莫 凡， 李 玲， 韓穎穎， 劉寶林*

（1.上海理工大學(xué) 能源與動(dòng)力工程學(xué)院，上海 200093；2.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

雞胸肉是世界上僅次于豬肉的第二大肉品[1]。具有高蛋白、低脂肪、低熱量和低膽固醇的優(yōu)點(diǎn)[2]，受到很多減肥人士青睞。常溫下，剛屠宰的雞胸肉內(nèi)部的微生物會(huì)快速繁殖，使其腐敗，故及時(shí)的降溫處理十分必要。冷鮮雞胸肉是指將宰殺后的雞胴體經(jīng)過(guò)冷卻處理后，其胴體的溫度在短時(shí)間內(nèi)降至0~4℃范圍內(nèi)，并在后續(xù)加工、流通以及出售階段一直維持此溫度范圍的生鮮肉[3]。在美國(guó)、法國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家，冷鮮肉在肉類(lèi)消費(fèi)中占比很大[4]。冷卻方法主要有風(fēng)冷、水冷、碎冰和真空冷卻。目前，我國(guó)對(duì)肉多采用風(fēng)冷、水冷等方式，可這類(lèi)傳統(tǒng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且不能保證雞胸肉的衛(wèi)生，易增加細(xì)菌的繁殖機(jī)會(huì)[5]。真空冷卻是一種有別于傳統(tǒng)冷卻的迅速冷卻法，具有速度快、均勻性較好、較衛(wèi)生等優(yōu)點(diǎn)。馬志英等曾在熟肉制品研究中發(fā)現(xiàn)，真空冷卻比自然冷卻速度快了20倍以上，比鼓風(fēng)冷卻快了大約12倍[6]。在冷卻后的雞胸肉貯藏期間，優(yōu)勢(shì)腐敗菌的增長(zhǎng)與其肉類(lèi)品質(zhì)有很大關(guān)聯(lián)性。因此研究?jī)?yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)模型非常重要。而傳統(tǒng)的食品微生物學(xué)抽樣檢查法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，結(jié)果滯后。預(yù)測(cè)微生物學(xué)可以通過(guò)雞胸肉中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)模型，準(zhǔn)確地判斷雞胸肉的變質(zhì)情況，具有重要的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 雞胸肉在冷藏期間的菌量、菌種測(cè)定

1.1.1 材料與設(shè)備 材料1：新鮮雞胸肉及已被冷風(fēng)冷卻至5℃的雞胸肉（上海圣華副食品有限公司產(chǎn)品），新鮮雞胸肉買(mǎi)回后用真空冷卻機(jī)快速冷卻至中心為5℃，冷風(fēng)冷卻和真空冷卻的雞胸肉均切成6組（每組10 g），放入無(wú)菌托盤(pán)，置于5℃冰箱貯藏。

材料2：新鮮雞胸肉500 g，真空冷卻至中心為5℃。將其切成10 g的小塊，放置無(wú)菌托盤(pán)上，用PE保鮮膜封口。分別保存在0、5、10、15、20、25℃，分別間隔4、6、8、12、24、48 h測(cè)定假單胞菌的菌落數(shù)量。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、NaCl（分析純）、無(wú)水乙醇：購(gòu)自上海沃凱化學(xué)試劑有限公司；27F、1492R、E517F、E1063R、瓊脂糖、EB染液、Loading Buffer、dNTP、Taq plus DNA Polymerase、Maker：購(gòu)自生物工程上海股份有限公司；實(shí)驗(yàn)采用超純水。

真空冷卻機(jī)：上海理工大學(xué)自制；VD-850型超凈工作臺(tái)、THZ-103B搖床、RM1305069全自動(dòng)高壓滅菌鍋、SCIENTZ-09無(wú)菌均質(zhì)器：上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；BIO-RAD電泳儀：北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；BCD-192KTJ（X）冰箱：青島海爾有限公司產(chǎn)品；LHS-50恒溫培養(yǎng)箱：上海精學(xué)科學(xué)儀器產(chǎn)品；TC1000-G PCR儀：Gene Company Limited基因有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法 微生物培養(yǎng)技術(shù)[7]獲得雞胸肉表面的微生物；菌落巢式PCR-DGGE技術(shù)[8]分析微生物種類(lèi)；當(dāng)菌落總數(shù)、pH、TVB-N值中至少一個(gè)超過(guò)國(guó)標(biāo)，所對(duì)應(yīng)的值為假單胞菌的最小限量。

1.1.3 菌落總數(shù)測(cè)定 參照GB 4789.2—2016《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測(cè)定》[9]測(cè)定，重復(fù)3次。

假單胞菌菌落總數(shù)的測(cè)定：通過(guò)CFC假單胞菌選擇性培養(yǎng)基結(jié)合GB 4789.2—2016《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測(cè)定》[9]測(cè)定，重復(fù)3次。

1.1.4 巢式PCR擴(kuò)增和序列測(cè)序 采用巢式PCR的方法，使用細(xì)菌16SrDNA（通用引物），第一對(duì)引物采用27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′），巢式引物采用E517F（5′-GCCAGCAGCCGCGGTAA-3′）、E1063R（5′-CTCACGRCACGAGCTGACG-3′）進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)后的原液放在5℃冰箱中測(cè)序備用。

北京六合華大基因科技股份有限公司完成PCR原液的測(cè)序，測(cè)序后的拼接結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLASRT相似序列檢索比對(duì)（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov//Blast.cgi）。

1.1.5 pH值的測(cè)定 參照Arashisar等[10]的方法。稱(chēng)取10 g雞胸肉放于無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入90 mL的蒸餾水，用均質(zhì)器拍打1 min，靜置約30 min后過(guò)濾，取50 mL的上層濾液用pH計(jì)測(cè)雞胸肉的pH。

1.1.6 揮發(fā)性氨基氮（TVB-N）值的測(cè)定 取10 g對(duì)應(yīng)的雞胸肉，絞碎攪勻后分別置于不同的錐形瓶中，加入蒸餾水100 mL，振蕩搖勻，浸泡30 min后過(guò)濾，濾液放置冰箱中備用。參照GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[11]測(cè)定，并且每種樣品重復(fù)3次。

1.2 假單胞菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的建立及擬合

1.2.1 真空冷卻雞胸肉中假單胞菌的生長(zhǎng)動(dòng)力模型 （一級(jí)模型） 一級(jí)模型采用經(jīng)驗(yàn)修正的Gompertz模型[12-14]描述微生物數(shù)量與時(shí)間的關(guān)系，Gompertz模型方程式如下：

式中：N（t）為微生物在時(shí)間t時(shí)的對(duì)數(shù)值，（lg（CFU/g））；N0、Nmax為細(xì)胞濃度的初始值和最大值；μmax為時(shí)間t=M時(shí)的相對(duì)生長(zhǎng)速率，h-1；M為達(dá)到相對(duì)最大生長(zhǎng)速率所需要的時(shí)間，h。

1.2.2 二級(jí)模型的建立與驗(yàn)證 二級(jí)模型采用平方根模型，可以很好地預(yù)測(cè)出溫度對(duì)假單胞菌最大比生長(zhǎng)速率以及延滯期的影響[15]，常被用來(lái)描述溫度對(duì)假單胞菌生長(zhǎng)狀況的影響[16]，公式如下：

式中：b為系數(shù)；μ為生長(zhǎng)速率；λ為延滯期；Tmin為微生物的理論最低生長(zhǎng)溫度，℃；此時(shí)最大比生長(zhǎng)速率為0。

偏 差 度 （bias factor，Bf）和 準(zhǔn) 確 度（accuracy factor，Af）通常被用來(lái)評(píng)價(jià)模型的準(zhǔn)確性[17-18]。當(dāng)偏差度在0.75~1.25，準(zhǔn)確度在1.1~1.9[19]時(shí)，一般認(rèn)為這種模型可以被接受。

式中：N0為實(shí)驗(yàn)實(shí)際測(cè)得的微生物數(shù)量；N1為應(yīng)用模型得到的與N0同一時(shí)間的微生物數(shù)量；n為實(shí)驗(yàn)次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌相變化和菌種分析

2.1.1 不同冷卻方式下菌落總數(shù)隨冷藏時(shí)間的變化 我國(guó)對(duì)冷鮮肉的新鮮度無(wú)明確的標(biāo)準(zhǔn)，通常將菌落總數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[20]。由表1知，在貯藏期間，真空冷卻的雞胸肉菌落總數(shù)明顯少于冷風(fēng)冷卻，其中僅在第3天略高于冷風(fēng)冷卻。主要有兩個(gè)原因，一是真空冷卻過(guò)程中氧氣分壓降低，抑制嚴(yán)格需氧型微生物的生長(zhǎng)和繁殖，如假單胞菌；二是真空冷卻能殺死部分微生物如球菌和桿菌[21]。但是，兩者菌落總數(shù)都隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。參考相關(guān)研究[20]，冷鮮肉中細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng)該低于6（lg（CFU/g））。冷風(fēng)冷卻的雞胸肉在5℃條件下，前3 d可以維持較好的品質(zhì)，而真空冷卻的雞胸肉在5 d以?xún)?nèi)都可以維持較好的品質(zhì)。這為真空冷卻延長(zhǎng)冷鮮雞胸肉的保質(zhì)期提供了依據(jù)。

表1 不同冷卻方式的雞胸肉在不同貯藏時(shí)間內(nèi)表面菌落總數(shù)變化Table 1 Changes of total number of colony on the surface of chicken breast prepared with different cooling methods during different storage time

2.1.2 菌種分析 基于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果，分析冷風(fēng)冷卻和真空冷卻雞胸肉在不同冷藏期間內(nèi)每種菌所占總菌數(shù)的百分比，結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)1~5 d貯存的兩種雞胸肉，通過(guò)表型（顏色、菌落）等觀察，可以分為8類(lèi)不同的菌種。其中，貯藏后期假單胞菌所占的比例最大，對(duì)其與相應(yīng)理化指標(biāo)做線性分析（見(jiàn)表3），可以看出，假單胞菌與各項(xiàng)指標(biāo)都有較好的相關(guān)性，即假單胞菌是影響雞胸肉的重要指標(biāo)，且之前[22-24]的研究證明，假單胞菌是引起肉類(lèi)變質(zhì)的主要因素，即假單胞菌是雞胸肉腐敗的優(yōu)勢(shì)微生物。

表2 不同冷卻方式的雞胸肉在貯藏期間表面優(yōu)勢(shì)菌組成比例Table2 Proportion of dominant bacteria on thesurfaceof chicken breast meat with different cooling methodsduring storage

表3 雞胸肉貯藏期間各項(xiàng)指標(biāo)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)Table 3 Pearson product-moment correlation coefficient of various indicators during chicken breasts storage

續(xù)表2

2.2 假單胞菌最小限量的確定

5℃貯藏期間真空冷卻的雞胸肉中微生物數(shù)量及其理化指標(biāo)的變化見(jiàn)表1、表4。微生物的數(shù)量在第5天的時(shí)候變化較明顯，由第4天的5.905（lg（CFU/g））增加到6.330（lg（CFU/g）），超過(guò)6（lg（CFU/g））。理化指標(biāo)也發(fā)生了相應(yīng)變化，TVB-N值從第3天的14.679 mg/hg增加到了23.300 mg/hg。結(jié)合假單胞菌數(shù)、TVB-N值、pH，參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[25]（TVB-N值＜15mg/hg），真空冷卻雞胸肉中假單胞菌的最小限量是5.373（lg（CFU/g））。

表4 真空冷卻雞胸肉的理化指標(biāo)變化Table 4 Changes of indexes of vacuum-cooled chicken breast

2.3 模型擬合

2.3.1 一級(jí)模型的擬合 實(shí)驗(yàn)分別記錄0、5、10、15、20、25℃貯藏期間雞胸肉的假單胞菌總數(shù)，用Origin對(duì)雞胸肉中的假單胞菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型（一級(jí)模型）方程擬合生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1，模型方程見(jiàn)表5，動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表6。

表5 真空冷卻雞胸肉在不同溫度下假單胞菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型Table 5 Kinetic models for bacteria in chicken breast chilled by vacuum at different temperature

表6 不同溫度冷藏雞胸肉時(shí)假單胞菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 6 Kinetic parameters of Pseudomonas on vacuum-cooled chicken stored at different temperature

圖1 不同溫度下真空冷卻雞胸肉中假單胞菌的生長(zhǎng)擬合曲線Fig.1 Growth data curves of Pseudomonas on vacuumcooled chicken stored at different temperature

2.3.2 溫度對(duì)真空冷卻雞胸肉中假單胞菌生長(zhǎng)參數(shù)的影響 圖2、圖3是用平方根模型描述的真空冷卻雞胸肉中溫度與假單胞菌最大比生長(zhǎng)速率、延滯期之間關(guān)系的模型。

圖2 溫度與最大比生長(zhǎng)速率的關(guān)系Fig.2 Relationship between temperatureand themaximum specific growth rate

圖3 溫度與延滯期的關(guān)系Fig.3 Relationship between temperature and lag phase

結(jié)果顯示，在0~25℃時(shí)，溫度與假單胞菌的最大比生長(zhǎng)速率以及延滯期有較好的線性關(guān)系。

2.3.3 真空冷卻雞胸肉中假單胞菌生長(zhǎng)模型的驗(yàn)證、評(píng)價(jià) 根據(jù)雞胸肉在10、15℃下假單胞菌總數(shù)的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值（見(jiàn)圖4），通過(guò)計(jì)算得出的偏差度和準(zhǔn)確度見(jiàn)表7。在這兩個(gè)溫度下，平方根模型偏差度和準(zhǔn)確度分別為0.75~25和1.1~1.9，由上述可知，1.2.2中的模型可被接受。且由圖4可知，假單胞菌總數(shù)的實(shí)際值與生長(zhǎng)模型擬合度較好，因此，該模型可以被用來(lái)預(yù)測(cè)微生物的生長(zhǎng)趨勢(shì)。

表7 真空冷卻雞胸肉在10、15℃冷藏期間微生物數(shù)量實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的偏差度和準(zhǔn)確度Table 7 Bias and accuracy of actual and predicted value of microorganism quantity in vacuum-cooled chicken breast meat stored at 10℃and 15℃

圖4 假單胞菌總數(shù)實(shí)際值與預(yù)測(cè)值Fig.4 Sketch map of the total number of Pseudomonas measured and simulated

3 結(jié) 語(yǔ)

目前，微生物是導(dǎo)致肉類(lèi)產(chǎn)品腐敗的主要原因，找到其腐敗期間的優(yōu)勢(shì)菌種并利用模型合理預(yù)測(cè)其在冷藏期間的生長(zhǎng)趨勢(shì)很有研究?jī)r(jià)值，可以較好地避免肉類(lèi)變質(zhì)而浪費(fèi)的現(xiàn)象。本文中證明了與冷風(fēng)冷卻相比，真空冷卻可以延長(zhǎng)雞肉的保質(zhì)期。但是真空冷卻的原理是利用水分的蒸發(fā)來(lái)吸收熱量，故會(huì)引起雞胸肉的干耗。但陳椒等[26]表明噴淋水分可以較好地解決這個(gè)問(wèn)題，具體的實(shí)施方案還需謹(jǐn)慎設(shè)計(jì)。假單胞菌是雞胸肉在貯藏期間的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，因此抑制假單胞菌生長(zhǎng)繁殖是延長(zhǎng)雞胸肉保質(zhì)期的方法之一，還可以計(jì)算雞胸肉中腐敗菌到達(dá)最小限量的時(shí)間來(lái)確定其保質(zhì)期。