朱海珍 王鑫濤 許艷 田仁云 鄧日林 王靜靜 陳生穩(wěn) 李慧逸

摘? ?要：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路在肝細(xì)胞癌中處于異常激活的狀態(tài)，并且促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展. 在肝細(xì)胞癌中，熱休克蛋白HSP70結(jié)合蛋白21（Hsp70 binding protein 21，HBP21）處于低表達(dá)狀態(tài)，過表達(dá)HBP21顯著誘發(fā)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡. 利用qRT-PCR技術(shù)檢測肝癌組織中HBP21的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)癌組織中HBP21的mRNA水平要低于癌旁組織. 用胰島素處理肝癌細(xì)胞Huh7以激活細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號通路，采用qRT-PCR技術(shù)和蛋白免疫印跡實驗檢測細(xì)胞內(nèi)HBP21的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，隨著胰島素處理時間的延長，HBP21的mRNA水平和蛋白水平都呈現(xiàn)下降趨勢. 在Huh7內(nèi)過表達(dá)HBP21顯著抑制胰島素誘導(dǎo)的AKT和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的磷酸化;通過泛素化實驗和蛋白免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，HBP21不影響AKT的K48及K63位泛素化及人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）的蛋白水平. 利用抑制劑LY294002處理Huh7細(xì)胞，確定HBP21作用于PI3K/AKT信號通路. 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HBP21不影響IRS1和IRS2的mRNA水平，而是抑制胰島素受體β亞基（insulin receptor beta，IRβ）的磷酸化進(jìn)而影響PI3K/AKT信號通路的活化. 在Huh7細(xì)胞中，HBP21抑制肝癌細(xì)胞中異?；罨腜I3K/AKT發(fā)揮著重要作用. HBP21在肝細(xì)胞癌中的缺失表達(dá)，以及其抑制PI3K/AKT信號通路使其有可能成為潛在治療癌癥的靶點.

關(guān)鍵詞： HBP21;肝細(xì)胞癌;PI3K/AKT/mTOR信號通路;PTEN;酶

中圖分類號：Q71? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

HBP21 Inhibiting Insulin-induced PI3K/AKT Signal Pathway Mechanism

ZHU Haizhen1，2，3?，WANG Xintao1，2，3，XU Yan1，2，3，TIAN Renyun1，2，3，

DENG Rilin1，2，3，WANG Jingjing1，2，3，CHEN Shengwen1，2，3，LI Huiyi1，2，3

（1. College of Biology，Hunan University，Changsha 410082，China;

2. Institute of Pathogen Biology and Immunology，Hunan University，Changsha 410082，China;

3. State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics，Hunan University，Changsha 410082，China）

Abstract：The phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B （PI3K/AKT） signaling pathway is abnormally activated in hepatocellular carcinoma and promotes the occurrence and development of cancer. In hepatocellular carcinoma， the heat shock protein Hsp70 binding protein 21（Hsp70 binding protein 21） is in a low expression state， and overexpression of HBP21 significantly induces cancer cell apoptosis. Using qRT-PCR technology to detect the mRNA level of HBP21 in liver cancer tissues， it is found that the mRNA level of HBP21 in cancer tissues is lower than that in adjacent tissues. Hepatocellular carcinoma cell Huh7 is treated with insulin to activate the PI3K/AKT signaling pathway in the cells， and the transcription and translation levels of HBP21 in the cells are detected by qRT-PCR technology and Western blotting. With the prolonged insulin treatment time， the mRNA and protein levels of HBP21 show a downward trend. Overexpression of HBP21 in Huh7 cells significantly inhibits insulin-induced phosphorylation of AKT and mammalian target of rapamycin（mTOR）;through ubiquitination and western blotting experiments， it is found that HBP21 does not affect AKT K48 and K63 ubiquitination as well as phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten（PTEN） protein levels. The inhibitor LY294002 was used to treat Huh7 cells to confirm that HBP21 acts on the PI3K/AKT signaling pathway. Further research shows that HBP21 does not affect the mRNA levels of IRS1 and IRS2， but inhibits the phosphorylation of insulin receptor beta（IRβ） and affects the activation of the PI3K/AKT signaling pathway. In Huh7 cells，HBP21 plays an important role in inhibiting abnormal activation of PI3K/AKT in liver cancer cells. The lack of expression of HBP21 in hepatocellular carcinoma and its inhibition of PI3K/AKT signaling pathway make it possible to become a potential target for cancer treatment.

Key words：Hsp70 binding protein 21（HBP21）;hepatocellular carcinoma（HCC）;PI3K/AKT/mTOR signaling pathway;phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten（PTEN）;enzymes

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第六大常見惡性腫瘤，位居全球癌癥相關(guān)死亡的第四位，一般認(rèn)為肝癌的發(fā)生與慢性乙型和丙型肝炎病毒感染、酗酒或飲食中接觸黃曲霉毒素有關(guān)[1-2]. 像許多其他癌癥一樣，肝細(xì)胞表型逐漸演變?yōu)榘l(fā)育不良的肝細(xì)胞，最后演變?yōu)楦伟?，并積累了遺傳和表觀遺傳改變. 盡管人們已經(jīng)對HCC的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了較深入的研究，但涉及HCC發(fā)病的詳細(xì)分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究.

胰島素（insulin）與其受體（IR）的結(jié)合在哺乳動物細(xì)胞中啟動了一系列復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)[3]，胰島素結(jié)合并激活I(lǐng)Rβ亞單位酪氨酸激酶，使IR底物蛋白磷酸化. IRS1和IRS2這兩個主要底物與磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）通路和Ras-絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路有關(guān)， PI3K/AKT通路負(fù)責(zé)胰島素的大部分代謝活動，Ras- MAPK通路與PI3K通路協(xié)同控制細(xì)胞增殖[4-5]. IR可以磷酸化至少6種已知的底物蛋白，它們能夠與5種主要形式的PI3K調(diào)節(jié)亞基相互作用[6-7]. PI3K被IR磷酸化激活后，將磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）磷酸化生產(chǎn)磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），活化后的PIP3進(jìn)而激活丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1（PDK1），激活后的PDK1發(fā)揮蛋白激酶功能，進(jìn)而激活已知的AKT的3種亞型[8-10].

PI3K/AKT信號通路參與控制細(xì)胞生長和增殖，并在不同的癌癥類型中表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)性激活，PI3K活性受多種癌基因和生長因子受體的刺激，PI3K信號通路的活化被認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志[11-12]. 最近對人類癌癥基因組的研究結(jié)果顯示，在廣泛的人類癌癥中，PI3K通路的許多成分經(jīng)常成為種系或體細(xì)胞突變的靶點，這些靶點已成為癌癥干預(yù)治療最有吸引力的靶點之一[13-14].

熱休克蛋白HSP70結(jié)合蛋白21（Hsp70 binding protein 21，HBP21）又叫TTC36，是TPR基序家族的新成員，是熱休克蛋白70（HSP70）的分子伴侶，研究發(fā)現(xiàn)特別是在熱和化療藥物治療等不利條件下，HBP21可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡. HBP21作為HSP70的伴侶，可以抑制HSP70與Bax的相互作用，增加Bax蛋白從胞漿到線粒體的轉(zhuǎn)位，進(jìn)而增加細(xì)胞色素c的釋放，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-16].? 研究表明，HSP70的上調(diào)可以抵抗各種不利條件，并抑制癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)PI3K/AKT通路的活化[17]. 到目前為止，HBP21是否參與調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路尚不清楚.

本文研究了肝細(xì)胞癌中低表達(dá)的HBP21與肝細(xì)胞癌中異常激活的PI3K/AKT信號通路之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HBP21參與調(diào)控胰島素誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路，此發(fā)現(xiàn)或許為未來靶向PI3K/AKT信號通路，治療癌癥提供新的理論依據(jù).

1? ?材料與方法

1.1? ?細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

Huh7細(xì)胞購自American Type Culture Collection; HEK293T細(xì)胞購買于武漢博士德公司. Huh7細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞在含有10% 胎牛血清、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素和鏈霉素的杜爾貝科改良鷹培養(yǎng)基（dulbeccos modified eagle medium，DMEM）中增殖. 所有細(xì)胞系在含5%體積 CO2加濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中保持37 ℃進(jìn)行培養(yǎng). 肝癌組織樣品從湖南省腫瘤醫(yī)院獲取.

1.2? ?實驗試劑

DMEM培養(yǎng)基底液（美國Gibco公司），LY294002（10 μmol/mL）抑制劑（美國CST公司），Insulin（100 mIU/mL）（美國CST公司），MG132（美國Sigma 公司），DMSO（美國Sigma 公司），10 × PBS（實驗室配置），胰蛋白酶（Invitrogen 公司），免疫沉淀磁珠protein A G（德國Merck 公司），2× Laemmli Buffer（Bio-Rad 公司），β-巰基乙醇（Bio-Rad 公司），Trizol 試劑（Invitrogen 公司），RT-PCR試劑盒（Invitrogen 公司），SYBR Green 定量試劑盒（Taraka 公司），全細(xì)胞裂解液RIPA Buffer（Thermo 公司），蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑（德國Merck 公司），mTOR/p-mTOR抗體（美國Santa公司），AKT/p-AKT抗體（美國CST公司），HBP21（英國Abcam公司），PTEN抗體（美國CST公司），IRβ/p-IRβ（美國CST公司），β-actin/Flag/V5（美國Sigma 公司），goat-anti-Mouse/goat-anti-Rabbit（美國Sigma 公司），質(zhì)粒提取試劑盒（上海生工），膠回收試劑盒（上海生工）.

1.3? ?實驗儀器及材料

CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，細(xì)胞培養(yǎng)皿（美國Corning），細(xì)胞計數(shù)板（Bio-Rad 公司），移液管，細(xì)菌培養(yǎng)箱，37 ℃恒溫水浴鍋，37 ℃恒溫?fù)u床7500熒光定量儀器，聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），濾紙，Eppendorf? PCR儀器，Eppendorf 移液槍，化學(xué)發(fā)光成像儀（Bio-Rad 公司），qRT-PCR 八聯(lián)管，4 ℃低溫高速離心機(jī)，電泳槽（Bio-Rad 公司）.

1.4? ?實驗方法

1.4.1? ?HBP21和AKT質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

從美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information Search database，NCBI）找到相關(guān)基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)（Sequence coding for aminoacids in protein，CDS），利用Primer 5.0軟件設(shè)計基因的前后引物. 提取Huh7細(xì)胞的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照設(shè)定好的程序通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀器擴(kuò)增目的基因. 通過瓊脂糖凝膠電泳實驗驗證目的基因的特異性，并對凝膠中的特異性條帶進(jìn)行膠回收實驗. 對膠回收得到的目的基因與載體（P3xFlag-CMV-vector或PcDNA3.1a-V5-vector）進(jìn)行雙酶切實驗，將酶切后的目的基因與載體通過T4 DNA連接酶進(jìn)行連接得到完整的質(zhì)粒. 采用感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）對質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗，挑取生長在含有抗生素培養(yǎng)皿上的單個細(xì)菌菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，通過質(zhì)粒提取試劑盒將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌落進(jìn)行DNA提取，對核酸進(jìn)行酶切與鑒定實驗，并提取DNA 送入公司測序. 質(zhì)粒HA-K48和HA-K63由北京大學(xué)蔣正凡教授提供.? HBP21和AKT的前引物和后引物序列見表1.

1.4.2? ?實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

利用TRizol裂解細(xì)胞，按照試劑盒流程提取細(xì)胞RNA，通過RT-PCR試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照SYBR Green試劑盒說明書對cDNA樣品進(jìn)行稀釋. 每個八連管中加入2 μL cDNA模板、上下游引物各0.2 μL、5 μL SYBR試劑、2.6 μL 去離子水，每個樣品做3組重復(fù)實驗，最后將裝有樣品的八連管放入儀器內(nèi)進(jìn)行定量實驗. 定量PCR引物序列見表2.

1.4.3? ?蛋白免疫印跡實驗

處理細(xì)胞之前，先用1×PBS清洗細(xì)胞2～3遍，清洗完細(xì)胞之后，使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的全細(xì)胞裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解，細(xì)胞裂解在冰上操作，裂解細(xì)胞時間為 5 min. 裂解完成之后，利用特有的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)皿中刮下，使用移液槍將裂解液全部轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，冰上靜置20 min. 將全細(xì)胞裂解液放入提前降溫到4 ℃的離心機(jī)中，13 200 r/min，離心 15 min. 將蛋白樣品與上樣緩沖液（2× Laemmli Buffer）同比例混勻，放入金屬浴中，100 ℃ 煮5 min，使蛋白發(fā)生變性. 利用聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PEG）進(jìn)行蛋白跑膠實驗，不同目的蛋白選用不同的抗體進(jìn)行孵育，最后利用化學(xué)發(fā)光成像儀對樣品進(jìn)行曝光處理.

1.4.4? ?泛素化實驗

在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pV5-vector、pV5-HBP21、pFlag-AKT1、pHA-ub或者pHA-K48O和pHA- K 63O 42 h之后，再用MG132（25 μmol/mL）處理6 h，然后通過蛋白免疫印跡實驗分析相關(guān)蛋白.

1.4.5? ?數(shù)據(jù)分析

采用學(xué)生t檢驗（Student's t-test）對定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對照組和實驗組之間的顯著性差異程度可以用P值表示，其中P值小于0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義. P值小于0.05，用“*”號表示;P值小于0.01，用“**”號表示;P值小于0.001，用“***”表示. 所有的“*”號在圖柱中表示實驗組和對照組之間有顯著性差異.

2? ?結(jié)? ?果

2.1? ?HBP21在肝癌組織中低表達(dá)

有研究表明，HBP21在癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，HBP21作為HSP70的伴侶，可以抑制HSP70與Bax的相互作用，增加Bax蛋白從細(xì)胞質(zhì)到線粒體的轉(zhuǎn)位，進(jìn)而增加細(xì)胞色素c的釋放，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]. 為了檢測HBP21在肝癌組織中的表達(dá)情況，本文收集了9例原發(fā)性肝癌與癌旁組織，借助qRT-PCR技術(shù)檢測樣本組織中HBP21基因的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中HBP21的mRNA水平明顯低于其對應(yīng)的癌旁組織（雖然第5和第6組的定量數(shù)據(jù)存在一定的誤差，但仍具有統(tǒng)計學(xué)意義，癌組織中HBP21的mRNA水平明顯低于相對應(yīng)的癌旁組織），這說明HBP21在肝癌細(xì)胞中缺失表達(dá)，定量結(jié)果如圖1（a）所示. HSP70的上調(diào)可以抵抗各種不利條件，通過促進(jìn)PI3K/AKT通路的活化抑制癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]. 有研究報道PI3K/AKT信號通路在癌癥中經(jīng)常處于異常激活的狀態(tài)[2]，因此，推測在肝癌中低表達(dá)的HBP21和HSP70一樣參與調(diào)控PI3K/AKT信號通路. 胰島素作為一種生長因子與其受體結(jié)合能夠激活許多信號分子，其中PI3K/AKT信號通路作為其下游重要的信號通路能夠在胰島素的作用下發(fā)生顯著性活化[6]. 為研究HBP21與胰島素誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路之間是否存在聯(lián)系，用胰島素處理Huh7細(xì)胞，檢測HBP21的mRNA水平和蛋白水平，隨著處理時間的延長，HBP21的mRNA水平呈下降趨勢，尤其是在處理30 min后，現(xiàn)象更為明顯，結(jié)果如圖1（b）所示. 用胰島素分別處理Huh7細(xì)胞，隨著處理時間的延長，HBP21的蛋白水平逐漸降低，尤其是胰島素處理細(xì)胞30 min后，HBP21的蛋白水平下調(diào)趨勢更為明顯，結(jié)果如圖1（c）所示. 綜上所述，肝癌組織中低表達(dá)的HBP21可能與胰島素誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路之間存在聯(lián)系.

2.2? ?HBP21抑制胰島素誘導(dǎo)的AKT和mTOR的

活化

研究表明，在20%～60%的人類HCC中激活了5個主要途徑，包括PI3K/AKT、Myc、Wnt/β-catenin、Hedgehog和Met途徑[2]. 胰島素能激活PI3K/AKT信號通路，胰島素及其受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用得到了臨床證據(jù)的支持，有研究表明，即使低劑量的胰島素就可促進(jìn)癌細(xì)胞生長[19-20].

為了研究HBP21是否調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)的PI3K/AKT信號通路，首先構(gòu)建HBP21質(zhì)粒，然后在肝癌細(xì)胞Huh7內(nèi)過表達(dá)HBP21質(zhì)粒，在胰島素的作用下，研究HBP21對PI3K/AKT信號通路的影響. 在Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HBP21質(zhì)粒48 h后，采用不同時間點用Insulin（100 mIU/mL）處理Huh7細(xì)胞，實驗發(fā)現(xiàn)，隨著胰島素處理時間的延長，AKT Ser473位點的磷酸化逐漸增加，但是轉(zhuǎn)染了HBP21質(zhì)粒的實驗組與對照組相比，胰島素誘導(dǎo)的AKT的磷酸化明顯被抑制，尤其在處理30 min后抑制更加明顯，實驗結(jié)果見圖2（a）. 這一實驗結(jié)果表明，HBP21抑制了胰島素誘導(dǎo)的AKT磷酸化. 為了研究HBP21是否影響AKT下游mTOR的活化，同樣地，在Huh7細(xì)胞中過表達(dá)HBP21質(zhì)粒，然后用Insulin（100 mIU/mL）處理細(xì)胞，處理時間分別為0 min、15 min、30 min，實驗發(fā)現(xiàn)，隨著胰島素處理時間的延長，mTOR磷酸化在逐漸增加，但是轉(zhuǎn)染了HBP21質(zhì)粒的實驗組與對照組相比，胰島素誘導(dǎo)的AKT下游的mTOR磷酸化明顯被抑制，尤其在處理30 min后抑制更加明顯，實驗結(jié)果見圖2（b）. 這一實驗結(jié)果表明，HBP21可抑制AKT下游的mTOR磷酸化. 綜合以上結(jié)果，說明HBP21參與調(diào)控胰島素誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路的活化.

2.3? ?HBP21不影響PTEN的蛋白水平及AKT的泛

素化

PTEN作為一種重要的抑癌基因，它可以抑制PI3K/AKT信號通路的活性，PTEN發(fā)揮它的作用是通過其磷酸酶活性將磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）變成磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2），因此不能使下游AKT發(fā)生磷酸化從而抑制AKT的活化[21-22]. 為了探究HBP21是否通過影響PTEN進(jìn)而影響AKT的磷酸化，我們在Huh7細(xì)胞中過表達(dá)HBP21質(zhì)粒，然后用胰島素處理細(xì)胞，通過蛋白免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)HBP21對PTEN的蛋白水平并沒有直接的影響，實驗結(jié)果見圖3（a）. 已知AKT磷酸化的充分條件首先是要其發(fā)生K63位的泛素化激活，而K48位是泛素化降解[23]. 為了驗證HBP21對AKT磷酸化影響的具體機(jī)制，首先研究了HBP21對AKT的泛素化的影響. 在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒V5-vector 、V5-HBP21、Flag-AKT1、HA-ub、HA-K48O和HA-K63O 42 h，再用MG132（25 μmol/mL）處理6 h后收集蛋白，通過實驗發(fā)現(xiàn)，HBP21對AKT的K48及K63位泛素化都沒有明顯的影響，實驗結(jié)果見圖3（b），這說明HBP21對AKT磷酸化的影響并非是對其泛素化的影響. 綜合以上結(jié)果說明，HBP21并非是通過影響AKT的泛素化以及PTEN的蛋白水平來抑制AKT的活化.

2.4? ?HBP21 作用于PI3K/AKT信號通路

PI3K是一種激酶，當(dāng)它被胰島素誘導(dǎo)激活后，可進(jìn)一步激活下游的AKT及mTOR. LY294002 是PI3K的高選擇性抑制劑，明顯抑制PI3K激酶的酶活，使其不能發(fā)揮激酶功能[24]. 使用抑制劑處理Huh7細(xì)胞，首先在Huh7細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染HBP21質(zhì)粒44 h，然后用PI3K的抑制劑LY294002（10 μmol/mL）再處理細(xì)胞4 h，最后用胰島素處理細(xì)胞30 min. 根據(jù)蛋白結(jié)果圖發(fā)現(xiàn)，在胰島素處理細(xì)胞30 min后，AKT的磷酸化水平有明顯升高，并且抑制劑能夠明顯抑制胰島素誘導(dǎo)的AKT和mTOR的磷酸化，實驗結(jié)果見圖4（a）. 在無胰島素誘導(dǎo)下，HBP21也可明顯抑制AKT的磷酸化，而且抑制劑增強了HBP21對AKT磷酸化的抑制作用，實驗結(jié)果見圖4（b）. 綜合以上實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HBP21作用于胰島素誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路，抑制AKT的磷酸化，因此，推測HBP21對AKT的影響可能是作用于PI3K的上游分子.

2.5? ?HBP21抑制胰島素受體IRβ的磷酸化

胰島素與其受體（IR）的結(jié)合在哺乳動物細(xì)胞中啟動了一系列復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng). 胰島素結(jié)合并激活I(lǐng)Rβ亞單位酪氨酸激酶，使IR底物蛋白磷酸化[25]. IRS1和IRS2這兩個主要底物與PI3K-AKT通路有關(guān)，并且PI3K-AKT通路負(fù)責(zé)胰島素的大部分代謝活動[4-5]. 通過前面的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBP21抑制胰島素誘導(dǎo)PI3K/AKT通路中的AKT磷酸化，推測HBP21可能是通過作用于AKT的上游分子影響AKT磷酸化的影響，因此，主要研究HBP21對該信號通路上游分子IRS1/2和IRβ的影響. 在Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HBP21質(zhì)粒48 h后，再以胰島素處理細(xì)胞30 min，收集細(xì)胞RNA，檢測IRS1/2的mRNA水平. 通過對熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在胰島素處理細(xì)胞 30 min后，發(fā)現(xiàn)HBP21對IRS1和IRS2的mRNA水平并沒有影響，實驗結(jié)果見圖5（a）和（b）. HBP21質(zhì)粒在Huh7細(xì)胞中的過表達(dá)效果得到驗證，見圖5（c），這一結(jié)果表明HBP21可能不是通過作用于IRS1和IRS2的mRNA水平影響AKT的磷酸化.

由上述分析可知，推測HBP21可能影響了胰島素受體IRβ亞基的活性. 為了研究HBP21是否影響AKT上游IRβ的活化，在Huh7細(xì)胞中過表達(dá)HBP21質(zhì)粒，然后用胰島素分別處理0 min、15 min、30 min，實驗發(fā)現(xiàn)，隨著胰島素處理時間的延長，IRβ磷酸化在逐漸增加，但是轉(zhuǎn)染了HBP21質(zhì)粒的實驗組與對照組相比，胰島素誘導(dǎo)的AKT上游的IRβ磷

酸化明顯被抑制，尤其是處理30 min后抑制更加明顯，相應(yīng)地，HBP21同樣抑制了AKT的磷酸化，實驗結(jié)果見圖5（d）. 綜合以上實驗結(jié)果，可以得出結(jié)論，HBP21通過抑制胰島素受體（IRβ）磷酸化，進(jìn)而影響其下游AKT磷酸化.

3? ?結(jié)? ?論

通過熒光定量PCR技術(shù)檢測病人肝癌和癌旁組織中HBP21的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中HBP21的mRNA水平異常低于癌旁組織. 用胰島素處理肝癌細(xì)胞Huh7，目的是激活PI3K/AKT信號通路，發(fā)現(xiàn)隨著胰島素處理時間的延長，HBP21的mRNA和蛋白水平都呈現(xiàn)低表達(dá)趨勢. 將體外構(gòu)建的HBP21質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)Huh7細(xì)胞，通過蛋白免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，HBP21顯著抑制PI3K/AKT信號通路中AKT絲氨酸473位點的磷酸化及AKT下游mTOR的磷酸化. 進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，HBP21抑制AKT的磷酸化的功能并不是通過影響PTEN的蛋白水平和AKT的泛素化來實現(xiàn)的. 采用LY294002抑制劑處理Huh7細(xì)胞，確定了HBP21作用于PI3K/AKT信號通路. 通過一系列實驗發(fā)現(xiàn)，HBP21通過抑制胰島素受體IRβ的磷酸化，進(jìn)而影響其下游的AKT的磷酸化.

本研究闡述了HBP21抑制PI3K/AKT 信號通路的機(jī)制，豐富了HBP21作為抑癌基因的功能，但仍存在一些亟待解決的問題. 例如HBP21是如何影響IRβ的磷酸化;是否存在其他蛋白協(xié)同HBP21參與調(diào)控PI3K/AKT信號通路;HBP21是否具有磷酸酶的功能，這些問題需要進(jìn)一步通過實驗來解決.

本文的研究為治療肝癌提供了新的思路，HBP21在肝細(xì)胞癌中的缺失表達(dá)及其抑制PI3K/AKT的活化有可能成為潛在治療癌癥的靶點.

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