zhǎng)有厭氧消化鏈球菌生物膜的蓋玻片表面，暗室恒溫孵育15 min，繼續(xù)分別用 PBS溶液沖洗各孔，每次沖洗時(shí)間為1 min，棄去多余熒光染色液。AO熒光染色液可以透過正常菌株胞膜，染活菌株細(xì)胞核，使其發(fā)出均勻且明亮的綠色熒光。同時(shí)，凋亡菌株呈黃綠色熒光或呈黃綠色碎片顆粒。EB熒光染色液可以透過胞膜受損的菌株，嵌入死菌株核DNA，使其產(chǎn)生紅色熒光，二者重疊可呈橘黃色熒光，未被染色的空隙顯示黑色[8]，正常生長(zhǎng)的細(xì)菌能黏附于物體表面相互聚集、成塊而形成生物膜。視野可清楚觀察分辨出正常、凋亡或壞死的菌株，綠色熒光面積所占總熒光面積百分比可以表示生物膜中活菌比例，用來判斷生物膜形成量[9]。對(duì)染色菌株進(jìn)行紅綠熒光定量分析，從而分辨出存活菌株和壞死菌株及藥物作用于菌株后對(duì)生物膜的破壞程度。

2.5? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組之間的數(shù)據(jù)差異比較均采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 供試藥液對(duì)供試菌種抑菌圈的影響

藥物組對(duì)各菌的抑制能力為厭氧消化鏈球菌>乙型溶血性鏈球菌>金黃色葡萄球菌>新生隱球菌>白色念珠菌>大腸埃希氏菌>陰道加德納氏菌>紅色毛癬菌。陰性對(duì)照無抑菌作用，表明其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有干擾。

3.2? 婦康栓對(duì)供試菌株的MIC和MBC的影響

藥物對(duì)厭氧消化鏈球菌的MIC及MBC均最低，分別為0.05 g/mL和0.10 g/mL。表明藥物對(duì)厭氧消化鏈球菌具有顯著的抑制效果。金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的MIC和MBC值一致，抑制效果僅次厭氧消化鏈球菌。含不同濃度梯度的藥物液體培養(yǎng)基中有無細(xì)菌生長(zhǎng)見表1。婦康栓對(duì)供試菌株的藥物MIC和MBC見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明婦康栓對(duì)以上菌株在體外均有抑制活性、尤其是對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制作用強(qiáng)于其他菌株。綜合上述結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇以厭氧消化鏈球菌為試驗(yàn)菌種。

3.3? 婦康栓對(duì)細(xì)菌的存活狀態(tài)及其生物膜的影響

與對(duì)照組相比，各給藥組活菌數(shù)量減少，死菌數(shù)量增多。與低濃度藥物組相比，高濃度藥物組活菌數(shù)量減少。在婦康栓作用下，生物膜進(jìn)一步形成量均顯著低于對(duì)照組，并隨著藥物濃度增加，生物膜形成量越降低。與對(duì)照組比較，0.10、0.20、0.41 g·mL-1藥物組生物膜形成量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），0.83、1.66 g·mL-1藥物組生物膜形成量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖2和圖3。

4 討論

宮頸炎、陰道炎及盆腔炎為女性婦科病中的高發(fā)疾病，這類疾病主要原因是陰道微生態(tài)環(huán)境菌群失衡，改變了生殖道內(nèi)的酸堿度環(huán)境，特別是病原菌代替乳酸桿菌等有益菌成為優(yōu)勢(shì)菌種快速生長(zhǎng)，致病菌大量繁殖，感染女性生殖道引發(fā)炎癥[10]。女性不僅會(huì)有外陰或陰中騷癢，甚者疼痛灼熱、潰爛、白帶量多或色黃腥臭等不適癥狀，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致不孕、流產(chǎn)、早產(chǎn)、新生兒先天發(fā)育畸形等一系列嚴(yán)重后果，危害女性健康和家庭和睦[11-12]。因此，及時(shí)地合理治療婦科疾病尤為重要。Itzhak B[13]總結(jié)了女性生殖道感染主要是由消化鏈球菌屬和普雷沃菌屬的厭氧菌引起。血液為厭氧菌生長(zhǎng)提供了良好環(huán)境，使產(chǎn)褥期和月經(jīng)期的女性加大了細(xì)菌性陰道病發(fā)生的危險(xiǎn)[14]?；瘜W(xué)藥物治療細(xì)菌性陰道炎，雖然可在短期內(nèi)對(duì)所有厭氧菌起到理想的殺滅或抑制效果，但耐藥性和復(fù)發(fā)率高[15]的問題尚未解決。婦康栓在這方面卻有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其可以破壞厭氧菌生物膜的進(jìn)一步形成，避開抗生素的傳統(tǒng)作用靶位，防止耐藥性的產(chǎn)生[16]，在一定程度上能減少用藥后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)婦康栓對(duì)厭氧消化鏈球菌具有較強(qiáng)的抑制活性，這為臨床上使用婦康栓治療因厭氧消化鏈球菌感染引發(fā)的細(xì)菌性陰道炎、盆腔或?qū)m頸病變等常見婦科病提供了科學(xué)依據(jù)。

婦康栓具有使用方便、直達(dá)病灶、起效時(shí)間短、降低由于藥物作用而帶來的肝損害及胃腸道不適的不良反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)[17]。雖然婦康栓的有效成分是核桃楸餾油，其水溶性差，較難分散在陰道體液環(huán)境中，是藥物遞送系統(tǒng)的一大挑戰(zhàn)。硬脂酸聚烴氧40酯提高了核桃楸餾油在體液中的溶解度，它的熔點(diǎn)是46～51 ℃，使婦康栓在陰道中緩緩溶化釋藥，延長(zhǎng)栓劑的滯留時(shí)間，促進(jìn)了主藥的吸收，為促進(jìn)陰道上皮細(xì)胞吸收和提高生物利用度提供了可能[18]。本文對(duì)婦康栓的體外抗菌活性進(jìn)行了初探，從婦科感染常見病原菌的角度研究了其對(duì)致病菌的抑菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)厭氧消化鏈球菌抑制效果最強(qiáng)，并且可通過破壞厭氧消化鏈球菌生物膜達(dá)到抑菌和殺菌作用，但其有效成分和抗菌機(jī)制還有待進(jìn)一步深化研究，后續(xù)可以從明確化學(xué)成分和檢測(cè)細(xì)胞周期、耐藥基因水平、細(xì)胞膜完整性及菌體蛋白質(zhì)等方面對(duì)其抗菌機(jī)制進(jìn)行深入研究。

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