李一帆，陳立平，周 瑞，胡燕芳

食管癌是一種較常見的惡性腫瘤，我國發(fā)病率較高，生存率較低，患者預(yù)后較差[1]。目前電子內(nèi)鏡、超聲等診斷技術(shù)提高了食管癌的診斷準(zhǔn)確率，然而檢測費(fèi)用相對高昂，限制了其在臨床的普遍應(yīng)用。因而尋找診斷食管癌的相關(guān)標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)非常重要。激肽釋放酶(KLK)是一組具有多種生理功能的絲氨酸蛋白酶，KLK13是新發(fā)現(xiàn)的KLK基因，位于染色體19q13.4上[2]。較早的一項研究表明，KLK13等KLK基因在乳腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)，并且是乳腺癌預(yù)后良好的獨(dú)立影響因素[3]。另有研究表明，KLK13在早期卵巢癌患者中過表達(dá)，且其高表達(dá)與不良預(yù)后、無復(fù)發(fā)生存期明顯相關(guān)[4]。目前KLK13與食管癌臨床病理特征的相關(guān)研究較少，了解其表達(dá)與食管癌臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，可有效預(yù)防食管癌的發(fā)生，進(jìn)而降低發(fā)病率、改善患者預(yù)后。本研究通過回顧性分析91例食管癌KLK13表達(dá)與患者臨床病理特征和1年生存率的關(guān)系，旨在為食管癌的預(yù)防、診治提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年5月—2019年9月于本院行食管癌切除術(shù)的91例食管癌作為患者組，男50例、女41例；年齡(57.04±12.08)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合食管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，且經(jīng)病理檢查確診；在本院接受手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；有放、化療手術(shù)史；患有嚴(yán)重感染；伴重要臟器器質(zhì)性病變；臨床病理資料不全。另收集30例正常受試者作為正常對照組，男20例、女10例；年齡(55.76±11.42)歲。2組性別、年齡等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 取患者組手術(shù)切除的食管癌組織和正常對照組的正常食管組織，檢測KLK13表達(dá)情況；回顧性分析患者組臨床病理資料，包括年齡、臨床TNM分期[6]、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，分析KLK13表達(dá)與食管癌患者臨床病理特征的關(guān)系。全部食管癌患者通過門診方式隨訪1年，術(shù)后每月隨訪1次，隨訪截止時間為2020年10月或疾病進(jìn)展，統(tǒng)計分析食管癌患者中位生存期及1年生存率，生存期為入組至末次隨訪日期或患者死亡時間。進(jìn)一步采用Cox回歸模型分析食管癌患者1年生存率的影響因素。

1.3KLK13表達(dá)檢測 由本院病理科采用免疫組織化學(xué)染色法檢測KLK13表達(dá)，操作按照說明書進(jìn)行，鼠抗人KLK13抗體購自上海Sigma-Aldrich有限公司。2組病變組織標(biāo)本均使用10%甲醛固定、脫水、石蠟包裹，連續(xù)切片4 μm，切片后常規(guī)染色，再行EnVision兩步法免疫組織化學(xué)染色。切片脫蠟至水、高壓修復(fù)后使用3%過氧化氫滅活過氧化物酶，4℃ 24 h，再使用DAB染色。同時使用陽性切片作對照，PBS作陰性對照。結(jié)果判定：每張切片由2位病理科醫(yī)師采用雙盲法確認(rèn)，于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞。細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色為KLK13染色陽性，細(xì)胞質(zhì)陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性，陽性細(xì)胞10%～25%為+，陽性細(xì)胞25%～50%為++，陽性細(xì)胞≥50%為+++。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗繪制生存率曲線，采用Cox回歸分析模型探討影響食管癌患者1年生存率的因素。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.12組KLK13表達(dá)比較 KLK13在食管癌組織中的陽性表達(dá)率低于在正常組織中的陽性表達(dá)率(P<0.05)，見表1。

表1 激肽釋放酶13在正常組織、食管癌組織中的表達(dá)[例(%)]

2.2KLK13表達(dá)與食管癌患者臨床病理特征的關(guān)系 不同TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的食管癌患者癌組織中KLK13的陽性表達(dá)情況比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 激肽釋放酶13表達(dá)與食管癌患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3KLK13表達(dá)與食管癌患者1年生存率的關(guān)系 KLK13陰性表達(dá)患者的1年生存率為60.00%(33/55)，KLK13陽性表達(dá)患者的1年生存率和中位生存時間分別為36.11%(13/36)和6.10個月，KLK13陰性表達(dá)患者的1年生存率高于陽性表達(dá)患者(P<0.05)，見圖1。

圖1 激肽釋放酶13表達(dá)與食管癌患者1年生存率的關(guān)系

2.4食管癌患者1年生存率的多因素Cox回歸分析 利用Cox回歸模型對篩選出的4個因素(TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)行多因素分析。以影響食管癌患者1年生存率為自變量，上述4個因素為因變量，賦值情況：TNM分期(Ⅰ期=0、Ⅱ期=1、Ⅲ期=2)，腫瘤分化程度(高分化=0、中分化=1、低分化=2)，腫瘤大小(<4 cm=0、≥4 cm=1)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無=0、有=1)，KLK13表達(dá)(陰性=0、陽性=1)。結(jié)果表明，腫瘤低分化程度、KLK13陽性表達(dá)是食管癌患者1年生存率的獨(dú)立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 食管癌患者1年生存率的多因素Cox回歸分析

3 討論

食管癌在我國高發(fā)，且多數(shù)是鱗癌[7]。雖然食管癌的治療方式較多，如切除術(shù)、放化療、內(nèi)鏡治療等，但是生存率一直不高[8]。近幾年，腫瘤免疫成為食管癌治療的新突破口[9]。有研究指出，KLK通過導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變與基底膜的裂解，從而促使腫瘤血管生成[10]。還有報道發(fā)現(xiàn)，KLK13可作用于細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，促使腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移[11]。Darling等[12]發(fā)現(xiàn)KLK13在唾液腺腫瘤中高表達(dá)，可作為診斷唾液腺腫瘤較敏感的生物學(xué)標(biāo)志物。而KLK家族在食管癌中的相關(guān)報道較少，故本研究通過檢測食管癌患者的KLK13表達(dá)情況，并分析其臨床意義，以期為食管癌腫瘤免疫治療提供新的思路。

Lin等[13]研究發(fā)現(xiàn)，KLK13在食管鱗癌中的表達(dá)下降，可能成為食管鱗癌新的治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，食管癌組織中的KLK13陽性表達(dá)率低于正常組織中的陽性表達(dá)率，提示KLK13在食管癌組織中的表達(dá)下調(diào)。閆明等[14]研究指出，KLK13的表達(dá)與食管癌患者TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征存在關(guān)聯(lián)。同樣本研究也發(fā)現(xiàn)，臨床TNM分期越高、分化程度越嚴(yán)重、腫瘤直徑越大、伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌患者KLK13陽性表達(dá)水平越高，表明KLK13可能參與了食管癌的發(fā)生發(fā)展。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)KLK13陰性表達(dá)患者的1年生存率高于陽性表達(dá)患者，提示KLK13有望成為食管癌預(yù)后的評估指標(biāo)，對于食管癌的臨床治療有特殊意義。上述研究均認(rèn)為KLK13高表達(dá)預(yù)示著食管癌患者預(yù)后較差，同樣Nohara等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，與KLK13陰性表達(dá)食管癌患者相比，陽性表達(dá)患者的預(yù)后明顯較差。在食管癌預(yù)后多因素分析中，本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤低分化程度、KLK13陽性表達(dá)是影響食管癌患者1年生存率的獨(dú)立危險因素，提示低分化、KLK13陽性表達(dá)的食管癌患者具有疾病進(jìn)展高風(fēng)險，因而臨床應(yīng)重視該類患者并制定有效方案，以期改善患者預(yù)后。

綜上所述，KLK13在食管癌組織中陽性表達(dá)率較低，其參與了食管癌的發(fā)生發(fā)展過程，且KLK13陽性表達(dá)可能提示患者病情較嚴(yán)重、預(yù)后較差，有望成為臨床診斷、評估預(yù)后的標(biāo)志物，可為食管癌的腫瘤免疫治療提供全新的思路。