華盛平，王 瑤，鄭潤琪，李金亮，張維娜，夏 晴

（國家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850）

巨噬細(xì)胞作為一種在固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫啟動中發(fā)揮重要作用的免疫細(xì)胞，在保護(hù)機體免受感染方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞免疫學(xué)功能主要包括吞噬（病原體、病毒感染細(xì)胞、細(xì)胞碎片和死細(xì)胞等）、抗原遞呈和細(xì)胞因子分泌［1-2］。鈣離子是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，在細(xì)胞周期、運動、自噬和凋亡等生物學(xué)事件中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［3］。細(xì)胞中鈣離子主要存在于細(xì)胞漿、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，對線粒體發(fā)揮功能至關(guān)重要［4］。鈣離子促進(jìn)線粒體內(nèi)ATP的產(chǎn)生，當(dāng)線粒體內(nèi)鈣離子濃度過載時會導(dǎo)致細(xì)胞死亡［5］。近年來，鈣離子信號在免疫細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用受到關(guān)注，發(fā)現(xiàn)鈣離子信號在T細(xì)胞分泌集落刺激因子以及肥大細(xì)胞脫顆粒過程中均發(fā)揮了重要作用［6-7］。相對于T細(xì)胞和肥大細(xì)胞，有關(guān)巨噬細(xì)胞鈣離子信號的研究較少，特別是關(guān)于線粒體鈣離子信號在巨噬細(xì)胞中的作用和調(diào)控機制尚未見報道。

4mt-GCaMP6線粒體鈣離子熒光探針是在GCaMP6探針基礎(chǔ)上加入線粒體靶向定位序列，通過綠色熒光強度可特征性地指示線粒體內(nèi)鈣離子濃度的變化［8］。本研究使用4mt-GCaMP6制備慢病毒并感染永生化小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞（immortalized bone marrow-derived macrophages，iBMDM），構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)線粒體鈣離子熒光探針的巨噬細(xì)胞系iBMDM-4mt-GCaMP6，為探究線粒體鈣信號在巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用及相關(guān)分子機制提供工具。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

iBMDM巨噬細(xì)胞和293T細(xì)胞取自本實驗室細(xì)胞庫。4mt-GCaMP6線粒體鈣離子熒光探針為本實驗室前期構(gòu)建［8］，慢病毒包裝質(zhì)粒（psPAX2和pCMV-VSVG）取自本實驗室質(zhì)粒庫。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰蛋白酶和青鏈霉素（中科邁晨科技有限公司），胎牛血清（美國Gibco公司），聚凝胺（上海漢恒生物有限公司），嘌呤霉素（北京吉普賽生物技術(shù)有限公司），離子霉素（上海陶素生化公司）。Ringer溶液為實驗室自制（mmol·L-1：NaCl 155，KCl 4.5，CaCl22.0，MgCl21.0，HEPES 5.0，葡萄糖10.0，pH=7.4）。病毒濃縮柱（美國Millipore公司），Mito-Tracker?Red FM和Lab-Tek八腔室蓋玻片（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 4mt-GCaMP6慢病毒的制備

將293T細(xì)胞傳代接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度為40%時，細(xì)胞換液加新鮮的DMEM培養(yǎng)基10 mL。配置磷酸鈣轉(zhuǎn)染體系：HBS溶液1 mL，4mt-GCaMP6質(zhì)粒 6 mg，psPAX2質(zhì)粒 4.5 mg，pCMV-VSVG質(zhì)粒1.5 mg。用移液槍將轉(zhuǎn)染體系混合均勻后靜置5 min，緩慢逐滴加入CaCl267 mL，混合均勻后靜置15 min，隨后將轉(zhuǎn)染體系逐滴加入培養(yǎng)基中。6 h后細(xì)胞換液加入培養(yǎng)基10 mL，48 h后補加培養(yǎng)基5 mL，72 h后收集含有病毒的培養(yǎng)上清到離心管中。常溫離心機中200×g離心15 min，隨后取上清用0.45 mm濾器過濾到病毒濃縮柱中。4℃，7000×g離心30 min，隨后在病毒間操作臺收取病毒濃縮液，分裝病毒濃縮液至EP管中，-80℃冰箱長期保存。

1.3 線粒體鈣離子熒光探針巨噬細(xì)胞系構(gòu)建

每皿1×106巨噬細(xì)胞iBMDM接種于直徑6 cm的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中加37℃預(yù)溫的DMEM培養(yǎng)基4 mL。細(xì)胞貼壁后加入4mt-GCaMP6慢病毒濃縮液100 mL，同時加入聚凝胺8 mmol·L-1終濃度。病毒感染36 h后加入嘌呤霉素2 mg·L-1終濃度，抗性篩選培養(yǎng)7 d，獲得穩(wěn)定表達(dá)線粒體鈣離子熒光探針的細(xì)胞系iBMDM-4mt-GCaMP6。

1.4 觀測線粒體鈣離子iBMDM-4mt-GCaMP6熒光探針表達(dá)和共定位

將離子霉素抗性篩選7 d后的iBMDM-4mt-GCaMP6細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，按每孔3×104細(xì)胞均勻接種于Lab-Tek八腔室中。待細(xì)胞完全貼壁并狀態(tài)良好時，用生理鹽水洗3次，去除原DMEM培養(yǎng)基。每孔加入Ringer緩沖液300 mL，緩沖液中含有200 nmol·L-1線粒體指示探針Mito-Tracker?Red FM。細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min后，將Lab-Tek八腔室置激光共聚焦熒光顯微鏡下觀測，在波長488 nm的激發(fā)光下觀察iBMDM-4mt-GCaMP6細(xì)胞的線粒體鈣離子熒光探針發(fā)光強度和線粒體共定位。

1.5 離子霉素刺激下線粒體鈣離子動態(tài)成像

將穩(wěn)定表達(dá)線粒體鈣離子熒光探針的iBMDM-4mt-GCaMP6細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，按每孔3×104細(xì)胞均勻接種于Lab-Tek八腔室中。待細(xì)胞完全貼壁并狀態(tài)良好時，用生理鹽水洗3次去除原DMEM培養(yǎng)基，每孔加入預(yù)溫的Ringer緩沖液150 mL，置共聚焦熒光顯微鏡成像系統(tǒng)下，以每幀3 s的間隔預(yù)先拍攝30 s。提前用預(yù)溫的Ringer緩沖液稀釋離子霉素至目標(biāo)濃度，拍攝第30秒時向觀測腔室快速滴加Ringer緩沖液150 μL，離子霉素終濃度 10 μmol·L-1，持續(xù)拍攝10 min。多孔拍攝結(jié)束后，使用Volocity軟件對實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，每孔統(tǒng)計20個細(xì)胞（n=20）。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染后線粒體鈣離子熒光探針在巨噬細(xì)胞iBMDM成功表達(dá)的鑒定

將線粒體鈣離子熒光探針4mt-GCaMP6慢病毒感染巨噬細(xì)胞iBMDM后，嘌呤霉素抗性篩選7 d，將具有嘌呤霉素抗性的細(xì)胞置于共聚焦熒光顯微鏡下觀測。在綠色熒光通道下可見細(xì)胞有明顯的綠色熒光，發(fā)出綠色熒光的部分為絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，發(fā)光細(xì)胞率為100%（圖1）。共聚焦熒光顯微鏡觀測結(jié)果顯示，線粒體鈣離子熒光探針4mt-GCaMP6在巨噬細(xì)胞iBMDM中成功表達(dá)，表明iBMDM-4mt-GCaMP6細(xì)胞系構(gòu)建成功。

Fig.1 Expression of mitochondrial calcium probe 4mt-GCaMP6 in immortalized bone marrow-derived macrophages（iBMDM）.A：cells were excited with bright field；B：cells were excited with 488 nm laser（green）.

2.2 線粒體鈣離子探針和線粒體指示探針共定位一致

為進(jìn)一步驗證iBMDM-4mt-GCaMP6細(xì)胞系能夠正確指征線粒體定位，使用線粒體指示染料Mito-Tracker?Red FM與iBMDM-4mt-GCaMP6細(xì)胞共孵育30 min。隨后用共聚焦熒光顯微鏡觀測，在綠色熒光通道下細(xì)胞中絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)出綠色熒光（圖2A），在紅色熒光通道下Mito-Tracker?Red FM指征細(xì)胞線粒體為紅色熒光區(qū)域（圖2B），紅綠熒光通道同時打開時觀測到二者重合為黃色（圖2C）。使用Volocity軟件對紅綠熒光通道進(jìn)行共定位分析，共定位系數(shù)為91.2%。線粒體指示探針Mito-Tracker?Red FM共定位實驗表明，構(gòu)建的鈣離子熒光探針細(xì)胞iBMDM-4mt-GCaMP6可有效指示細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣離子。

Fig.2 Co-localization of mitochondrial calcium fluorescent probe 4mt-GCaMP6 and mitochondrial indicator probe Mito-TrackerTMRed FM.A：mitochondrial calcium probe 4mt-GCaMP6 was excited with 488 nm laser（green）；B：mitochondrial indicator probe Mito-Tracker? Red FM was excited with 561 nm laser（red）；C：cells were excited with 488 and 561 nm laser.

2.3 離子霉素刺激后鈣離子熒光探針可指示巨噬細(xì)胞線粒體鈣流變化

由圖3所示，為驗證所構(gòu)建的iBMDM-4mt-GCaMP6細(xì)胞能否響應(yīng)刺激，指示細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣離子濃度變化，使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放劑離子霉素刺激細(xì)胞，在激光共聚焦熒光顯微鏡下動態(tài)觀測線粒體鈣離子濃度的變化。離子霉素是經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放劑，可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子短時間內(nèi)釋放到胞漿并進(jìn)入到線粒體內(nèi)，促使線粒體內(nèi)鈣離子濃度增加。激光共聚焦熒光顯微鏡觀測結(jié)果顯示，iBMDM-4mt-GCaMP6細(xì)胞加入離子霉素10 μmol·L-1刺激后，線粒體內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生動態(tài)改變（圖3A），細(xì)胞內(nèi)綠色熒光鈣離子信號在6～9 s內(nèi)發(fā)生2倍的瞬時增強，在持續(xù)約45 s后逐漸回落到基礎(chǔ)水平（圖3B）。離子霉素響應(yīng)實驗表明，構(gòu)建的線粒體鈣離子熒光探針細(xì)胞iBMDM-4mt-GCaMP6可有效、準(zhǔn)確地指示巨噬細(xì)胞線粒體鈣離子濃度的變化。

Fig.3 Transient increase of mitochondrial calcium fluorescence probe signal induced by ionomycin in macrophages.A：changes of mitochondrial calcium flow in cells before and after the addition of ionomycin；B：GCaMP6 fluorescence change which represents mitochondrial Ca2+alterations was calculated by F/F0，where F0 refers to the median value of the fluorescence signals during the baseline period（from 0 to 30 s）.±s，n=20.

3 討論

線粒體是細(xì)胞的能量工廠，通過三羧酸循環(huán)及氧化磷酸化為細(xì)胞合成ATP。鈣離子能夠直接激活電子傳遞鏈上的一系列蛋白質(zhì)的活性，如ATP合成酶等。鈣離子在線粒體內(nèi)濃度的升高可促進(jìn)線粒體ATP的產(chǎn)生，提供細(xì)胞增殖、運動和細(xì)胞因子分泌等各種生命活動所需要的能量［9］。

鈣穩(wěn)態(tài)在細(xì)胞生理和病理生理中起關(guān)鍵作用，胞內(nèi)鈣離子濃度持續(xù)升高可引發(fā)細(xì)胞死亡。線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的動態(tài)平衡，對于線粒體能量代謝、形態(tài)維持和氧化狀態(tài)的調(diào)節(jié)等具有重要意義［10］。近年來，鈣離子信號在免疫細(xì)胞功能調(diào)控中的作用受到關(guān)注。Vaeth等［11］發(fā)現(xiàn)，儲備型鈣離子內(nèi)流、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和活化T細(xì)胞的核因子，三者通過上調(diào)細(xì)胞糖酵解和氧化磷酸化來調(diào)控T細(xì)胞的活化和增殖。Vennekens 等［12］發(fā)現(xiàn)，瞬時受體電位通道 4（transient receptor potential melastain type 4，TRPM4）缺陷的肥大細(xì)胞脫顆粒能力增強并釋放更多組胺、白三烯和腫瘤壞死因子，并且TRPM4缺陷小鼠有更嚴(yán)重的免疫球蛋白E介導(dǎo)的急性皮膚過敏反應(yīng)［12］。

鈣離子信號在巨噬細(xì)胞響應(yīng)病原體刺激、吞噬及細(xì)胞因子分泌過程中的作用已有報道。Schappe等［13］發(fā)現(xiàn)，TRPM7介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流是脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞激活所必需的，TRPM7缺陷的巨噬細(xì)胞在內(nèi)毒素激活時不能分泌白細(xì)胞介素1β和其他關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子。Zumerle等［14］發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞間由ATP介導(dǎo)的鈣離子信號可增強巨噬細(xì)胞的吞噬能力，但關(guān)于線粒體鈣離子信號在巨噬細(xì)胞中作用的研究還鮮見報道，原因可能主要是因為缺乏能夠明確指示線粒體鈣離子濃度變化的手段。

基因編碼的綠色熒光鈣離子探針GCaMP6通過在質(zhì)粒的N端添加不同的定位序列，能夠?qū)⒃撎结槹邢蚨ㄎ坏劫|(zhì)膜、線粒體以和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，從而觀察不同細(xì)胞器內(nèi)鈣離子的變化［15］。本研究中使用4mt-GCaMP6線粒體鈣離子熒光探針，在GCaMP6質(zhì)粒中添加了線粒體定位序列4mt，從而靶向細(xì)胞中線粒體內(nèi)鈣離子。Zhao等［8］使用線粒體鈣離子探針4mt-GCaMP6觀測細(xì)胞有絲分裂時線粒體鈣離子動態(tài)變化，揭示了線粒體對急性細(xì)胞能量應(yīng)激的代謝適應(yīng)機制。Wang等［16］使用線粒體基質(zhì)鈣離子探針mt-GCaMP6s觀測卵母細(xì)胞成熟和激活過程中線粒體鈣離子動態(tài)變化，證明線粒體鈣離子對卵母細(xì)胞激活的重要性。

綜上所述，本研究使用可視化的定位線粒體鈣離子的基因編輯探針4mt-GCaMP6，使用慢病毒感染方式構(gòu)建了可視化觀測線粒體鈣離子濃度變化的巨噬細(xì)胞系iBMDM-4mt-GCaMP6。該工具細(xì)胞的成功構(gòu)建，該工具細(xì)胞的成功構(gòu)建，為后續(xù)研究巨噬細(xì)胞吞噬或殺傷病原體及發(fā)揮抗原遞呈等生物學(xué)功能時線粒體鈣離子濃度的變化，以及不同極化狀態(tài)時的特征、作用和相關(guān)調(diào)控機制等提供了有利工具。