任禹珂，姜 華，張 頔，楊艷偉，王 超，張河戰(zhàn)，李 波，林 志

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心，藥物非臨床研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100176）

自磺胺嘧啶可誘導(dǎo)狼瘡首次報(bào)道后，越來越多的藥物被證明可干擾免疫系統(tǒng)并導(dǎo)致自身免疫性疾病，即藥物誘導(dǎo)的自身免疫（drug-induced autoimmunity，DIA）［1］。藥物誘導(dǎo)的自身免疫性疾病是一種長(zhǎng)期用藥引起的“B”型藥物不良反應(yīng)，已經(jīng)有近百種藥物和數(shù)十種疫苗可誘發(fā)自身免疫性疾?。?-3］。傳統(tǒng)的可誘發(fā)狼瘡癥狀的高風(fēng)險(xiǎn)藥物普魯卡因胺和肼苯噠嗪已逐漸退出市場(chǎng)。目前，藥物誘導(dǎo)的狼瘡與使用新的生物調(diào)節(jié)劑，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抑制劑和干擾素有關(guān)［2］。此外，藥物誘導(dǎo)的免疫毒性，也是非臨床藥物研發(fā)失敗以及臨床發(fā)生不良反應(yīng)的主要原因之一。盡管藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)有針對(duì)藥物免疫毒性評(píng)價(jià)相關(guān)指導(dǎo)原則ICH S8，但其并不包括藥物誘導(dǎo)的自身免疫毒性，所以急需尋找能夠在藥物誘導(dǎo)的自身免疫毒性早期做出預(yù)測(cè)的有效生物標(biāo)志物?？购丝贵w（antinuclear antibody，ANA）是診斷自身免疫性疾病的主要指標(biāo)，但未檢測(cè)到ANA依舊不能排除發(fā)生DIA的可能性。此外，不同藥物誘發(fā)的自身免疫性疾病產(chǎn)生的自身抗體也可能不同，如與普魯卡因胺有關(guān)的自身抗體主要有抗組蛋白（H2A-H2B）-DNA抗體和抗心磷脂抗體［4］，與TNF-α抑制劑有關(guān)的自身抗體主要有ANA、抗雙鏈DNA（double-stranded，dsDNA）抗體和抗核小體抗體等［5］，所以急需尋找更加可靠的藥物誘導(dǎo)的免疫毒性的生物標(biāo)志物。

大量研究表明，微RNA（microRNA，miRNA）表達(dá)的改變與免疫功能障礙和自身免疫高度相關(guān)，miRNA參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。miRNA存在于多種組織中，具有穩(wěn)定性且易于檢測(cè)［6］。因此，其具有作為自身免疫性疾病的生物標(biāo)志物的可能性。本研究采用經(jīng)典DIA模型［7］，BN大鼠ig給予D-青霉胺，在不同時(shí)間點(diǎn)解剖，提取脾組織中的RNA，選取與自身免疫性疾病相關(guān)的4種miRNA（miR-126a-5p，miR-146a-5p，miR-27a-3p和miR-155-5p），利用莖環(huán)法RT-qPCR檢測(cè)其在脾組織表達(dá)的改變，探討miRNA作為DIA毒性生物標(biāo)志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

D-青霉胺（貨號(hào)A11446），美國(guó)Alfa Aesar公司；ANA ELISA檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Alpha Diagnostic International公司；Trizol總RNA提取試劑，天根生化科技（北京）有限公司；含基因組DNA（gDNA）Eraser PrimeScript?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex Taq? Ⅱ（Tli RNase H Plus）、ROX plus和DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，日本TaKaRa公司；4種miRNA引物（表1和表2），美國(guó)Invitrogen公司。LEICA ASP300脫水機(jī)、SAKURATecc4714自動(dòng)包埋機(jī)、SAKURAIVS-410滑動(dòng)切片機(jī)、SAKURA Tissue-TekDRS-2000全自動(dòng)染色機(jī)和SAKURATissue-TekGLAS C410封片機(jī)，日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會(huì)社；SpectraMax PLUS384酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；NANODROP 2000分光光度計(jì)，美國(guó)Thermoscientific公司；ABI7500熒光定量PCR儀，美國(guó)Applied biosystems公司。

Tab.1 Primer sequences of stem loop reverse transcription

Tab.2 Primer sequences of real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只 SPF級(jí)雄性 Brown Norway（BN）大鼠（6周齡），體重110～140 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)，溫度設(shè)定為20～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，換氣次數(shù)為15 h-1，照明時(shí)間為12 h·d-1（8∶00-20∶00），給藥期間自由攝食和飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院動(dòng)物倫理委員會(huì)認(rèn)證批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)操作符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》等法規(guī)的要求。

1.3 動(dòng)物分組和給藥

經(jīng)7 d檢疫期觀察后，30只BN大鼠按照體重隨機(jī)分為3組，每組10只（給藥7和14 d各解剖5只），分別為溶媒對(duì)照組、D-青霉胺150和450 mg·kg-1組，每天給藥1次，溶媒對(duì)照組ig給予生理鹽水。末次給藥第2天處死大鼠。腹腔靜脈采血，室溫靜置1 h后4℃，3220×g離心10 min，得血清，取上清稀釋20倍。用ELISA法檢測(cè)血清中ANA；取脾稱重后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，剩余脾組織-80℃保存用于提取RNA。

1.4 癥狀觀察、體重測(cè)定和脾系數(shù)計(jì)算

給藥期間觀察面部脫毛及耳朵發(fā)紅等自身免疫反應(yīng)。給藥1，5，7，10和14 d測(cè)大鼠體重（g），給藥7和14 d稱脾重（g），計(jì)算脾系數(shù)。脾系數(shù)=脾重/體重×100。

1.5 HE染色觀察脾組織病理改變

取1.3分組大鼠脾組織，在10%福爾馬林中固定，脫水，包埋，切片（厚度約3 μm），經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后封片，在光鏡下進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.6 ELlSA測(cè)定血清ANA水平

取1.3分組制備的血清，按照試劑盒說明書檢測(cè)血清ANA水平。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值。

1.7 脾組織中總RNA的提取

取1.3分組大鼠脾組織，加入液氮后研磨，加入Trizol劇烈震蕩，室溫放置5 min；加入氯仿渦旋混勻，室溫放置5 min；12 000×g離心15 min后取上層水相，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，充分混勻后在冰上靜置10 min；12 000×g離心15 min，棄上清；用75%乙醇洗滌沉淀，4℃，12 000×g離心5 min，棄上清；室溫晾干沉淀，加入無RNA酶雙蒸水溶解沉淀得總RNA?？俁NA樣本A260nm/A280nm比值在1.8～2.1之間，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明RNA完整。

1.8 RT-qPCR檢測(cè)脾組織中miRNA表達(dá)

采用莖環(huán)法對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后使用SYBR?Premix Ex Taq? Ⅱ（Tli RNaseH Plus），ROX plus進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。使用U6作為內(nèi)參基因，采用Reverse Transcriptase M-MLV參照試劑說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR：2×SYBR? Premix Ex Taq?Ⅱ10 μL；正向引物（10 μmol·L-1）0.5 μL，反向引物（10 μmol· L-1）0.5 μL；cDNA 2 μL；無 RNA 酶 水7 μL。ABI7500熒光定量PCR儀檢測(cè)程序：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，40 s，循環(huán)40次。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按0.05℃·s-1從60℃緩慢加熱到99℃，建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，根據(jù)熔解曲線比較擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 D-青霉胺大鼠自身免疫癥狀及體重和脾系數(shù)的變化

連續(xù)給藥第6天，D-青霉胺450 mg·kg-1組3/10大鼠開始出現(xiàn)耳緣結(jié)痂癥狀，第8天3/5大鼠出現(xiàn)耳緣結(jié)痂癥狀；150 mg·kg-1組第6天1/10大鼠開始出現(xiàn)耳緣結(jié)痂癥狀，第8天2/5大鼠有耳緣結(jié)痂癥狀。該癥狀為自身免疫病癥狀（圖1A）。給藥期間各組大鼠的體重均保持增長(zhǎng)趨勢(shì)，與溶媒對(duì)照組相比給藥組無明顯變化（圖1B）。與溶媒對(duì)照組相比，給藥7 d后D-青霉胺150 mg·kg-1組大鼠脾系數(shù)顯著升高（P＜0.05），給藥14 d后450 mg·kg-1組脾系數(shù)顯著升高（P＜0.05）（圖1C）。

Fig.1 D-penicillamine-induced autoimmune manifestations（A）and changes of body mass（B）and spleen coefficient（C）.Brown Norway（BN）rats were ig administrated D-penicillamine 150 and 450 mg·kg-1once daily for 7 and 14 d，respectively，and were weighed on 1，5，7，10 and 14 d after administration.Spleen coefficint=spleen mass（g）/body mass（g）×100.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with solvent control group.

2.2 D-青霉胺致大鼠脾組織病理改變

HE染色顯示（圖2），給藥7 d后，D-青霉胺150 mg·kg-1組大鼠脾組織發(fā)生極輕度生發(fā)中心活躍伴易染體巨噬細(xì)胞數(shù)目增多，450 mg·kg-1組脾組織發(fā)生極輕度至輕度生發(fā)中心活躍伴易染體巨噬細(xì)胞數(shù)目增多。給藥14 d后，D-青霉胺150 mg·kg-1組脾組織發(fā)生極輕度至輕度生發(fā)中心活躍伴易染體巨噬細(xì)胞數(shù)目增多，450 mg·kg-1組脾組織發(fā)生輕度至中度生發(fā)中心活躍伴易染體巨噬細(xì)胞數(shù)目增多。溶媒對(duì)照組大鼠脾組織未見病理改變。

Fig.2 Spleen histopathological changes in BN rats after 7 and 14 d of D-penicillamine administration（HE staining，×4）.See Fig.1 for the rat treatment.Arrows show active germinal centers with increased numbers of tingible body macrophages.

2.3 D-青霉胺對(duì)大鼠血清ANA水平的影響

給藥7 d后，與溶媒對(duì)照組相比，D-青霉胺2個(gè)劑量組血清ANA水平無明顯變化；給藥14 d后，D-青霉胺450 mg·kg-1組血清ANA水平顯著升高（P＜0.05）（圖3）。

Fig.3 Effect of D-penicillamine on serum levels of antinuclear antibody（ANA）in BN rats after 7 and 14 d of administration.See Fig.1 for rat treatment.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with solvent control group.

2.4 D-青霉胺對(duì)大鼠脾組織miR-126a-5p，miR-146a-5p，miR-27a-3p和miR-155-5p表達(dá)的影響

由表3所示，給藥7和14 d后，與溶媒對(duì)照組相比，D-青霉胺150和450 mg·kg-1組大鼠脾組織miR-126a-5p，miR-146a-5p，miR-27a-3p和miR-155-5p表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）；與D-青霉胺150 mg·kg-1比較，450 mg·kg-1組脾組織4種miRNA表達(dá)亦明顯升高（P＜0.01），其中miR-155-5p升高更為明顯。給藥14 d與給藥7 d相比，D-青霉胺150和450 mg·kg-1組大鼠脾組織4種miRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。此外，D-青霉胺給藥7 d后，傳統(tǒng)的血清標(biāo)志物ANA并未明顯升高。

Tab.3 Effect of D-penicillamine on expression of miR-126a-5p,miR-155-5p,miR-146a-5p and miR-27a-3p in rat spleen tissue

2.5 大鼠脾組織miRNA與血清ANA水平受試者操作特征曲線（receiver operating curve，ROC）分析

對(duì)給藥7和14 d 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)所有大鼠的血清ANA和脾組織miRNA的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行ROC分析，以脾組織發(fā)生病理改變?yōu)闃?biāo)準(zhǔn)，出現(xiàn)病理?yè)p傷者為陽(yáng)性大鼠（標(biāo)記為“1”），未出現(xiàn)病理?yè)p傷者為陰性大鼠（標(biāo)記為“0”），通過ROC曲線下面積（AUC）評(píng)價(jià)傳統(tǒng)指標(biāo)ANA和miRNA的預(yù)測(cè)價(jià)值。ANA和miRNA的ROC曲線和AUC如圖4和表4所示。

Fig.4 Receiver operating curve(ROC)of ANA,miR-126a-5p,miR-155-5p and miR-146a-5p,miR-27a-3p.See Fig1.for the rat treatment.ROC curves of ANA and miRNA were drawn by SPSS17.0.

Tab.4 Area under curves(AUCs)of ANA and miRNA in spleens of rats administered with D-penicillamine

表4結(jié)果表明，4種miRNA的AUC均大于ANA，且miR-126a-5p的敏感性和特異性均高于ANA，miR-27a-3p和miR-155-5p的敏感性高于ANA，miR-146a-5p的特異性高于ANA。

3 討論

本研究結(jié)果表明，BN大鼠ig給予D-青霉胺14 d后，脾系數(shù)顯著增加，血清ANA水平顯著升高，病理學(xué)檢查見脾白髓生發(fā)中心活躍伴易染體巨噬細(xì)胞數(shù)目增多。由此表明，D-青霉胺可誘發(fā)BN大鼠產(chǎn)生類狼瘡樣自身免疫性疾病。

本研究結(jié)果顯示，傳統(tǒng)的自身免疫毒性生物標(biāo)志物血清ANA的水平在ig給予D-青霉胺14 d后才開始升高，而大鼠脾組織miR-126a-5p，miR-146a-3p，miR-27a-3p和miR-155-5p在ig給予D-青霉胺7 d后即顯著升高，升高程度均高于ANA，表明這4種miRNA作為藥物誘導(dǎo)的自身免疫毒性生物標(biāo)志物的敏感性高于血清ANA。對(duì)miRNA和ANA的ROC曲線分析結(jié)果表明，4種miRNA的AUC均大于ANA，即預(yù)測(cè)價(jià)值高于ANA。因此，在非臨床安全性評(píng)價(jià)研究中，該4種miRNA可能是較ANA更好的藥物誘導(dǎo)自身免疫毒性的生物標(biāo)志物。

miRNA是一種內(nèi)源性、長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，它們可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制翻譯或使靶mRNA降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)［8］。已有研究表明，miRNA調(diào)控的改變似乎與免疫功能紊亂和自身免疫反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)，不同的miRNA表達(dá)譜被認(rèn)為是某些自身免疫性疾病的生物標(biāo)志物［9］。脾是藥物誘導(dǎo)的免疫毒性損傷的主要靶器官，且在非臨床藥物安全性研究中易于獲得。通過檢測(cè)脾和血液中miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)脾中miRNA表達(dá)的改變更顯著，所以在藥物誘導(dǎo)的自身免疫動(dòng)物模型中，脾miRNA是更好的研究目標(biāo)［10］。其中，miR-126a-5p，miR-146a-5p，miR-27a-3p和miR-155-5p在多種自身免疫性疾病中的表達(dá)均發(fā)生了改變。miR-155可以通過作用于細(xì)胞信號(hào)阻抑物1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）促進(jìn)白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄激活因子5（activation of signal transducer and activator transcription 5，STAT5）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）的分化，而Treg中miR-155表達(dá)的變化可能導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生［11］。miR-146a則通過靶向干擾素（interferon，IFN）調(diào)節(jié)因子5，SOCS1，STAT1，IL-1受體相關(guān)激酶1和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6負(fù)調(diào)節(jié)Ⅰ型IFN信號(hào)通路，從而參與自身免疫性疾病的病理過程［12］，而miR-27a可能通過作用于胱天蛋白酶8和IL-10等基因mRNA促進(jìn)自身免疫性疾病的發(fā)生［13］。目前，有研究表明，miRNA與DNA甲基化相互作用可以使T細(xì)胞高度活化從而誘發(fā)自身免疫，CD4+T細(xì)胞中miR-126a可以通過抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1使DNA低甲基化，從而誘發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡［14］?？傊?，miRNA的異常表達(dá)可能參與藥物誘導(dǎo)的自身免疫毒性的發(fā)生和發(fā)展過程。

綜上所述，在藥物誘導(dǎo)的自身免疫毒性研究中，脾組織miR-126a-5p，miR-146a-3p，miR-27a-3p和miR-155-5p與自身性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，且敏感性優(yōu)于傳統(tǒng)的自身免疫性疾病生物標(biāo)志物ANA，同時(shí)該4種miRNA的預(yù)測(cè)價(jià)值均高于ANA。以上結(jié)果提示，miRNA有可能成為早期診斷藥源性自身免疫毒性的生物標(biāo)志物。此外，關(guān)于miRNA預(yù)測(cè)藥源性自身免疫性疾病的特異性以及參與調(diào)控藥源性自身免疫毒性的作用機(jī)制還有待深入研究。