劉梅芳 楊光至 張霞輝 馮斯峰 徐連杰 周以皓 施靜

摘要：目的 觀察針灸對(duì)腦梗死大鼠HSP60、Caspase-3表達(dá)規(guī)律，初步探討針灸對(duì)缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡保護(hù)的作用機(jī)制。方法 采用大腦中動(dòng)脈線栓誘導(dǎo)腦缺血再灌注損傷模型，隨機(jī)假手術(shù)組、模型組、電針穴位組、電針非經(jīng)非穴和艾灸穴位組。電針或艾灸干預(yù)后，術(shù)后0、12h評(píng)估大鼠的神經(jīng)功能缺陷評(píng)分和姿勢(shì)反射評(píng)分;熒光定量PCR檢測(cè)HSP60和Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 電針穴位組、艾灸穴位組大鼠神經(jīng)功能均優(yōu)于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，電針穴位組大鼠HSP60 mRNA顯著增加，差異有顯著性意義（P<0.05）;而Caspase-3 mRNA表達(dá)無明顯變化。結(jié)論 電針對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)功能有改善作用，其機(jī)制可能與上調(diào)腦組織中 HSP60表達(dá)，介導(dǎo)抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞：缺血性腦卒中;HSP60;Caspase-3;神經(jīng)細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：R246 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2021）05-0069-04

【Abstract】Objective： To study the determination method of polysaccharides in Aconitum racemulosum and to establish a UV spectrophotometric method for the determination of polysaccharides from Aconitum Racemulosum， and to investigate the influence of different producing areas and different processing methods on the content of polysaccharides. Methods： The impurities such as reducing sugars were removed by 80% ethanol reflux and then the polysaccharides were extracted with hot water. The phenol-sulfuric acid colorimetry was used to measure absorbance value at 488 nm wavelength by ultraviolet-spectrophotometry to obtain the content of polysaccharides. . Results： The polysaccharide of Aconitum racemulosum was calculated as anhydrous glucose and showed a good linear relationship in the range of 0.003 to 0.015 mg/mL（R=0.9999）， and the recovery rate was 99.35%-99.85%（n=6）， and the RSD value was 0.18 %. Conclusion： This method is accurate， reliable， and reproducible， which is suitable for the determination of polysaccharide content in Aconitum racemulosum. There are certain differences in the polysaccharide content in different batches of medicinal materials from different origins. The processing method has no significant effect on the polysaccharide content of Aconitum racemulosum.

【Key words】Aconitum racemulosum; Polysaccharide; Ultraviolet Spectrophotometry; Producing Area; Processing

中風(fēng)有著極高的發(fā)病率、患病率、死亡率、致殘率和復(fù)發(fā)率。世界范圍內(nèi)，發(fā)病率平均為140～200/10萬[1]。缺血性腦中風(fēng)仍是當(dāng)今疾病中主要的致殘、致死原因，嚴(yán)重威脅人類的健康，并給家庭和社會(huì)帶來了很大的負(fù)擔(dān)，因此，探討其發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療方法一直是醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)。缺血性腦損傷疾病發(fā)生與神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，凋亡發(fā)生的重要原因之一是線粒體凋亡傳導(dǎo)通路的激活。線粒體通路激活后，繼而啟動(dòng)Caspase-9激活，繼續(xù)激活Caspase-3，從而導(dǎo)致Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生[2-3]。HSP60作為熱休克蛋白家族中重要成員之一，在細(xì)胞凋亡過程中有其較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性[4]。

電針療法是將針刺和電刺激相結(jié)合，通過脈沖電流作用于神經(jīng)、肌肉引起神經(jīng)興奮性傳導(dǎo)，消除神經(jīng)纖維間水腫和神經(jīng)滋養(yǎng)血管的痙攣，對(duì)腦卒中具有較好的臨床療效。本研究以線粒體通路引起凋亡為切入點(diǎn)，通過電針、艾灸刺激缺血性腦卒中大鼠，觀察其對(duì)腦卒中大鼠的干預(yù)效應(yīng)，初步探討電針、艾灸對(duì)缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，為臨床針灸治療腦缺血疾病的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 來源，種屬，品系：SD大鼠，7～8周齡，體重180～200 g，雌性，昆明動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)（SCXK（川）2015-030）;動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物至少飼養(yǎng)一周后使用。溫度22±2℃，濕度55±5%，12 h光暗循環(huán)。飼料和水均在消毒后由動(dòng)物自由攝取。所有實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)條例進(jìn)行。

1.2 主要試劑 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ購自大連Takara;Trizol裂解液購置天根生化（北京）科技有限公司;引物均由上海生物工程有限公司合成;艾條選用中國(guó)蘇州市東方艾絨廠。

1.3 主要儀器 Veriti PCR擴(kuò)增儀購自美國(guó)ABI公司;MX3000P核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)儀來自美國(guó)Aglient公司;Megafugel1.0R離心機(jī)購自德國(guó)Thermo Scientific Heraeus。6805-A電針儀購自廣東省汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠。

1.4 模型誘導(dǎo)、分組及干預(yù) 采用孟宜良的線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血模型，并按照改良的Longa五點(diǎn)量表評(píng)分系統(tǒng)[5]對(duì)造模大鼠進(jìn)行篩選。評(píng)分在 1～3 分為造模成功。以下2種情況為模型復(fù)制不成功，予以剔除：實(shí)驗(yàn)過程中大鼠死亡;規(guī)定時(shí)間處死動(dòng)物取腦時(shí)見有蛛網(wǎng)膜下腔出血或頸內(nèi)動(dòng)脈分叉部出血。動(dòng)物模型成功后，隨機(jī)分為5組，每組5只，A組（假手術(shù)組）;B組（模型組）;C組（電針穴位組）;D組（電針非經(jīng)非穴）;E組（艾灸穴位組）。待大鼠呼吸、心跳等生命體征穩(wěn)定，按照不同的分組分別施以不同治療，取穴和針刺手法參照華興邦等研制的《大鼠穴位圖譜》，選取“大椎”、“百會(huì)”、“人中”三穴進(jìn)行針刺。針刺操作：“人中”向上刺lmm，“百會(huì)”向前斜刺2 mm，大椎直刺5 mm。針具選用佳健牌25號(hào)1寸一次性無菌針灸針;進(jìn)針后捻轉(zhuǎn)1 min，平補(bǔ)平瀉，每次留針30 min。電針穴位組：將大鼠仰臥位束縛于鼠板上，針刺大椎、百會(huì)、人中穴，接電針，留針30 min;電針非經(jīng)非穴組：將大鼠仰臥位束縛于鼠板上，針刺大椎、百會(huì)、人中穴的左側(cè)約0.3cm的非經(jīng)非穴點(diǎn)處，接電針，留針30 min;艾灸穴位組：將大鼠仰臥位束縛于鼠板上，艾灸大椎、百會(huì)、人中穴，灸30 min。電針儀選用廣東省汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠生產(chǎn)的6805-A 型，設(shè)定為疏密波，頻率2H以針柄微微顫動(dòng)為度，刺激30 min。

1.5 神經(jīng)功能缺陷評(píng)分 使用改良的Longa五點(diǎn)量表評(píng)分系統(tǒng)[5]分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行造模前、治療后12h神經(jīng)功能缺陷評(píng)分和姿勢(shì)反射評(píng)分。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無神經(jīng)缺陷為0分;左肢體不能完全伸展為1分;行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分;行走時(shí)向右側(cè)傾倒為3分;不能自發(fā)行走為4分;死亡為5分。姿勢(shì)反射評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：兩前肢完全伸展為0分（正常）;左前肢貼在胸部，右前肢伸展為1分（輕度異常）;左前肢貼在胸前，上半身卷曲為2分（嚴(yán)重異常）。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)檢測(cè)Caspase3和HSP-60 mRNA表達(dá) 稱取約20 mg相同位置的腦組織，加入Trizol裂解液1 mL，組織勻漿，RNA提取試劑盒抽提細(xì)胞總RNA。按Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后應(yīng)用SYBR Green I嵌合熒光法在實(shí)時(shí)定量PCR儀胞Caspase3和HSP-60表達(dá)檢測(cè)，相關(guān)引物由上海生物工程有限公司合成公司合成。在PCR反應(yīng)程序結(jié)束后，進(jìn)入儀器自帶軟件的數(shù)據(jù)分析界面，設(shè)置GAPDH為內(nèi)參基因，儀器自動(dòng)計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)差異倍數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，即2-△△Ct±標(biāo)準(zhǔn)差值。特異基因引物系列如下：

Caspase3：（Forward Primer）5′-GTACAGAGCTGGACTGCGGTATTG-3′

（Reverse Primer）5′-AGTCGGCCTCCACTGGTATCTTC-3′

HSP-60：（Forward Primer）5′-CACCACTGCCACTGTTCTGG-3′

（Reverse Primer）5′-GCCAACATCACACCTCTCCG-3′

β-actin：（Forward Primer）5′-TCAGGTCATCACTATGGCAAT-3′-3′

（Reverse Primer）5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本次研究采用 SPSS12.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，α=0.05為顯著性檢驗(yàn)性水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 針刺對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響 采用改良的Longa五點(diǎn)量表評(píng)分系統(tǒng)，評(píng)定動(dòng)物神經(jīng)功能缺損。每次評(píng)分3次，取平均值。分值越高，動(dòng)物的行為障礙越嚴(yán)重。結(jié)果顯示，干預(yù)12h，電針非經(jīng)非穴組、電針穴位組、艾灸穴位組大鼠神經(jīng)功能均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 針刺對(duì)腦梗死大鼠HSP60 mRNA基因表達(dá)水平的影響 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組HSP60 mRNA表達(dá)顯著降低，與模型組比較，電針穴位組大鼠HSP60 mRNA顯著增加，差異有顯著性意義（P<0.05）。而電針非經(jīng)非穴組和艾灸穴位組無顯著的變化（P>0.05）。見表2。

2.3 針刺對(duì)腦梗死大鼠Caspase-3 mRNA基因表達(dá)水平的影響 檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組Caspase-3 mRNA基因表達(dá)水平上升。與模型組比較，電針非經(jīng)非穴組、電針穴位組、艾灸穴位組大鼠Caspase-3 mRNA基因表達(dá)水平無明顯變化（P>0.05）。見表3。

3 討論

缺血性腦中風(fēng)（腦梗死）仍是當(dāng)今疾病中主要的致殘、致死原因，嚴(yán)重威脅人類的健康，并給家庭和社會(huì)帶來了很大的負(fù)擔(dān)。近年來，越來越多的患者認(rèn)可針刺治療腦梗死的療效，其治療的機(jī)制也成為研究熱點(diǎn)。針刺療法是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中一顆璀璨的明珠，有著悠久的歷史，黃帝內(nèi)經(jīng)、針灸甲乙經(jīng)等經(jīng)典對(duì)針刺治療腦中風(fēng)均有記載，已有實(shí)驗(yàn)研究提示針刺可減少興奮性氨基酸釋放、增加腦血流、升高超氧化物歧化酶（SOD），同時(shí)降低血清脂質(zhì)過氧化物（LPO）、加速清除自由基和腦細(xì)胞功能的修復(fù)等作用[3-4]。本研究結(jié)果顯示電針干預(yù)12h，電針干預(yù)組大鼠神經(jīng)功能均低于模型組，提示電針對(duì)腦中動(dòng)脈線栓誘導(dǎo)腦缺血再灌注損傷模型具有較好的治療作用，其相關(guān)的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要原因之一是線粒體凋亡傳導(dǎo)通路的激活，其與缺血性腦卒中疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6]。目前抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究的靶點(diǎn)主要是保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能。腦中風(fēng)（腦梗死）發(fā)病的特點(diǎn)是起病早，興奮性氨基酸毒性引起神經(jīng)元損傷。細(xì)胞死亡的早期階段觸發(fā)炎癥反應(yīng)，通過凋亡機(jī)制加重神經(jīng)元損傷。Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞死亡以及Caspase 無關(guān)的凋亡信號(hào)通路可由MCAO激活，導(dǎo)致梗死核心壞死，加重神經(jīng)元損傷[7]，其與缺血性腦卒中疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

目前抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究的靶點(diǎn)主要是保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞凋亡的重要途徑之一是線粒體凋亡通路，線粒體釋放促凋亡因子進(jìn)入胞漿隨即線粒體凋亡通路啟動(dòng)，當(dāng)線粒體釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞漿后，線粒體通路激活后，繼而啟動(dòng)Caspase-9激活，繼續(xù)激活Caspase-3，從而導(dǎo)致Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生[2-3]。熱休克蛋白在細(xì)胞凋亡中具有復(fù)雜的作用，但主要是抗凋亡[8]，它們的抗凋亡作用的統(tǒng)一特征是抑制蛋白水解成熟和/或胱天蛋白酶的活性，以及裂解其靶底物，包括粘著斑激酶（FAK）和PARP有研究指出：HSP60作為熱休克蛋白家族中重要成員之一，在細(xì)胞凋亡過程中有其較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性[4]。研究表明，HSP60表達(dá)的減少會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但不會(huì)改變線粒體功能。

本研究通過熒光定量PCR檢測(cè)HSP60表達(dá)情況。結(jié)果顯示，電針穴位組大鼠HSP60 mRNA顯著增加，提示電針可能通過增加HSP mRNA表達(dá)，發(fā)揮HSP抗凋亡的作用，抑制神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮缺血性腦損傷的保護(hù)作用。為進(jìn)一步研究HSP60對(duì)凋亡信號(hào)通路干預(yù)環(huán)節(jié)，我們進(jìn)一步研究檢測(cè)Caspase-3 mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，電針對(duì)腦梗死大鼠Caspase-3 mRNA基因表達(dá)水平無明顯變化，提示電針可能不作用在Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，推測(cè)可能結(jié)合胞質(zhì)中Bax、Bak或Bcl2家族，形成復(fù)合物從而發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，確切的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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