侯軍良，馮愛東，劉騰飛，許 怡，張海從，楊 莉

(河北省石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050021)

乙型肝炎病毒( hepatitis B virus，HBV)感染呈世界性流行，全球慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者達(dá)2.57億[1]，我國現(xiàn)有HBV感染例數(shù)保守估計(jì)約有9 300萬，其中CHB確診例數(shù)約為2 000萬[2]。核苷(酸)類似物是目前使用最為廣泛的抗HBV藥物[3]，隨抗HBV治療時(shí)間延長，HBV易在P基因區(qū)產(chǎn)生耐藥突變，影響抗病毒治療效果，引起病情持續(xù)進(jìn)展，增加肝硬化、肝癌、肝功能衰竭及其他并發(fā)癥發(fā)生率[4]，因此在抗HBV治療中進(jìn)行病毒耐藥監(jiān)測對(duì)CHB的治療與預(yù)后具有重要意義?；驕y序是公認(rèn)的基因突變檢測金標(biāo)準(zhǔn)，通過對(duì)HBV耐藥易突變區(qū)域的完整序列進(jìn)行檢測，是判斷病毒核酸堿基是否突變的最直接和最可靠的方法[5]。本研究通過對(duì)石家莊地區(qū)經(jīng)各種核苷(酸)類似物治療的1 157例CHB患者HBV P基因區(qū)進(jìn)行基因測序和分析，探討石家莊地區(qū)CHB患者基因型和核苷(酸)類耐藥突變情況及其臨床意義,為臨床工作者在CHB的診斷及治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年10月—2019年3月在石家莊市第五醫(yī)院就診的CHB患者1 157例，診斷標(biāo)準(zhǔn)采用中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)與中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合制定的《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[6]?；颊呔逊煤塑疹愃莆镞M(jìn)行抗病毒治療,并由于出現(xiàn)病毒反彈而進(jìn)行乙型肝炎耐藥基因測序檢測。

本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 所有患者均無菌采集外周靜脈抗凝血3 mL，3 000 r/min離心5 min，分離血漿用于檢測。

1.2.2采用基因測序技術(shù)進(jìn)行檢測 取處理好的血漿標(biāo)本45 μL采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供的試劑盒在美國ABI公司的7500型熒光定量 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，采用ABI310型遺傳分析儀進(jìn)行HBV基因型及耐藥突變核酸測序檢測，試劑盒由北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司提供，結(jié)果分析應(yīng)用BLAST和DNAstar等軟件將測序結(jié)果與Gen Bank的標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，確定患者感染病毒的基因型，并分析P區(qū)173、180、204、207、213、181、214、215、236、237、238、184、202及250共14個(gè)位點(diǎn)的基因序列，通過提示得出耐藥檢測圖，得出HBV基因耐藥測序結(jié)果(圖1)。

圖1 CHB測序檢測報(bào)告單14個(gè)位點(diǎn)報(bào)告圖

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CHB患者HBV基因分型 檢測結(jié)果顯示，石家莊地區(qū)感染的HBV有B型和C型 2類，C型1 108例(95.765%)，B型49例(4.235%)，以C型為主。

2.2CHB患者不同性別和不同年齡HBV基因分型的分布特征 石家莊地區(qū)CHB患者中HBV基因分型B型和C型分布比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同年齡間HBV基因分型B型和C型分布比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，41～60歲患者HBV基因分型C型占比最高。見表1。

表1 CHB患者HBV基因分型在不同性別及不同年齡間的分布特征 Table 1 Distribution characteristics of HBV genotypes in CHB patients with different genders and different ages (例數(shù)，%)

2.3CHB患者HBV基因突變位點(diǎn)分布特征 1 157例患者中未發(fā)生基因突變172例，單基因位點(diǎn)突變393例，2個(gè)基因位點(diǎn)突變361例，3個(gè)基因位點(diǎn)突變174例，4個(gè)基因位點(diǎn)突變42例，5個(gè)基因位點(diǎn)突變10例，6個(gè)基因位點(diǎn)突變3例，7個(gè)基因位點(diǎn)突變1例，9個(gè)基因位點(diǎn)突變1例；基因型分布特點(diǎn)隨突變位點(diǎn)數(shù)的增多HBV基因分型B型和C型比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 石家莊地區(qū)HBV基因突變位點(diǎn)分布特征Table 2 Distribution characteristics of HBV mutation sites in Shijiazhuang area (例數(shù)，%)

2.4CHB患者HBV基因突變POL/RT區(qū)耐藥突變模式 發(fā)生突變的985例患者共檢出1 889個(gè)突變位點(diǎn)，檢測的14個(gè)基因位點(diǎn)中，M204I/V/S、L180M、A181V/T/S突變率為14個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生突變的前3位，不同基因位點(diǎn)中HBV基因分型B型和C型比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；從比例分布上可見V173L、Y214A、Q215S及T184A/G/I/S四個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生突變的患者基因型均為C型，B型患者中V207I/L/G、M250V/L及P237H這3個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生突變的占比為前3位，分別為8.989%、6.250%及5.714%。見表3。

表3 石家莊地區(qū)HBV基因突變Pol/RT區(qū)耐藥突變模式Table 3 Drug resistance mutation pattern in the POL /RT region of HBV gene mutation in Shijiazhuang area (位點(diǎn)數(shù)，%)

2.5石家莊地區(qū)CHB患者HBV基因耐藥模式 發(fā)生突變的985例患者對(duì)拉米夫定(lamivudine，LAM)，替比夫定(telbivudine，LDT)，阿德福韋酯(adefovir，ADV)及恩替卡韋(entecavir，ETV)四種核苷(酸)類似物耐藥模式共檢出11種，其中對(duì)單一藥物發(fā)生耐藥有3種模式，對(duì)2種藥物發(fā)生耐藥的有4種模式，對(duì)3種藥物發(fā)生耐藥有3種模式，還有一種是對(duì)4種藥物均發(fā)生耐藥。不同耐藥模式患者HBV基因分型B型和C型比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B型患者中占比為前3位分別為對(duì)LAM及LDT耐藥、對(duì)LAM耐藥、對(duì)ADV及ETV耐藥。在C型患者中，對(duì)LAM及ADV耐藥、對(duì)LAM及ETV耐藥、對(duì)LAM、LDT及ADV耐藥、對(duì)LAM、ADV及ETV耐藥這4種耐藥模式占比均為100%。見表4。

表4 石家莊地區(qū)HBV基因耐藥情況Table 4 HBV gene resistance in Shijiazhuang area (例數(shù)，%)

3 討 論

核苷(酸)類似物為CHB患者的抗病毒治療中的常規(guī)治療藥物之一，具有用藥方便、迅速抑制HBV復(fù)制、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，但是由于廣泛、長期、不規(guī)范使用以及治療依從性差等原因，近年發(fā)現(xiàn)各種耐藥變異株出現(xiàn)，使治療達(dá)不到理想的效果，以至于延誤病情[7]。目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)HBV基因型分布存在地域性差異,我國漢族南方以B型為主,北方以C型為主,A型和D型在西藏等部分地區(qū)存在。本研究結(jié)果顯示，1 157例患者中C型1 108例(95.765%),B型49例(4.235%),可見石家莊地區(qū)CHB患者感染的HBV以C型為主,少量為B型,與以前的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[8-9]一致。 本研究結(jié)果顯示，石家莊地區(qū)CHB患者中HBV基因分型B型和C型分布比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同年齡間HBV基因分型B型和C型分布比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，41～60歲患者HBV基因分型C型占比最高。與目前研究認(rèn)為隨年齡增加B型占比下降，C型占比增高的結(jié)論相一致[10]。由于石家莊地區(qū)CHB患者以C型為主，B型占比很低，B型主要流行在南方，石家莊地區(qū)B型患者年齡偏低，可能這些患者去南方打工、求學(xué)等經(jīng)歷而造成B型HBV感染，本地固定的居民則以C型感染為主，可以考慮以后對(duì)這些患者的感染途徑進(jìn)一步收集資料分析，以便指導(dǎo)石家莊地區(qū)HBV的預(yù)防。

本研究1 157例患者中發(fā)生基因位點(diǎn)突變985例，其中單基因位點(diǎn)突變393例，占比最高，雙基因位點(diǎn)突變361例，占比次之，占突變患者的大多數(shù)，另外還有3個(gè)基因位點(diǎn)、4個(gè)基因位點(diǎn)、5個(gè)基因位點(diǎn)、6個(gè)基因位點(diǎn)、7個(gè)基因位點(diǎn)及9個(gè)基因位點(diǎn)的突變，隨基因突變位點(diǎn)增高，患者例數(shù)占比逐漸降低，但基因分型分布特點(diǎn)隨突變位點(diǎn)數(shù)的不同，HBV基因分型B型和C型比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是從比例分布上可見B型多為單位點(diǎn)、雙位點(diǎn)及3位點(diǎn)突變，而4個(gè)位點(diǎn)以上的突變均為C型，所以在石家莊地區(qū)隨基因突變位點(diǎn)增多而C型患者數(shù)占比不斷增高，B型患者數(shù)隨基因突變位點(diǎn)增多而占比不斷降低。與王麟等[11]的研究結(jié)果一致。

對(duì)發(fā)生突變的CHB患者985例所感染的HBV的基因的POL/RT區(qū)的14個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測，分析其耐藥突變模式，共檢出1 889個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生突變，14個(gè)基因位點(diǎn)中，M204I/V/S、L180M、A181V/T/S突變率為前3位，不同基因位點(diǎn)中HBV基因分型B型和C型比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，從分布上可見V173L、Y214A、Q215S及T184A/G/I/S 4個(gè)基因位點(diǎn)的突變只在C型患者中可見，B型患者未發(fā)生這四個(gè)位點(diǎn)的突變，B型患者中V207I/L/G、M250V/L及P237H這3個(gè)位點(diǎn)占比為前3位，可見C型和B型患者出現(xiàn)的基因突變位點(diǎn)還是有一定的差異。

目前對(duì)CHB患者進(jìn)行抗病毒治療常用的核苷(酸)類似物如LAM、ADV、ETV及LDT，無論單一用藥還是聯(lián)合用藥，均取得一定的效果[12-14]。本研究中發(fā)生基因突變的CHB患者均是使用這4種核苷(酸)類似物經(jīng)過一定時(shí)間的抗病毒治療后，病毒核酸發(fā)生不同程度的反彈，經(jīng)過經(jīng)基因測序檢測后，利用軟件對(duì)測序結(jié)果中的突變位點(diǎn)分析患者對(duì)這4種核苷(酸)類似物的耐藥情況。本研究結(jié)果顯示,發(fā)生突變的985例患者中對(duì)LAM、ADV、ETV及LDT四種核苷(酸)類似物發(fā)生耐藥共檢出11種模式，其中有3種形式是對(duì)單一藥物發(fā)生耐藥，分別對(duì)LAM、ADV及ETV發(fā)生耐藥；對(duì)2種藥物發(fā)生耐藥的有4種模式，對(duì)3種藥物發(fā)生耐藥有3種模式，還有一種模式對(duì)4種藥物均發(fā)生耐藥。對(duì)LAM、LDT及ETV 均發(fā)生耐藥540例，其次是對(duì)ADV耐藥213例，位于第3位的是對(duì)4種藥物均耐藥118例，其余8種情況各自占比均未超過5%。這和基因位點(diǎn)的突變結(jié)合分析一致，在14個(gè)基因位點(diǎn)檢測分析中，M204I/V/S占比為34.833%，在突變的基因位點(diǎn)中占比最高，而此基因位點(diǎn)為LAM、ETV及LDT的主要耐藥基因位點(diǎn)[6]，由此可見此基因位點(diǎn)的突變率最高，由此導(dǎo)致石家莊市CHB患者對(duì)LAM、ETV及LDT均發(fā)生耐藥率的原因之一；A181V/T/S占比為12.599%，為第三高基因突變的位點(diǎn)，此基因?yàn)榘l(fā)生ADV耐藥的主要基因；由此可見對(duì)這4種核苷(酸)類似物耐藥情況和基因位點(diǎn)一致。LAM價(jià)格相對(duì)便宜，抑制HBV見效明顯，容易被廣大CHB患者接受，所以在石家莊地區(qū)成為CHB患者抗病毒早期選用的主要藥物，也就導(dǎo)致LAM耐藥發(fā)生的患者最多[15]。目前發(fā)生LAM耐藥的患者多數(shù)采用LAM聯(lián)合ADV進(jìn)行挽救，所以近年石家莊地區(qū)ADV耐藥的患者不斷增高。每一種耐藥模式的患者中HBV基因分型B型和C型比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B型患者中占比較高的前三位分別為對(duì)LAM及LDT耐藥、對(duì)LAM耐藥、對(duì)ADV及ETV耐藥。在C型患者中，對(duì)LAM及ADV耐藥、對(duì)LAM及ETV耐藥、對(duì)LAM、LDT及ADV耐藥、對(duì)LAM、ADV及ETV耐藥這4種耐藥情況均占比100%?？傊?，石家莊地區(qū)CHB患者主要發(fā)生多重耐藥，多數(shù)對(duì)2種以上核苷酸類似物耐藥，所以進(jìn)行基因測序很關(guān)鍵，當(dāng)發(fā)生基因突變時(shí)，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行基因測序確認(rèn)耐藥情況，從而調(diào)整治療方案抑制病毒復(fù)制。

綜上所述，通過對(duì)1 157例CHB患者的基因型和耐藥基因進(jìn)行分析，石家莊地區(qū)CHB患者感染的基因型主要是C型，少量是B型，B型多見于40歲以下患者，C型多見于40歲以上患者。在對(duì)14個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行分析，可見C型隨基因突變位點(diǎn)增多而占比不斷增高，B型隨基因突變位點(diǎn)增多而占比不斷降低，其中M204I/V/S、L180M、A181V/T/S為發(fā)生基因突變率的前三位，由此對(duì)4種核苷(酸)類似物L(fēng)AM、LDT、ADV及ETV發(fā)生的耐藥情況則以多重耐藥多見，所以在石家莊地區(qū)CHB患者發(fā)生耐藥情況時(shí)，應(yīng)進(jìn)行基因分型及基因測序的檢測，從而有利于指導(dǎo)臨床抗病毒治療。