趙文靜 惠林沖 徐衛(wèi)平 蘇文英 于守榮

摘要：對(duì)加拿大一枝黃花上的白粉菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分析，通過(guò)觀察記錄病害癥狀和發(fā)病過(guò)程，并在顯微鏡下觀察病原菌形態(tài)特征，用繪圖儀繪制病原菌顯微圖片;采用試劑盒法提取病原菌總基因組 DNA，PCR 擴(kuò)增其 rDNA-ITS序列并測(cè)序，并通過(guò)MEAG 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹推演系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，在分子水平鑒定該菌種并比較其與其他白粉菌菌種的親緣關(guān)系。結(jié)果表明，供試菌株與寄主為加拿大一枝黃花的MH333274（歐洲）、KC513763（韓國(guó)）菌株聚于同一分支，親緣關(guān)系最近。這是國(guó)內(nèi)首次對(duì)加拿大一枝黃花白粉病的記錄，該白粉菌對(duì)加拿大一枝黃花的生長(zhǎng)、蔓延有一定影響，對(duì)加拿大一枝黃花的研究有利于從生態(tài)和生物學(xué)的角度減輕其對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的影響。

關(guān)鍵詞：白粉菌;加拿大一枝黃花;分子鑒定;形態(tài)學(xué)鑒定

中圖分類號(hào)：S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）12-0072-03

收稿日期：2020-09-28

基金項(xiàng)目：江蘇省連云港市財(cái)政專項(xiàng)（編號(hào)：QNJJ1910）

作者簡(jiǎn)介：趙文靜（1991—），女，江蘇贛榆人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事植物病理學(xué)和植物育種研究。E-mail：ZWJ6691@163.com。

通信作者：于守榮，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail：lygysr@163.com。

加拿大一枝黃花（Solidago canadensis Linn.）是菊科多年生草本植物，原產(chǎn)于北美，1935年被作為觀賞植物引進(jìn)，后逸為野生雜草。由于其繁殖能力強(qiáng)，傳播速度快，適應(yīng)能力強(qiáng)，生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯，在國(guó)內(nèi)迅速傳播蔓延，已經(jīng)成為對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅的惡性雜草。加拿大一枝黃花主要生長(zhǎng)在河灘、荒地、路邊、農(nóng)田、坡地等，與周圍植物或農(nóng)作物爭(zhēng)光、爭(zhēng)水、爭(zhēng)肥料，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和生物多樣性造成了嚴(yán)重破壞和威脅，目前已廣泛分布在我國(guó)的華東、華南、華中和西南等地區(qū)的十多個(gè)省份，被列入《中國(guó)外來(lái)入侵物種名單》。調(diào)查表明，加拿大一枝黃花已遍布江蘇全省各地，并呈由北向南逐漸嚴(yán)重的分布特征[1-5]。

2018—2020年在白粉菌普查中，筆者發(fā)現(xiàn)加拿大一枝黃花白粉菌[Golovinomyces asterum （Schwein.） U. Braun var. solidaginis U. Braun]。經(jīng)觀測(cè)表明，加拿大一枝黃花白粉菌對(duì)宿主的生長(zhǎng)和發(fā)育有一定的抑制和控制作用。由于該菌屬專性寄生菌，對(duì)其他近緣植物沒有影響，所以是尋找利用生物手段控制該惡性雜草的一種可能途徑和方法。該菌在我國(guó)屬于首次發(fā)現(xiàn)，未見系統(tǒng)報(bào)道和相關(guān)研究。為明確加拿大一枝黃花白粉菌的病原歸屬和發(fā)病特征，對(duì)該菌的發(fā)生分布情況和生物學(xué)形態(tài)特征等進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查和研究，并結(jié)合rDNA-ITS序列分析，對(duì)該菌進(jìn)行菌原鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

2018—2020年對(duì)江蘇省13個(gè)市的加拿大一枝黃花白粉菌發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，期間在各個(gè)地區(qū)共采集11份樣本（標(biāo)本），采集收集樣本上的菌絲體和分生孢子5份，于2019年進(jìn)行分子鑒定。

1.2 病害癥狀觀測(cè)和危害情況調(diào)查

觀測(cè)加拿大一枝黃花白粉菌癥狀，記錄病害對(duì)加拿大一枝黃花的危害程度。

1.3 病原鑒定

1.3.1 病原菌形態(tài)觀測(cè)

用普通載玻片，以蒸餾水作為懸載劑，在顯微鏡（OlympusCX21）下觀測(cè)病原菌形態(tài)特征、測(cè)量大小，用繪圖儀（OlympusU-DA）繪制病原菌顯微圖片。

1.3.2 病原菌rDNA-ITS序列分析

利用真菌基因組提取試劑盒提取加拿大一枝黃花白粉菌的基因組DNA。使用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）;ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)菌株進(jìn)行序列擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：1 μL Taq Plus酶、5 μL 10×Taq Plus Buffer、上下游引物各 1 μL、模板1 μL，ddH2O定容至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂凝膠電泳檢驗(yàn)，樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將所得到的核苷酸序列上傳至GenBank獲得序列號(hào)。在NCBI里進(jìn)行同源性比較，利用MEGA 5.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 檢驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)為 1 000 次[6-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀及發(fā)病過(guò)程

加拿大一枝黃花白粉菌菌絲體葉兩面生，也生于莖、花穗等部位，初為白色圓形或無(wú)定形斑點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)展連片并布滿全葉，葉面均勻覆蓋一層明顯的白粉層，展生，存留或近存留（圖1）。通常病害由中下部葉片逐漸向上葉片蔓延，中后期可均勻覆蓋全株葉片，嚴(yán)重時(shí)葉片因失水等枯黃而死（圖2）。根據(jù)加拿大一枝黃花群落的生長(zhǎng)分布情況，病害常呈點(diǎn)線、點(diǎn)片或連片發(fā)生，后期受感染的植株花穗生長(zhǎng)明顯遲緩和減少，葉片枯死，個(gè)別可致植株枯死（圖3）。一般情況下，病害在該地區(qū)4月開始發(fā)病，由南向北時(shí)間逐漸推遲，5月進(jìn)入發(fā)病高峰，一直持續(xù)到夏季高溫來(lái)臨之前，夏季病害停止發(fā)展或緩慢發(fā)展（圖4）。該地區(qū)加拿大一枝黃花白粉菌以無(wú)性階段越冬和越夏，沒有發(fā)現(xiàn)有性階段產(chǎn)生。

2.2 病原菌形態(tài)學(xué)特征

菌絲無(wú)色，光滑，粗4～8 μm，附著胞乳頭形;分生孢子梗腳胞柱狀，直或基部略彎曲，光滑，上下近等粗，（44～100） μm×（9～12） μm，上接1～3個(gè)細(xì)胞;分生孢子串生，橢圓形、卵橢圓形、卵形，無(wú)色，（28～43）×（17～22） μm，長(zhǎng)寬比為1.4～2.3，平均為1.7;未見有性階段產(chǎn)生（圖5）。將以上結(jié)果與白粉菌鑒定手冊(cè)比對(duì)，符合白粉菌的描述[12-13]。

2.3 分布情況

根據(jù)調(diào)查，江蘇省13個(gè)市：蘇州、無(wú)錫、常州、南京、鎮(zhèn)江、揚(yáng)州、南通、泰州、鹽城、淮安、宿遷、徐州和連云港均有加拿大一枝黃花生長(zhǎng)分布，除了徐州、連云港2個(gè)城市到目前沒有采集到加拿大一枝黃花白粉菌病株外，其他11個(gè)城市均有白粉菌發(fā)生。其中，淮河以南地區(qū)發(fā)病較以北地區(qū)發(fā)病重且普遍，以蘇南地區(qū)最重，徐州、宿遷、淮安、連云港地區(qū)最輕，與寄主在不同地區(qū)的氣候和發(fā)生數(shù)量相關(guān)。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

通過(guò) rDNA ITS基因序列擴(kuò)增和測(cè)序，獲得大小約為 532 bp，登錄號(hào)為 MT929350的序列。將獲得的序列與 GenBank 中的白粉菌屬不同來(lái)源病原菌的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析，供試菌株與寄主為加拿大一枝黃花的MH333274（歐洲）、KC513763（韓國(guó)）菌株聚于同一分支，說(shuō)明其親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定，確定加拿大一枝黃花白粉菌為Golovinomyces asterum （Schwein.） U. Braun var. solidaginis U. Braun。

3 討論

通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明，加拿大一枝黃花白粉菌是紫菀高氏白粉菌一枝黃花變種（Golovinomyces asterum var. solidaginis），屬于國(guó)內(nèi)白粉菌新記錄種，該菌應(yīng)該是隨著加拿大一枝黃

花進(jìn)入我國(guó)境內(nèi)的，是加拿大一枝黃花的專性寄生菌。觀測(cè)結(jié)果表明，該菌對(duì)加拿大一枝黃花的感病性和致病性都很高，發(fā)病后病害蔓延迅速，菌粉層很快覆蓋葉面和葉背直至整個(gè)植株體。顯著影響植株光合作用，造成葉片失水，并導(dǎo)致葉片逐漸枯黃死亡（圖7），植株生長(zhǎng)、穗花發(fā)育、開花結(jié)實(shí)等都受到明顯影響和抑制，嚴(yán)重時(shí)后期病株不能正常開花結(jié)實(shí)。根據(jù)筆者所在課題組的觀測(cè)，加拿大一枝

黃花上除了一種小型椿象和白粉菌2種病蟲害外，沒有發(fā)現(xiàn)其他病蟲危害。進(jìn)一步研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，白粉菌具有對(duì)加拿大一枝黃花生長(zhǎng)、蔓延的影響和控制其危害的作用，從生態(tài)和生物學(xué)的角度減輕和緩解對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的影響具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉啟新. 江蘇植物志[M]. 南京：江蘇鳳凰科學(xué)技術(shù)出版社，2015.

[2]孫曉方. 淺析入侵植物加拿大一枝黃花的入侵機(jī)理[J]. 園藝與種苗，2020，40（1）：20-22.

[3]左 希，董紅剛，陳銀鳳，等. 揚(yáng)州市邗江區(qū)加拿大一枝黃花發(fā)生現(xiàn)狀及防治對(duì)策[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2020（3）：139-140.

[4]吳承東，江 豐，林玉清，等. 加拿大一枝黃花社會(huì)化防除探索實(shí)踐[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊，2017，37（12）：90-91.

[5]何祖?zhèn)?，?健，張洪泉，等. 化學(xué)除草劑對(duì)加拿大一枝黃花的防除效果試驗(yàn)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2020，768（10）：82，88.

[6]張 菊，張 怡，曹 鵬，等. 艾草白粉病的病原菌鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（8）：178-180.

[7]陸依琳，趙晴雨，彭 學(xué). 2株固氮菌的分離與鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（16）：298-302.

[8]劉 閏，周 暄，邢 帥，等. 百日菊白粉菌的分子檢測(cè)與鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（6）：98-103.

[9]管飄萍，Munkhbayar ???????? E，黃紫貝，等. 茶葉中23株真菌的分離鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（16）：285-290.

[10]文 靜，劉鐵志，趙 冰. 內(nèi)蒙古4種白粉菌的 ITS 序列分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（12）：50-52.

[11]賈橋東，張保全，王衛(wèi)民，等. 煙草白粉病的研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（4）：94-97.

[12]Braun U，Cook R T A. Taxonomic manual of the erysiphales （powdery mildews）[M]. Centraalbureau voor Schimmelcultures 2012：1-707.

[13]鄭儒永，余永年. 中國(guó)真菌志 第一卷：白粉菌目[M]. 北京：科學(xué)出版社，1987：1-552.