喬 曼，李冬生，何 媛,張 岑，李曉秋，李少穎

姜黃素是姜黃根莖植物中最重要的亮黃色多酚成分之一，臨床廣泛用于咳嗽、鼻竇炎、哮喘、風(fēng)濕病、糖尿病及心血管疾病等的治療[1-2]。近年來發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗腫瘤作用，其機制尚未完全闡明，主要與抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、DNA甲基化及抑制血管生成等有關(guān)[3-5]。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是癌癥高病死率和復(fù)發(fā)率的重要原因，與表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等多種原因有關(guān)，如何抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是癌癥研究的熱點問題。研究表明，姜黃素有抑制肺癌細(xì)胞侵襲的作用，其機制可能與抑制TGF-β介導(dǎo)的EMT有關(guān)[6]，但具體機制尚未完全闡明。SRPK1是一種絲氨酸/精氨酸蛋白激酶，能夠磷酸化蛋白質(zhì)的絲氨酸/精氨酸殘基，與肺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)[7]。姜黃素抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是否與SRPK1相關(guān)尚未明確，故本研究對此展開研究。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)和試劑 肺癌A549細(xì)胞購自上海酶研生物科技有限公司；姜黃素購自美國Sigma公司，批號:C1386-10G；RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自Gibco公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;Taq DNA聚合酶購自美國MBI公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司，批號：998897;質(zhì)粒提取試劑盒購自Vigrous公司。SRPK1抗體(ab90527)、TGF-β1抗體(ab92486)、ZEB1抗體(ab203829)、TWIST1抗體(ab50887)和SNAIL抗體(ab229701)均購自美國Abcam公司。

肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育,待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80%時用胰蛋白酶消化、計數(shù)、傳代。

1.2SRPK1減低肺癌A549細(xì)胞系的構(gòu)建 通過檢索NCBI Gene Bank數(shù)據(jù)庫，獲取SRPK1 RNA的完全序列，選擇編碼區(qū)作為設(shè)計siRNA的靶序列。利用Ambion公司的在線工具，找出具有siRNA功能的靶序列及能編碼siRNA的對應(yīng)DNA序列。把該DNA序列送往Invitrogen公司合成，并得到含有siRNA的psilencer TM 3.1-H1 hygro載體質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肺癌A549細(xì)胞，并篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

1.3細(xì)胞遷移實驗檢測姜黃素對肺癌A549細(xì)胞遷移的影響 先用marker筆在6孔板背后畫橫線，用直尺每隔0.5～1.0 cm畫一橫線，穿過孔，每孔至少穿過5條橫線。將20 μg/ml姜黃素處理的A549細(xì)胞和未處理的A549細(xì)胞加入6孔板中，每孔約5×105個細(xì)胞，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2日用10 μl槍頭畫與標(biāo)記線垂直方向的2條平行線，后用PBS液洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0、6、12、24 h后用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.4Western blot法檢測SRPK1、SNAIL、TGF-β、TWIST1和ZEB1蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，實驗組加入20 μg/ml姜黃素，對照組加入等量DMSO。2組細(xì)胞同時在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h后提取蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入對應(yīng)一抗4℃孵育過夜，PBST洗滌3次;加入HRP標(biāo)記的二抗(稀釋倍數(shù)1︰200)，室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光劑顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)獲得清晰條帶。計算目的基因/β-actin的灰度比值。

1.5RT-PCR檢測SRPK1、SNAIL、TGF-β、TWIST1和ZEB1 mRNA的表達(dá) 采用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,每個樣本分別用各目的基因和內(nèi)參基因引物擴增，設(shè)3個平行重復(fù)實驗,各取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用Fluorchen 2.01軟件進(jìn)行分析，計算各組目的基因/β-actin的灰度比值。相關(guān)基因引物序列見表1。

表1 RT-PCR基因引物序列

2 結(jié)果

2.1姜黃素對A549細(xì)胞遷移能力的影響 姜黃素處理后，A549細(xì)胞遷移能力顯著下調(diào)，見圖1。

圖1 姜黃素對A549細(xì)胞遷移能力的影響

2.2SRPK1對A549細(xì)胞遷移能力的影響 我們之前的研究表明，A549細(xì)胞SRPK1表達(dá)量較正常肺上皮細(xì)胞顯著上調(diào)[8]。本研究中，與對照組相比，實驗組癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因SNAIL、TGF-β、TWIST1及ZEB1的蛋白和mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)；用siRNA下調(diào)A549細(xì)胞SRPK1表達(dá)后，上述轉(zhuǎn)移相關(guān)基因蛋白和mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)。提示SRPK1具有調(diào)控細(xì)胞遷移的作用；在正常肺上皮細(xì)胞中導(dǎo)入SRPK1質(zhì)粒，上述轉(zhuǎn)移相關(guān)基因蛋白和mRNA表達(dá)明顯升高，進(jìn)一步驗證了SRPK1對細(xì)胞遷移的調(diào)控作用。見圖2。

圖2 姜黃素對A549細(xì)胞遷移相關(guān)基因蛋白和mRNA表達(dá)的影響

2.3姜黃素下調(diào)A549細(xì)胞SRPK1蛋白和mRNA的表達(dá) 添加姜黃素后A549細(xì)胞SRPK1蛋白和mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。見圖3。

圖3 姜黃素下調(diào)A549細(xì)胞SRPK1蛋白和mRNA的表達(dá)

3 討論

研究表明，姜黃素可通過多種途徑抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[9-11]。徐煒等[12]研究表明，姜黃素可以通過下調(diào)LIMK-1/cofilin蛋白磷酸化水平來影響細(xì)胞內(nèi)微絲骨架的結(jié)構(gòu)和分布，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞株801D的侵襲能力。另外，姜黃素可經(jīng)PI3K/AKT/mTOR通路明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]。在對子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B的研究中，陳茜等[14]發(fā)現(xiàn)姜黃素可抑制上游核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性而下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而抑制人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，姜黃素抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機制尚未完全闡明。經(jīng)典的TGF-β/smad通路及其下游轉(zhuǎn)錄因子(ZEB1、TWIST1、SNAIL等)在調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移中的作用已被廣泛認(rèn)可[15-16]，有研究表明姜黃素可以經(jīng)抑制TGF-β通路抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[6,17-18]，但姜黃素如何調(diào)控TGF-β通路尚未明確。SRPK1可磷酸化SRSF1進(jìn)而調(diào)控基因可變剪接[19-20]，并可促進(jìn)肺癌[7,21]、基底細(xì)胞癌[22]等腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。但SRPK1、TGF-β1和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚未明確。本研究以RNA干擾的方法建立低表達(dá)SRPK1的A549細(xì)胞系，與正常A549細(xì)胞相比，前者TGF-β1及其下游轉(zhuǎn)錄因子ZEB1、TWIST1、SNAIL等均顯著下調(diào)，提示SRPK1可正調(diào)控TGF-β1通路。

綜上，姜黃素能通過下調(diào)SRPK1的表達(dá)來抑制肺癌A549細(xì)胞的遷移。但本研究未能闡明SRPK1調(diào)控TGF-β1的具體機制，且還需要注意的是，盡管TGF-β1可以通過smad途徑促進(jìn)ZEB1、TWIST1、SNAIL等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，但理論上并不能排除SRPK1通過非TGF-β1途徑對上述轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的可能。