雷華娟 滕永杰 稅林輝 周寧博 陳夢 黃若茹 劉柏炎

〔摘要〕 目的 觀察七氟烷對老年大鼠認知功能和海馬突觸可塑性的影響。方法 30只老年SD大鼠隨機分為對照組（C組）和七氟烷組（S組），每組15只，S組暴露于3%七氟烷、30% O2、5% CO2環(huán)境，C組暴露于30% O2和5% CO2環(huán)境，每天干預(yù)2 h，連續(xù)3 d。于干預(yù)結(jié)束前1 h（T0）、干預(yù)停止（T1）、干預(yù)停止后1 h（T2）、干預(yù)停止后2 h（T3）測試大鼠大腦中動脈收縮期最大流速（peak systolic velocity， PSV）、舒張末期血流速度（end diastolic velocity， EDV）和阻力指數(shù)（resistance index， RI）的變化，觀察大腦中動脈血流動力學(xué)情況;于干預(yù)停止后24 h（T4）、48 h（T5）、72 h（T6）應(yīng)用水迷宮和曠場實驗測試大鼠的認知功能和情緒狀態(tài);并用透視電子顯微鏡觀察大鼠的突觸面積和囊泡面積。結(jié)果 大腦中動脈血流動力學(xué)顯示，與C組比較，S組T0大腦中動脈血管RI、PSV、EDV降低，T1以后大腦中動脈血流阻力逐漸恢復(fù);七氟烷暴露后3 d，與C組比較，S組T4、T5潛伏期增加，尋找平臺時間延長，穿梭次數(shù)減少（P<0.05）;曠場實驗顯示，七氟烷干預(yù)后，與C組比較，S組T4、T5周圍格活動增加，中央格活動時間減少，直立次數(shù)增加（P<0.05）;透射電子顯微鏡顯示，與C組比較，S組大鼠的突觸面積、囊泡面積減少（P<0.05）。結(jié)論 七氟烷暴露可擴張大腦中動脈，擴張血管的作用很快就消失;重復(fù)暴露于七氟烷的SD老年大鼠可出現(xiàn)認知功能損害，并容易發(fā)生焦慮;七氟烷通過改變神經(jīng)元突觸的可塑性而損傷SD老年大鼠海馬的認知功能。

〔關(guān)鍵詞〕 七氟烷;老年大鼠;認知功能;海馬神經(jīng)元;突觸可塑性;大腦中動脈;血流動力學(xué)

〔中圖分類號〕R277.7;R614? ? ? ? 〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.06.005

Effects of Sevoflurane on Cognitive Function and Hippocampus Synaptic Plasticity in Aged Rats

LEI Huajuan1，2， TENG Yongjie1， SHUI Linhui1， ZHOU Ningbo1， CHEN Meng1， HUANG Ruoru2， LIU Boyan2*

（1. Department of Anesthesiology， The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the sevoflurane intervention on cognitive function and synaptic plasticity in hippocampus of aged rats. Methods 30 SD aged rats were randomly divided into the control group （group C） and sevoflurane group （group S）， with 15 rats in each group. Group S was exposed to 3% sevoflurane， 30% oxygen， 5% CO2， group C was exposed to 30% oxygen， 5% CO2 for 2 hours， 3 days in total. The peak systolic velocity （PSV）， end diastolic velocity （EDV）， resistance index （RI） were measure to test middle cerebral artery velocity on 1 hour before the end of sevoflurane intervention （T0）， immediate end of sevoflurane intervention （T1）， 1 hour after the end of sevoflurane intervention （T2）， 2 hour after the end of sevoflurane intervention （T3）. The cognitive function and emotional state were measured by water maze test and open field test on 24 hours （T4）， 48 hours （T5） and 72 hours （T6） after the end of sevoflurane intervention， and hippocampus synaptic vesicles and area was measured by transmission electron microscopy. Results Hemodynamics of the middle cerebral artery showed that， compared with group C， RI， PSV and EDV of middle cerebral artery in group S decreased on T0， middle cerebral artery resistance gradually restored after T1. Compared with group C， the latency on T4 and T5 increased， platform searching time increased， the crossing times reduced in group S after 3 days of sevoflurane exposure （P<0.05）. Open field experiments showed that， compared with group C， the peripheral lattice activity time increased， central lattice activity time decreased， the number of standing time was increased on T4 and T5 in group S after 3 days of sevoflurane exposure （P<0.05）. Transmission electron microscopy showed hippocampus synaptic area， vesicle size decreased in group S compared with group C （P<0.05 ）. Conclusion Exposure to sevoflurane can dilate the middle cerebral artery and the vessel dilating effect soon disappeared. The repeated exposure to sevoflurane can impair cognitive function on aged SD rats， and the aged SD rats were prone to anxiety. Sevoflurane could impair cognitive function of aged SD rats by altering the synaptic plasticity on hippocampal neurons.

〔Keywords〕 sevoflurane; aged rat; cognitive function; hippocampal neuron; synapse plasticity; middle cerebral artery;

hemodynamics

海馬是學(xué)習(xí)、記憶等認知功能的高級中樞，海馬錐體神經(jīng)元密集，結(jié)構(gòu)相對較簡單，也是整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對缺血、缺氧、炎癥等各種損傷耐受能力最差的部位之一[1]。吸入麻醉藥對海馬神經(jīng)的損傷作用導(dǎo)致術(shù)后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction， POCD）已經(jīng)在全球范圍內(nèi)得到廣泛的重視[2]。目前，七氟烷暴露導(dǎo)致海馬損傷的作用機制尚未研究清楚。炎癥[3]、鈣超載[4]、凋亡[5]、離子超載和鐵死亡[6]等是七氟烷致海馬損傷的可能機制。突觸是學(xué)習(xí)、記憶的基礎(chǔ)，神經(jīng)元突觸的可塑性包括神經(jīng)元的突起和突觸數(shù)量、形態(tài)及功能的變化，是神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育、神經(jīng)元損傷與修復(fù)、認知行為和學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[7]。七氟烷致海馬損傷最終是否引起突觸的減少或者丟失，導(dǎo)致長時程增強（long term potential， LTP）改變，值得進一步探究。故本研究的目的在于觀察七氟烷干預(yù)對老年SD大鼠行為學(xué)、大腦中動脈血流動力學(xué)和突觸可塑性的影響，以探究七氟烷致海馬損傷導(dǎo)致認知功能改變的可能機制，為臨床防治七氟烷引起的腦損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 動物

22月齡SPF級SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量（525.74±14.72） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0005。

1.2? 主要試劑與儀器

七氟烷（批號：16043031，江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司）。Philips CX 50彩色多普勒超聲診斷儀（荷蘭飛利浦公司）;TG22-WS 臺式高速離心機（長沙湘銳離心機有限公司）;DSX100奧林巴斯光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）;Tecnai G2 Spirit賽默飛桌面型透射電子顯微鏡（美國賽默飛公司）;GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（長沙湘銳離心機有限公司）;Centrifuge 5415R型小型冷凍離心機（德國Eppendorf公司）;Smart 3.0 Morris水迷宮設(shè)備（西班牙Panlab公司）;Intellivue MP50血氧飽和度探測儀（荷蘭飛利浦公司）;Plus Vamous麻醉氣體檢測儀（德國Dr?ger公司）。

2 方法

2.1? 動物分組與給藥

30只健康老年SD大鼠在正常條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，不限制進水，12 h光照和12 h黑暗處理，在室溫25 ℃，濕度為60%～80%的環(huán)境下自由飲食和活動。按照隨機數(shù)字法隨機分成對照組（C組）、七氟烷暴露組（S組），每組15只。將大鼠置于麻醉箱中，一個管道進氣，一個管道出氣，S組調(diào)節(jié)七氟烷揮發(fā)罐，吸入3%七氟烷、30% O2和5% CO2 2 h，連續(xù)3 d[8]，用麻醉氣體檢測儀連續(xù)監(jiān)測麻醉箱內(nèi)的氣體。密封箱內(nèi)的溫度用加熱墊保持在（30±1） ℃，7 d后進行水迷宮訓(xùn)練5 d，然后對大鼠認知功能進行測試，有認知功能障礙的大鼠剔出實驗。C組在30% O2和5% CO2環(huán)境下每天干預(yù)2 h，連續(xù)3 d。干預(yù)時均用血氧飽和度探測儀監(jiān)護大鼠的心率和SPO2。SPO2<90%，持續(xù)超過5 min則剔出實驗。干預(yù)結(jié)束后進行30 min SPO2和心率的監(jiān)測。

2.2? 彩色多普勒超聲檢測大鼠大腦中動脈血流動力學(xué)情況

大鼠固定在夾板上，充分暴露囟門，以前囟為聲窗，從冠狀切面和矢狀切面連續(xù)扇形掃描，矢狀切面檢查時將探頭左右移動，使用彩色多普勒超聲顯示大腦動脈環(huán)，應(yīng)用Philips CX 50脈沖多普勒測量S5-8探頭，頻譜10 MHz，測試七氟烷干預(yù)結(jié)束前2 h（T0）、七氟烷吸入結(jié)束（T1）、七氟烷吸入結(jié)束后1 h （T2）、七氟烷吸入結(jié)束后2 h（T3）大腦中動脈的收縮期最大流速（peak systolic velocity， PSV）、舒張末期血流速度（end diastolic velocity， EDV）和阻力指數(shù)（resistance index， RI），超聲多普勒取樣線與大腦中動脈血流夾角≤30°，所有參數(shù)測量3次取平均值。

2.3? 水迷宮測試評估大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力

七氟烷干預(yù)前5 d進行連續(xù)訓(xùn)練，水迷宮是直徑為180 cm，高為50 cm的圓形水池，人為將水池分為4個象限，并在左上象限中放置平臺，平臺直徑為10 cm，位于水面下1 cm。分別在4個不同的象限連續(xù)訓(xùn)練大鼠5 d，并進行獲得性訓(xùn)練、探查訓(xùn)練、對位訓(xùn)練、對位探查訓(xùn)練[9]。訓(xùn)練5 d后，進行七氟烷干預(yù)，干預(yù)結(jié)束后24 h（T4）、48 h（T5）、72 h（T6）進行水迷宮測試。最終使用數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄潛伏期、平臺時間和穿梭次數(shù)來監(jiān)測大鼠的空間記憶和工作記憶能力。

2.4? 曠場實驗檢測大鼠的自主活動能力和焦慮狀態(tài)

曠場實驗所用測試箱為底邊平均分為9格，長、寬、高分別為100 cm×l00 cm×40 cm的黑色敞箱，總測試時間為5 min，固定測試時間為早上10點。測試前將大鼠在黑暗、安靜的測試房適應(yīng)1 h，每次測試1只，開始從中間格子放入大鼠并由數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄每5 min內(nèi)的直立次數(shù)、周圍格及中央格停留的時間，每只大鼠測試結(jié)束后用75%酒精擦拭場地[10]。

2.5? 電鏡檢測大鼠海馬神經(jīng)元突觸及囊泡面積

完成行為學(xué)測試后，用10%水合氯醛（0.4 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，用100 mL 4 ℃生理鹽水經(jīng)左心室灌注，斷頭取大腦海馬。然后用2.5%戊二醛固定海馬，PBS（pH 7.3）漂洗、固定，漂洗、脫水，并將海馬滲透過夜包埋，最后將海馬組織切成50 nm超薄切片，整個切片上下左右分別選取2個點進行攝片。電鏡攝片面積為5.6 μm×6.0 μm，即為觀察1.68 μm2的突觸數(shù)目，計算規(guī)定范圍內(nèi)海馬神經(jīng)元突觸囊泡面積和突觸面積[11]。

2.6? 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用“x±s”表示，采用單因素方差分析（One way ANOVA）檢驗，方差齊性時，組間兩兩比較采用LSD檢測;方差不齊時，采用Tamhans T2檢測。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 七氟烷干預(yù)對大鼠大腦中動脈血流動力學(xué)的影響

與C組比較，S組在T0期的PSV、EDV、RI明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;S組在T1、T2、T3期的PSV、EDV、RI逐漸恢復(fù)，與C組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3.2? 七氟烷干預(yù)對大鼠水迷宮測試的影響

S組在T4、T5平均潛伏期明顯長于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;且S組在T4、T5尋找平臺的時間增加并長于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;S組在T4、T5平均穿梭次數(shù)明顯少于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;在T6期，兩組之間平均潛伏期、平臺時間和平均穿梭次數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

3.3? 七氟烷干預(yù)對大鼠曠場實驗的影響

七氟烷干預(yù)后，S組大鼠T4、T5期直立次數(shù)明顯多于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;S組在T4、T5期周圍格活動時間明顯長于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;S組在在T4、T5期中央格活動時間明顯短于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;S組在T6期的直立次數(shù)、周圍格活動時間和中央格活動時間逐漸恢復(fù)，與C組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

3.4? 七氟烷干預(yù)對大鼠海馬神經(jīng)元突觸及囊泡的影響

與C組比較，S組可見突觸內(nèi)遞質(zhì)見減少，遞質(zhì)顏色變淺，突觸面積與囊泡面積減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4、圖1。

4 討論

吸入麻醉劑七氟烷已有40多年的歷史，因為其較低的血液/氣體分配系數(shù)（0.69）及較高的脂肪溶解度，可以急劇升高肺泡濃度和快速誘導(dǎo)麻醉;與地氟烷相反，七氟烷的肺泡攝取速度比異氟烷和氟烷分別快20%和66%，而且血液中七氟烷的清除速度是氟烷的兩倍[12]?？焖倨鹦Ъ把杆偬K醒的特點使七氟烷廣泛用于臨床麻醉，但是，越來越多的證據(jù)表明七氟烷吸入麻醉會引起腦神經(jīng)損害，七氟烷暴露誘導(dǎo)老化的神經(jīng)元發(fā)生退行性變，最終影響海馬的認知功能，而七氟烷引起認知功能損害的具體機制還未研究清楚[13]。

海馬血供由大腦中動脈供應(yīng)，本研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)吸入七氟烷可改變大腦中動脈血流動力學(xué)參數(shù)。本研究結(jié)果中，S組吸入七氟烷可降低血流阻力指數(shù)PSV、EDV、RI，說明此時血管處于舒張狀態(tài)，停止吸入后七氟烷引起的血管舒張作用消失。而體外膽堿能中間神經(jīng)元培養(yǎng)全細胞膜片鉗記錄也發(fā)現(xiàn)相似的規(guī)律，七氟烷顯著降低膽堿能中間神經(jīng)元的的超極化電流，大幅度抑制動作電位導(dǎo)致血管舒張可能與Na+、Ca+內(nèi)流抑制相關(guān)[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，S組七氟烷反復(fù)吸入3次可以引起SD老年大鼠空間記憶和工作記憶的損傷，大鼠表現(xiàn)為T1、T2水迷宮潛伏期延長，T3潛伏期恢復(fù)正常（P<0.05）。重復(fù)吸入七氟烷可以損害老年大鼠空間記憶和工作記憶導(dǎo)致T1、T2潛伏期和平臺期延長以及穿梭次數(shù)明顯減少（P<0.05）。曠場實驗可以測試大鼠的情緒，老年大鼠七氟烷吸入停止后24 h（T1）、48 h（T2）可表現(xiàn)為周圍格和站立時間延長，情緒表現(xiàn)為焦慮和躁動的出現(xiàn)（P<0.05），這與臨床研究一致說明七氟烷暴露后對神經(jīng)元放電的影響。

海馬神經(jīng)元突觸的可塑性是認知產(chǎn)生的基礎(chǔ)[15]，前期細胞研究發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元暴露于七氟烷可引起α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體1（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor， AMPAR1）蛋白表達減少，并誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元發(fā)生焦亡而損傷海馬神經(jīng)元的突觸可塑性，表現(xiàn)為海馬神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)疏松，細胞突觸變短，軸突延長[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷重復(fù)暴露導(dǎo)致海馬神經(jīng)元突觸面積與囊泡面積減少，這與前期細胞研究結(jié)果一致，說明七氟烷重復(fù)暴露損傷海馬神經(jīng)元突觸可塑性是導(dǎo)致認知功能損害的根本病理生理學(xué)改變。七氟烷通過影響突觸后致密物95和AMPAR損傷海馬神經(jīng)元的短時記憶[17]。炎癥[18]、鈣超載[19]及自噬[20]可能參與七氟烷暴露后海馬神經(jīng)毒性反應(yīng)，七氟烷除了誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元功能性損害以外，可以導(dǎo)致海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)性損傷。[21]七氟烷可促進膠質(zhì)細胞炎性增生，抑制發(fā)育期海馬干細胞分化[22]及老化海馬毒性作用外，七氟烷重復(fù)吸入可導(dǎo)致焦慮發(fā)生，說明七氟烷誘導(dǎo)焦慮發(fā)生與海馬神經(jīng)元突觸的可塑性密切相關(guān)。由此推測，七氟烷重復(fù)吸入對海馬認知的損傷作用是通過影響海馬神經(jīng)元突觸的可塑性而發(fā)揮作用的。以往對七氟烷暴露神經(jīng)元焦亡的機制研究較少，細胞實驗發(fā)現(xiàn)，七氟烷暴露可以觸發(fā)Caspase-8介導(dǎo)GSDME焦亡炎癥而損傷神經(jīng)元的可塑性[16]，而焦亡誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)損傷神經(jīng)元可塑性的具體機制在動物模型上需要進一步驗證。

綜上所述，七氟烷具有快速起效、快速蘇醒，對呼吸、循環(huán)影響小的特點而廣泛的應(yīng)用于臨床。但是，七氟烷麻醉可擴張大腦中動脈，并通過海馬神經(jīng)元突觸面積和囊泡數(shù)量減少損傷海馬神經(jīng)元可塑性而損害SD老年大鼠的認知功能，產(chǎn)生認知障礙、焦慮和躁動情緒，可見，海馬神經(jīng)元突觸的可塑性是七氟烷暴露后海馬的認知功能的損傷機制之一，但是七氟烷麻醉如何影響海馬神經(jīng)元突觸的可塑性的具體分子機制還需要進一步探究，以期待臨床上能更好的應(yīng)用并防治七氟烷麻醉所誘導(dǎo)的海馬認知功能損傷。

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