武瑞君，桑曉冬，李治非，敖 翼，范 玲

（中國生物技術(shù)發(fā)展中心，北京 100039）

抗體類生物治療藥物因其具有靶向性強(qiáng)、特異性好、治療效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，在生物藥中占據(jù)著舉足輕重的地位［1］。近年來，抗體藥物獲批數(shù)量顯著增加，市場占有率節(jié)節(jié)攀升，成為生物藥中增長最快的領(lǐng)域。隨著抗體藥物的需求不斷加大，抗體技術(shù)的發(fā)展也日新月異，從多克隆抗體制備到單克隆抗體篩選，取得了鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體到全人源抗體等一系列突破性的成果，抗體技術(shù)成為生物技術(shù)領(lǐng)域特別是生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)?？贵w藥物隨著抗體技術(shù)的不斷創(chuàng)新而發(fā)現(xiàn)，同時(shí)技術(shù)創(chuàng)新又加速了新的抗體藥物的研發(fā)速度和生產(chǎn)水平的提升［2-4］。不斷創(chuàng)新抗體技術(shù)等關(guān)鍵核心技術(shù)，將變革性新技術(shù)應(yīng)用于抗體等藥物的研發(fā)，對(duì)推動(dòng)我國抗體藥物自主研發(fā)乃至新藥創(chuàng)制具有重要意義。本文介紹抗體技術(shù)發(fā)展歷程，系統(tǒng)綜述雜交瘤單克隆技術(shù)、抗體文庫展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)和單細(xì)胞測序技術(shù)等最新技術(shù)，對(duì)抗體新技術(shù)研發(fā)的重要性進(jìn)行分析，并對(duì)未來發(fā)展予以展望。

1 發(fā)展歷程

伴隨著抗體的發(fā)現(xiàn)和對(duì)抗體認(rèn)識(shí)的不斷加深，抗體技術(shù)的研究正在不斷拓展。廣義的抗體技術(shù)包括抗體的生產(chǎn)及與應(yīng)用相關(guān)的所有技術(shù)，狹義的抗體技術(shù)則是指與抗體生產(chǎn)相關(guān)的技術(shù)。根據(jù)發(fā)展歷程，抗體技術(shù)可分為多克隆抗體技術(shù)、雜交瘤單克隆抗體技術(shù)和基因工程抗體技術(shù)3個(gè)階段。

1.1 多克隆抗體技術(shù)

多克隆抗體發(fā)現(xiàn)于19世紀(jì)末。1890年，德國科學(xué)家Behring和日本科學(xué)家Shibasaburo發(fā)現(xiàn)，用白喉毒素免疫動(dòng)物獲得的免疫血清中有一種能夠中和白喉毒素的物質(zhì)存在，這種白喉毒素的抗血清即為一種多克隆抗體［5］。多克隆抗體的制備多通過免疫動(dòng)物獲得，當(dāng)抗原注射到動(dòng)物體內(nèi)后就會(huì)產(chǎn)生針對(duì)該抗原的抗體。大多數(shù)抗原表面成分復(fù)雜，具有多種不同的抗原表位，因而免疫血清中產(chǎn)生的抗體為針對(duì)多種抗原成分或抗原表位的、綜合的、不均一的多克隆抗體［2］。目前，恢復(fù)期患者血漿療法用于急性病毒性傳染病的應(yīng)急治療仍受到廣泛關(guān)注，如在流感、埃博拉、嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）及新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）流行期間均使用患者恢復(fù)期血漿療法進(jìn)行治療或臨床研究［6］。

1.2 雜交瘤單克隆抗體技術(shù)

單克隆抗體出現(xiàn)于20世紀(jì)70年代。1975年，英國科學(xué)家Kohler和Milstein將能夠產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞融合［7］，成功建立了雜交瘤單克隆抗體技術(shù)，成為第二代抗體生產(chǎn)技術(shù)。體外培養(yǎng)的B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體但不能長期存活，而腫瘤細(xì)胞可以無限繁殖，將二者融合，融合后的子代細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又能夠無限傳代，從而獲得抗體純度高、理化性質(zhì)均一、特異性強(qiáng)的單克隆抗體［3］。

1.3 基因工程抗體技術(shù)

基因工程抗體出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代早期。1984年，Morrison等［8］首次報(bào)道了人鼠嵌合抗體?；蚬こ炭贵w亦稱為重組抗體，是指利用重組DNA和蛋白質(zhì)工程技術(shù)等對(duì)編碼抗體的基因按不同需要進(jìn)行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞所表達(dá)的抗體分子。利用基因工程抗體技術(shù)減少抗體鼠源成分，增加人源化程度，降低免疫原性，成為第三代抗體技術(shù)［4］。目前常見的技術(shù)包括鼠源抗體人源化技術(shù)，以及抗體文庫展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)和單細(xì)胞測序技術(shù)等人源抗體篩選技術(shù)。

2 最新研究進(jìn)展和應(yīng)用

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)合抗體藥物的生物學(xué)特性，研發(fā)人員在傳統(tǒng)抗體技術(shù)的基礎(chǔ)上不斷優(yōu)化創(chuàng)新，力求通過更簡便快速的方法，獲得免疫原性更低、人體相容性更好及成本更低的治療性抗體。

2.1 雜交瘤單克隆抗體技術(shù)

雜交瘤單克隆抗體技術(shù)是在體細(xì)胞融合技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來，將免疫動(dòng)物的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成在體外長期存活并分泌免疫球蛋白的雜交瘤細(xì)胞，通過克隆化得到來自單個(gè)雜交瘤細(xì)胞的雜交瘤單克隆細(xì)胞系，生產(chǎn)大量單克隆抗體（圖1）。此過程中，雜交瘤細(xì)胞2次篩選至關(guān)重要［9］。最傳統(tǒng)的二次雜交瘤篩選方法為有限稀釋法［9］。該方法操作簡單，不需要特殊設(shè)備，但人工操作速度慢、效率低、耗時(shí)長、易出錯(cuò)，不能滿足高通量篩選的要求。流式分選技術(shù)也較多用于雜交瘤細(xì)胞的篩選，在細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記熒光信號(hào)，通過熒光信號(hào)強(qiáng)度反映細(xì)胞的抗體表達(dá)水平，并將收集高熒光信號(hào)強(qiáng)度的細(xì)胞，再通過有限稀釋或單細(xì)胞收集器得到高水平表達(dá)的單克?。?0］。該方法具有自動(dòng)化速度快和精確度較高等優(yōu)點(diǎn)，但需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，且檢測結(jié)果易受細(xì)胞周期影響。

圖1 雜交瘤技術(shù)聯(lián)合鼠源抗體人源化技術(shù)路線示意圖.PEG HAT：聚乙二醇次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)液.

隨著技術(shù)進(jìn)步，目前一種新的雜交瘤篩選技術(shù)——全自動(dòng)細(xì)胞篩選系統(tǒng)（Cellcelector）得到廣泛使用。該方法使用半固體培養(yǎng)，使細(xì)胞生長成單個(gè)獨(dú)立、分散、無法移動(dòng)的單克隆，加入熒光標(biāo)記克隆檢測試劑并捕獲目標(biāo)抗體后，在細(xì)胞克隆中形成熒光暈狀物質(zhì)。通過比較克隆細(xì)胞與克隆細(xì)胞周圍暈直徑的大小，計(jì)算出產(chǎn)生抗體的比例，即質(zhì)量系數(shù)。用機(jī)械臂及挑頭自動(dòng)化挑取質(zhì)量系數(shù)最高的細(xì)胞克隆獲得最高的抗體生產(chǎn)克?。?1-12］。作為最新一代技術(shù)，該全自動(dòng)細(xì)胞篩選系統(tǒng)具有高通量，自動(dòng)化，高效率，可編程、量化和存檔及追溯等優(yōu)點(diǎn)，可縮短研發(fā)周期，降低成本。

雜交瘤單克隆抗體技術(shù)方便、簡單、成本低，但僅能用于鼠源抗體篩選。1986年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市的第一個(gè)抗體藥物莫羅單抗（muromomab-CD3）即為用雜交瘤技術(shù)篩選的鼠源抗體，但鼠源抗體能夠被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別，引起強(qiáng)烈的人抗鼠抗體反應(yīng)，使得藥物療效減弱，并引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，利用雜交瘤技術(shù)直接獲得的鼠源抗體藥物在臨床應(yīng)用上受到極大限制，除少數(shù)化療用鼠源抗體仍在臨床使用外，鼠源抗體基本已被淘汰。為解決這一問題，科學(xué)家利用基因工程方法對(duì)鼠源抗體進(jìn)行人源化，在一定程度上減弱了人抗鼠抗體反應(yīng)。直至1994年，美國FDA才批準(zhǔn)了第二個(gè)抗體藥物即人鼠嵌合抗體藥物阿昔單抗（abciximab）上市。此后，通過雜交瘤技術(shù)篩選得到抗體通常需要進(jìn)一步進(jìn)行人源化改造，才能作為抗體藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用。

2.2 抗體文庫展示技術(shù)

抗體文庫展示技術(shù)是近30多年快速發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)，已成為抗體工程的前導(dǎo)工具。由于不能直接用雜交瘤技術(shù)獲得人源抗體，所以抗體文庫展示技術(shù)主要用來篩選人源抗體。利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）從B細(xì)胞中擴(kuò)增出抗體的重鏈和輕鏈群，將它們連入合適的載體表達(dá)隨機(jī)的聯(lián)合抗體文庫（圖2）。按抗體基因來源，目前抗體庫主要有天然抗體庫、半合成抗體庫、全合成抗體庫和混合抗體庫等類型。同時(shí)，隨著計(jì)算機(jī)輔助分析和虛擬設(shè)計(jì)的發(fā)展，還發(fā)展出表位特異性的靶向抗體庫技術(shù)平臺(tái)。根據(jù)抗體文庫所用載體的不同，目前主要的技術(shù)有噬菌體展示技術(shù)、酵母表面展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)和mRNA展示技術(shù)等［13］。

圖2 抗體文庫展示技術(shù)路線示意圖（噬菌體展示文庫為例）.

噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)為噬菌體侵蝕細(xì)菌并利用細(xì)菌表達(dá)自身外殼蛋白等過程。1985年，Smith等［14］第一次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ，創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù)。該方法純化步驟簡單，不要求昂貴的試劑和設(shè)備，但是存在肽庫容量只能達(dá)到1×109、系統(tǒng)依賴于細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)等缺點(diǎn)，且噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進(jìn)行有效的體外突變和重組，一定程度上限制了文庫中分子遺傳多樣性［15］。2002年，美國FDA批準(zhǔn)上市的首個(gè)全人源抗體藥物阿達(dá)木單抗（adalimumab）就是利用噬菌體展示文庫篩選得到的。同時(shí)，具有結(jié)構(gòu)簡單、相對(duì)分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、易于重組改造、組織穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的納米抗體，也通常是利用免疫羊駝聯(lián)合噬菌體展示文庫技術(shù)篩選而來，如2018年9月美國FDA批準(zhǔn)上市的目前唯一一個(gè)納米抗體藥物卡普賽珠單抗（caplacizumab），即是利用該技術(shù)研發(fā)得到。

酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)是一項(xiàng)真核蛋白展示技術(shù)。1997年，Boder和Wittrup等［16］將抗熒光素蛋白的單鏈可變區(qū)與α凝集素結(jié)合亞基的N端融合，首次建立了酵母展示系統(tǒng)。作為真核表達(dá)系統(tǒng)，酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)可以對(duì)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，且真核分泌系統(tǒng)有“質(zhì)量”控制機(jī)制，能阻止錯(cuò)誤折疊的蛋白被輸運(yùn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。此外，可使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)已構(gòu)建的酵母細(xì)胞庫進(jìn)行定量和實(shí)時(shí)篩選，高效便捷［13］。2020年，美國FDA批準(zhǔn)在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表達(dá)得到的抗體藥物依普奈珠單抗（eptinezumab）上市，使其成為首個(gè)酵母表達(dá)的抗體藥物。目前該技術(shù)也被用于納米抗體的開發(fā)。

此外，核糖體展示技術(shù)［17］和mRNA展示技術(shù)［18］作為新興的克隆展示技術(shù)，完全在體外進(jìn)行。通過構(gòu)建DNA文庫，在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與翻譯，最終形成“mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)”（核糖體展示技術(shù)）或“cDNA-mRNA-蛋白質(zhì)”（mRNA展示技術(shù)）三聚體，使目的蛋白的基因型（mRNA）和表型（蛋白質(zhì)）聯(lián)系起來，最后從中分離mRNA或cDNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴(kuò)增。該類技術(shù)與噬菌體或酵母細(xì)胞展示技術(shù)相比，具有建庫簡單、庫容量大、分子多樣性強(qiáng)、篩選方法簡便、可通過引入突變和重組技術(shù)提高靶標(biāo)蛋白親和力等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，mRNA展示技術(shù)經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA/mRNA雜交雙鏈，還避免了RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)體外篩選的干擾［19］。目前，越來越多的研究人員將該類技術(shù)應(yīng)用于新藥開發(fā)等領(lǐng)域。如二磷酸腺苷核糖基化是一種可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，廣泛存在于多種病毒、細(xì)菌和真核生命體內(nèi)，在調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。然而，該種修飾在細(xì)胞內(nèi)豐度相對(duì)較低，并處于單體修飾和多聚體修飾2種形式的動(dòng)態(tài)變化中，缺乏商用的特異性抗體，限制了研究人員對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模研究。蘇黎世大學(xué)Micheal團(tuán)隊(duì)使用核糖體展示技術(shù)和定向進(jìn)化策略，獲取了一種突變體eAfr1521，并將其應(yīng)用于二磷酸腺苷核糖基化修飾的研究，為后續(xù)研發(fā)提供了新的工具和策略［20］。

2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)

1985年，科學(xué)家首次提出將人源抗體基因?qū)胄∈笊臣?xì)胞，通過建立轉(zhuǎn)基因小鼠來生產(chǎn)人源抗體的建議，該想法的提出開創(chuàng)了人源抗體生產(chǎn)研發(fā)的新思路［21］。1989年，Brüggemann等［22］首次構(gòu)建了人源抗體重鏈基因載體，將人IgG基因座轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，引起基因重排并表達(dá)IgM。轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)是應(yīng)用基因工程技術(shù)破壞小鼠內(nèi)源抗體基因，然后將人抗體基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，再使用目標(biāo)抗原免疫轉(zhuǎn)基因小鼠，從而在其體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)抗體的技術(shù)（圖3）。該技術(shù)使抗原抗體免疫反應(yīng)在小鼠體內(nèi)進(jìn)行，保證了抗體類別轉(zhuǎn)換的完整性、抗體克隆選擇的多樣性及抗體親和力成熟的自然機(jī)制，因此利用該技術(shù)得到的抗體具有良好的親和性、穩(wěn)定性和可溶性等。由于該技術(shù)體系難度較大，具有技術(shù)壁壘高的特點(diǎn)，僅有少數(shù)公司掌握，主要有XenoMouse，UltiMab，VelociImmune和Kymab等轉(zhuǎn)基因小鼠。

圖3 轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)路線示意圖.

XenoMouse小鼠、UltiMab小鼠、VelociImmune小鼠和Kymab小鼠分別是美國Cell Genesys公司、Medarex公司和再生元（Regeneron）公司及英國Kymab公司研究人員培育而成。XenoMouse小鼠與UltiMab小鼠作為第一代轉(zhuǎn)基因小鼠，技術(shù)類似，均轉(zhuǎn)入了人IgH和Igκ的主要基因，同時(shí)小鼠自身的IgH和Igκ失活。VelociImmune小鼠和Kymab小鼠類似，將小鼠的IgH和Igκ的V區(qū)精確地替換為對(duì)應(yīng)的人IgH和Igκ的V區(qū)，同時(shí)保留了小鼠自身所有C區(qū)和其他基因表達(dá)調(diào)控原件。利用上述4種轉(zhuǎn)基因小鼠均有獲得美國FDA批準(zhǔn)上市的抗體藥物，其中美國Medarex公司利用UltiMab小鼠研發(fā)的抗體藥物獲批最多，達(dá)10個(gè)，如2009年獲批的4個(gè)抗體藥物卡那單抗（canakinumab）、優(yōu)特克單抗（ustekinumab）、戈利木單抗（golimumab）和奧法木單抗（ofatumumab）及2014年獲批程序性死亡受體1抗體納武單抗（nivolumab）。美國再生元公司利用轉(zhuǎn)基因小鼠開發(fā)埃博拉病毒中和抗體。2020年，美國FDA批準(zhǔn)的首個(gè)埃博拉抗體療法因馬澤布（inmazeb）即利用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)研發(fā)。COVID-19疫情期間，美國再生元公司也利用該轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)開展了新型冠狀病毒中和抗體的研發(fā)工作。

目前，我國研究團(tuán)隊(duì)也在積極建立轉(zhuǎn)基因小鼠相關(guān)研發(fā)體系。和鉑醫(yī)藥公司培育了Harbour小鼠，擁有H2L2和HCAb 2個(gè)品系。H2L2小鼠能產(chǎn)生具有2條全人源重鏈和輕鏈的單克隆抗體，HCAb小鼠能產(chǎn)生獨(dú)特的具有全人源可變區(qū)片段的重鏈抗體。重慶市畜牧科學(xué)院培育了CAMouse小鼠，擁有全人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠CAMouseHG和全人單域抗體轉(zhuǎn)基因小鼠CAMouseH2個(gè)品系。

2.4 單細(xì)胞測序技術(shù)

單細(xì)胞測序技術(shù)即單個(gè)B淋巴細(xì)胞抗體制備技術(shù)，是近年來新發(fā)展的一類快速制備單克隆抗體的技術(shù)，是根據(jù)每個(gè)B細(xì)胞只含有1個(gè)功能性重鏈可變區(qū)DNA序列和1個(gè)輕鏈可變區(qū)DNA序列，以及每個(gè)B細(xì)胞只產(chǎn)生1種特異性抗體的特性，將單細(xì)胞分離鑒定技術(shù)結(jié)合PCR技術(shù)形成的一種全人源單克隆抗體的體外表達(dá)系統(tǒng)（圖4）。利用該技術(shù)產(chǎn)生的抗體具有全人源性、高度抗原特異性、親和性高和基因多樣性豐富等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于腫瘤治療、病原微生物感染治療、自身免疫疾病檢測和治療及人類免疫系統(tǒng)研究等各個(gè)領(lǐng)域［23］。單細(xì)胞測序技術(shù)主要包括單個(gè)B細(xì)胞分選，抗體基因擴(kuò)增和克隆及抗原特異性抗體表達(dá)、篩選和鑒定等過程。如何分選得到單個(gè)B細(xì)胞是單細(xì)胞測序技術(shù)最重要的挑戰(zhàn)之一。相對(duì)傳統(tǒng)的B細(xì)胞分選策略是通過溶血空斑技術(shù)［24］、顯微操作法、磁珠分選法［25］、流式分選法［26］和激光切割法等技術(shù)，將單個(gè)細(xì)胞分離捕獲至容器，具有精確和節(jié)省細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，但單個(gè)細(xì)胞操作成本較高。隨著單細(xì)胞測序技術(shù)飛速發(fā)展和細(xì)胞分選技術(shù)的不斷優(yōu)化和改進(jìn)，目前有以下幾種較成熟的技術(shù)或平臺(tái)。

圖4 單細(xì)胞測序技術(shù)路線示意圖.

單液滴微流控技術(shù)（Drop-seq）是一種通過微流控裝置，將細(xì)胞和帶有條碼、分子標(biāo)簽的引物微珠一起裝入微小的液滴中，其中條碼用于標(biāo)記細(xì)胞，分子標(biāo)簽用于標(biāo)記轉(zhuǎn)錄本，每個(gè)液滴作為逆轉(zhuǎn)錄和PCR的微小反應(yīng)室，含有1個(gè)細(xì)胞和1個(gè)微珠。同1個(gè)細(xì)胞的mRNA被標(biāo)記上相同的條碼，因此可以通過條碼區(qū)分不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本。目前常用的商業(yè)化單細(xì)胞測序平臺(tái)10×Genomics就是基于該技術(shù)衍生而來，利用“雙十字”微流體交叉系統(tǒng)，橫向孔道逐個(gè)導(dǎo)入凝膠微珠，第一個(gè)縱向道輸入細(xì)胞，凝膠微珠和細(xì)胞碰撞被吸附在微珠上，然后通過微流控技術(shù)運(yùn)送到第二個(gè)縱向的“油管”通道，形成一個(gè)個(gè)油滴凝膠微珠。每一個(gè)凝膠微珠都布滿了不同的條碼和分子標(biāo)簽連接的序列，細(xì)胞裂解后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、測序。該方法具有操作簡便、耗時(shí)短、成本低、通量高等優(yōu)點(diǎn)，建庫僅需約12 h，7 min內(nèi)可完成100～80 000個(gè)細(xì)胞的捕獲［26］。

單孔板測序技術(shù)（Microwell-seq）是基于微孔板和帶有條碼的引物，對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的方法。該技術(shù)與Drop-seq不同之處在于把微液滴換成了微孔，將細(xì)胞懸液和帶有條碼的引物微珠鋪在微孔板的微孔中，使每個(gè)微孔含有1個(gè)細(xì)胞和1個(gè)微珠，細(xì)胞裂解后，細(xì)胞中的mRNA被微珠捕獲，這樣同1個(gè)細(xì)胞中的mRNA都帶有相同的條碼標(biāo)記，然后混在一起進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和測序［27］。

Beacon單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)是美國Berkeley Lights公司開發(fā)的一款能夠快速進(jìn)行單細(xì)胞分析的細(xì)胞分選和成像系統(tǒng)，通過整合微流控的納升級(jí)微反應(yīng)器技術(shù)、光電定位技術(shù)以及計(jì)算機(jī)系統(tǒng)等，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分選、培養(yǎng)、檢測和收集的自動(dòng)化和一體化。其中基于Beacon系統(tǒng)的抗體早期發(fā)現(xiàn)流程可以概括為免疫和抗體分泌細(xì)胞富集、抗體分泌細(xì)胞鋪板、抗性克隆鑒定、陽性克隆挑選及抗體序列獲取、克隆和表達(dá)等5個(gè)環(huán)節(jié)。該技術(shù)對(duì)常規(guī)方法進(jìn)行了系統(tǒng)革新，大大縮短了研發(fā)周期，提高了研發(fā)效率［28］。

單細(xì)胞測序技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高通量篩選和測序，目前在抗體藥物篩選領(lǐng)域應(yīng)用日趨廣泛，由于該技術(shù)近10年才高速發(fā)展，暫無獲批上市的藥物，但有多個(gè)利用該技術(shù)研發(fā)的藥物正處于臨床試驗(yàn)階段，如擬用于治療巨細(xì)胞感染的司韋單抗（sevirumab）和治療癌癥的普林木單抗（pritumumab）等。其中，由美國渤?。˙iogen）生物技術(shù)公司研發(fā)的阿杜卡尼單抗（aducanumab）備受關(guān)注，該單抗是一種靶向寡聚β淀粉樣蛋白、用于治療阿爾茨海默病的研究性藥物。研究人員對(duì)比了來自無認(rèn)知障礙健康老年受試者和具有緩慢認(rèn)知衰退的老年受試者的B細(xì)胞文庫，利用單細(xì)胞測序技術(shù)開發(fā)了人源重組單克隆抗體阿杜卡尼單抗。研究結(jié)果顯示，接受阿杜卡尼單抗治療的患者在認(rèn)知和功能指標(biāo)如記憶、定向和語言方面獲益顯著，個(gè)人理財(cái)、做家務(wù)（如清潔、購物和洗衣）以及獨(dú)立外出旅行等日常生活活動(dòng)也有獲益［29］。該公司于2020年7月向FDA提交了阿杜卡尼單抗生物制品許可申請(qǐng)，美國FDA于2020年8月受理，并授予了優(yōu)先審查，目前正在同時(shí)接受歐盟和日本監(jiān)管機(jī)構(gòu)的審查。COVID-19疫情期間，單細(xì)胞測序技術(shù)成為研發(fā)新冠病毒中和抗體的主流技術(shù)，美國禮來（Eli Lilly）公司聯(lián)合加拿大AbCellera Biologics公司、韓國國立保健研究院等團(tuán)隊(duì)，以及中國科學(xué)院微生物研究所、清華大學(xué)和北京大學(xué)等多個(gè)中國團(tuán)隊(duì)開展相關(guān)研究，其中LY-CoV555（美國禮來公司團(tuán)隊(duì)研發(fā)）和JS016（中國科學(xué)院微生物研究所團(tuán)隊(duì)研發(fā)）組成的中和抗體聯(lián)合療法于2021年2月9日獲批美國FDA緊急使用授權(quán)［30-33］。

3 不同抗體技術(shù)優(yōu)勢和劣勢對(duì)比

雜交瘤單克隆抗體技術(shù)、抗體文庫展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)和單細(xì)胞測序技術(shù)作為4種常用的抗體技術(shù)，各自具有不同的優(yōu)勢和劣勢（表1）。

表1 4種主要抗體技術(shù)優(yōu)勢和劣勢對(duì)比

雜交瘤單克隆抗體技術(shù)成熟、方便、成本低，但是僅能用于鼠源抗體篩選，且鼠源抗體能夠被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別，引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此利用雜交瘤技術(shù)篩選得到抗體通常需要進(jìn)一步進(jìn)行人源化改造。

與雜交瘤單克隆抗體技術(shù)相比，抗體文庫展示技術(shù)省去了細(xì)胞融合的步驟，擴(kuò)大了篩選容量，可以直接得到人源化抗體基因，且抗體文庫展示技術(shù)正在快速發(fā)展，不斷衍生出體內(nèi)、體外、真核等不同的表達(dá)系統(tǒng)，為篩選鑒定特異性抗體提供了更多方便的平臺(tái)。但目前抗體文庫展示技術(shù)仍不能廣泛用于完整IgG抗體的展示，需要首先片斷化展示后重建完整抗體分子，易篩選到非特異性的結(jié)合或親和力低下的抗體，且抗體庫難以儲(chǔ)存和運(yùn)輸，是相關(guān)科研材料共享的一大阻礙。在美國FDA已批準(zhǔn)上市的抗體藥物中，利用該技術(shù)篩選的僅占約10%。如何克服以上問題將是未來該技術(shù)發(fā)展的重要方向。

盡管首個(gè)全人源抗體來自噬菌體展示技術(shù)，但轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)仍是目前全人源抗體藥物領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的主流技術(shù)，具有高效、快速和對(duì)人體蛋白具有較好的免疫原性等優(yōu)點(diǎn)。利用該技術(shù)產(chǎn)生的抗體整體上成功率更高，已研發(fā)出治療銀屑病、黑色素瘤和高膽固醇血癥等多種疾病的全人源單克隆抗體。截至2019年11月，美國FDA批準(zhǔn)的30個(gè)全人源抗體藥物中，有21個(gè)來自轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)，占比70%。但由于人和小鼠之間免疫系統(tǒng)組成存在差異，如何通過轉(zhuǎn)基因小鼠獲得更接近人體天然產(chǎn)生的抗體結(jié)構(gòu)，仍然是未來研究的主攻方向。

單細(xì)胞測序技術(shù)具有快速、高通量、不受轉(zhuǎn)化效率的限制等優(yōu)點(diǎn)，可直接從B細(xì)胞篩選全人源性、高特異性、高親和性的抗體，且隨著一些先進(jìn)儀器用于單細(xì)胞測序平臺(tái)，該技術(shù)已成為篩選病毒類抗原抗體的主流技術(shù)。目前該技術(shù)還未完全發(fā)展成熟，且抗體來源受限于B細(xì)胞，較難獲取靶向自身抗原的抗體，但未來仍有很大的開發(fā)空間和應(yīng)用前景。

4 分析和展望

抗體藥物以其獨(dú)特的優(yōu)勢，在惡性腫瘤、自身免疫性疾病、感染類疾病的診斷和治療中發(fā)揮著越來越重要的作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。2021年2月11日，美國FDA批準(zhǔn)再生元公司研發(fā)的血管生成素樣蛋白3抗體依維蘇單抗（evinacumab）上市，作為全新作用機(jī)制的降脂藥，用于患有純合子家族性高膽固醇血癥的≥12歲兒童和成人患者，商品名為Evkeeza。依維蘇單抗的獲批標(biāo)志著美國FDA批準(zhǔn)的抗體藥物達(dá)到100個(gè)。伴隨著不同學(xué)科的匯聚和深度融合、分子生物學(xué)技術(shù)和重組抗體技術(shù)的不斷完善和高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，抗體技術(shù)在不斷進(jìn)步和革新，抗體藥物也不斷朝著免疫原性更低、人體相容性更好、成本更低等方向發(fā)展。因此，加強(qiáng)可轉(zhuǎn)化底層技術(shù)的基礎(chǔ)研究，不斷創(chuàng)新抗體技術(shù)等關(guān)鍵核心技術(shù)，提升創(chuàng)新藥物研發(fā)技術(shù)平臺(tái)能力建設(shè)，不斷將變革性新技術(shù)應(yīng)用于抗體等藥物的研發(fā)，對(duì)推動(dòng)我國抗體藥物自主研發(fā)乃至新藥創(chuàng)制具有重要意義。

4.1 加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，提高源頭創(chuàng)新能力

目前我國進(jìn)入臨床研究的創(chuàng)新藥物多為國外已知靶點(diǎn)和先導(dǎo)化合物的跟蹤性創(chuàng)新藥物，基礎(chǔ)研究薄弱是我國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展長期受制于人的根本原因之一。因此，包括抗體藥物研發(fā)在內(nèi)的新藥研發(fā)要主動(dòng)對(duì)接科技前沿新突破，持續(xù)加強(qiáng)新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證、藥物作用的新機(jī)制等基礎(chǔ)研究，提高我國新藥創(chuàng)制的基礎(chǔ)研究水平，逐步掌握創(chuàng)新引領(lǐng)的主動(dòng)權(quán)，從模仿創(chuàng)新轉(zhuǎn)變?yōu)樵谀承┓较蛏蠈?shí)現(xiàn)原始創(chuàng)新，全面提高源頭創(chuàng)新能力。

4.2 加強(qiáng)制約發(fā)展的關(guān)鍵核心技術(shù)突破，全面提升核心競爭力

關(guān)鍵核心技術(shù)對(duì)優(yōu)化新藥創(chuàng)制體系、促進(jìn)制藥產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)以及實(shí)現(xiàn)自主可控具有至關(guān)重要的戰(zhàn)略意義?？贵w藥物研發(fā)經(jīng)歷了多克隆抗體技術(shù)、雜交瘤單克隆抗體技術(shù)到現(xiàn)在的單細(xì)胞測序技術(shù)等一系列技術(shù)迭代，顯著提高了藥物研發(fā)效率。因此，要圍繞制約抗體藥物研發(fā)技術(shù)、抗體衍生物研發(fā)技術(shù)（如雙功能抗體、納米抗體和抗體支架展示技術(shù)等）以及抗體進(jìn)一步應(yīng)用技術(shù)（如嵌合抗原受體T細(xì)胞技術(shù)、嵌合抗原受體NK細(xì)胞技術(shù)和抗體藥物偶聯(lián)物等）等新藥創(chuàng)制不同階段的關(guān)鍵核心技術(shù)，結(jié)合我國新藥創(chuàng)制現(xiàn)狀，突破共性關(guān)鍵技術(shù)，開展高通量藥物篩選新技術(shù)、高通量測序技術(shù)、人源化動(dòng)物模型構(gòu)建技術(shù)、人工智能藥物設(shè)計(jì)技術(shù)、智能藥物制備技術(shù)、質(zhì)控技術(shù)和佐劑研發(fā)技術(shù)等關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)，全面提升我國新藥創(chuàng)制的核心競爭力。

4.3 避免同質(zhì)化競爭，形成產(chǎn)品專利保護(hù)樹

目前我國藥物研發(fā)同質(zhì)化競爭嚴(yán)重，聚焦單一靶點(diǎn)往往有幾十種以上的在研藥物，導(dǎo)致“多、小、散”現(xiàn)象凸顯。因此，在立足自主創(chuàng)新、尋找差異化的同時(shí)，要高度重視知識(shí)產(chǎn)權(quán)工作，加大對(duì)原始創(chuàng)新的激勵(lì)保護(hù)，用知識(shí)產(chǎn)權(quán)鑄造發(fā)展利器。在抗體等藥物整個(gè)研究與開發(fā)的全過程，重視對(duì)研發(fā)技術(shù)、產(chǎn)品組方、活性成分、質(zhì)控方法、制劑及新的醫(yī)藥用途等方面實(shí)施全方位的專利保護(hù)和布局，形成產(chǎn)品專利保護(hù)樹，穩(wěn)固主要核心產(chǎn)品的市場地位。