孟桐羽，趙 濤，宋玉霞，趙 芳，李 盼，趙 健

(河北省石家莊市人民醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050011)

卵巢癌(ovarian cancer)是病死率居女性生殖道系統(tǒng)首位的惡性腫瘤[1]，盡管近些年來(lái)對(duì)其診斷、手術(shù)方式、化學(xué)治療及分子靶向治療等手段取得了很大進(jìn)步，但晚期患者5年的總生存率仍徘徊在40%左右[2]。卵巢癌高致死率的主要原因是發(fā)病隱匿且進(jìn)展迅速，約70%患者就診時(shí)已發(fā)生盆腹腔病灶轉(zhuǎn)移。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGFA)作為重要誘導(dǎo)血管生成的因子，在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用[3-4]。先前多個(gè)研究報(bào)道了VEGFA在卵巢癌組織中表達(dá)上調(diào)[5-6]，但調(diào)控其表達(dá)上調(diào)的作用機(jī)制尚不明確。微小RNAs(miRNAs)在調(diào)控基因表達(dá)方面起重要作用，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得知，miR-107可以靶向調(diào)控VEGFA表達(dá)，且已被多個(gè)研究證實(shí)[7-8]。由于miRNAs對(duì)靶基因調(diào)控作用具有組織特異性，卵巢癌組織中VEGFA異常表達(dá)是否由miR-107的表達(dá)異常所致，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究檢測(cè)卵巢癌組織和正常卵巢組織中miR-107與VEGFA的表達(dá)情況，探討其在卵巢癌發(fā)生中的作用并分析二者表達(dá)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年6月—2020年3月在河北省石家莊市人民院行手術(shù)治療的56例卵巢癌患者為病例組，術(shù)前均未接受新輔助化療，術(shù)后經(jīng)病理檢查確診為上皮性卵巢癌。卵巢癌患者年齡29～74歲，平均(53.8±6.7)歲；FIGO手術(shù)病理分期：Ⅰ期10例、Ⅱ期5例、Ⅲ期35例、Ⅳ期6例；腫瘤分化程度：高、中分化31例、低分化25例；組織學(xué)類(lèi)型：漿液性腺癌37例、黏液性囊腺癌7例、子宮內(nèi)膜樣癌12例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：陽(yáng)性18例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性38例。選取同期因盆腔臟器脫垂、子宮肌瘤或?qū)m頸癌行全子宮雙附件切除患者的正常卵巢組織60例為對(duì)照組，其中子宮脫垂患者21例、子宮肌瘤患者28例，宮頸癌患者11例。對(duì)照組患者年齡40～73歲，平均(54.5±7.9歲)。2組患者年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

所有組織標(biāo)本均在離體30 min內(nèi)收集，迅速放入-80 ℃冰箱里低溫保存?zhèn)溆?。?biāo)本和資料收集均由患者知情同意，并獲得石家莊市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2試劑與儀器 TRIzol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)；Go Taq Green Master Mix試劑盒、miRNA 提取試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒(均購(gòu)于德國(guó)QIAGEN公司)；PCR 引物由上海生工合成；7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 應(yīng)用TRIzol試劑抽提卵巢癌組織及正常卵巢組織總RNA，檢測(cè)其純度、濃度及完整性后，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；應(yīng)用miRNA提取試劑盒抽提卵巢癌組織及正常卵巢組織的miRNA，應(yīng)用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2RT-qPCR檢測(cè)VEGFA及miR-107的表達(dá) 目的基因VEGFA mRNA的檢測(cè)應(yīng)用QuantiNovaTMSYBR Green PCR Kit試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：Green Master Mix 10.0 μL、Rox 0.1 μL、上游引物各 1.4 μL、cDNA 模板1.0 μL、最后加去離子水至20 μL；反應(yīng)條件設(shè)定：95 ℃預(yù)變性5 min；然后40個(gè)循環(huán)95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸25 s；最后95 ℃變性15 s、60 ℃退火60 s、95 ℃延伸30 s。反應(yīng)引物：目的基因VEGFA上游引物序列5′-ACCATGAACTTT-CTGCTGTCTTGGGTGCAT-3′，下游引物序列5′-TCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTGCAAGT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物序列5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。目的基因miR-107應(yīng)用miScript SYBR Green PCR Kit進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：Ultra SYBR Mix 5.0 μL、上游引物各1.0 μL、cDNA 模板1.0 μL、最后加去離子水至10 μL；反應(yīng)條件設(shè)定：95 ℃預(yù)變性15 min；然后40個(gè)循環(huán)95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s。目的基因miR-107的上游引物5′-GCCGAATTCAAAGCGAGATTCCATCAGCA-3′，下游引物5′-GCCGGATCCTGTCAACCC-AGAACTCAAAGG-3′；以U6基因?yàn)閮?nèi)參，其上游引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。根據(jù)系統(tǒng)生成的Ct值，采用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算，獲得miR-107和VEGFA在各組織樣本中的相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析對(duì)卵巢癌組織中miR-107和VEGFA表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。采用ROC曲線分析卵巢癌組織中miR-107表達(dá)對(duì)卵巢癌的診斷意義。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1VEGFA及miR-107的表達(dá)情況 VEGFA基因mRNA在卵巢癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為2.04±0.65，在正常卵巢組織中的相對(duì)表達(dá)量為0.99±0.40，卵巢癌組織中VEGFA基因mRNA的表達(dá)量顯著高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.427，P<0.001)。卵巢癌組織中miR-107的相對(duì)表達(dá)量為0.90±0.42，其在正常卵巢組織中的相對(duì)表達(dá)量為2.06±0.65，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.319，P<0.001)。

2.2卵巢癌組織中VEGFA及miR-107表達(dá)水平的相關(guān)性分析 卵巢癌組織中VEGFA基因mRNA表達(dá)與miR-107表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 卵巢癌組織中miR-107與VEGFA mRNA表達(dá)的相關(guān)性Table 1 Correlation between the expression of miR-107 and VEGFA mRNA in the ovarian cancer tissues

2.3不同F(xiàn)IGO分期患者卵巢癌組織中miR-107及VEGFA基因mRNA表達(dá)情況比較 卵巢癌組織中miR-107及VEGFA基因mRNA在不同F(xiàn)IGO分期的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同F(xiàn)IGO分期卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達(dá)比較Table 2 Comparison of miR-107 and VEGFA mRNA expression in ovarian cancer tissues in different FIGO stages

2.4不同組織學(xué)分級(jí)患者卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達(dá)情況比較 卵巢癌組織中miR-107及VEGFA基因mRNA在不同組織學(xué)分級(jí)的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同組織學(xué)分級(jí)卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達(dá)比較Table 3 Comparison of miR-107 and VEGFA mRNA expression in ovarian cancer tissues of different histological grades

2.5不同病理類(lèi)型卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達(dá)情況比較 卵巢癌組織中miR-107及VEGFA基因mRNA在不同病理類(lèi)型的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同病理類(lèi)型卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達(dá)比較Table 4 Comparison of miR-107 and VEGFA mRNA expression in ovarian cancer tissues of different histological grades

2.6不同手術(shù)殘余病灶卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達(dá)情況比較 卵巢癌組織中miR-107及VEGFA基因mRNA在不同手術(shù)殘余病灶的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5。

表5 不同手術(shù)殘余病灶卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達(dá)比較Table 5 Comparison of miR-107 and VEGFA mRNA expression in ovarian cancer tissues from different surgical residual lesions

2.7淋巴是否轉(zhuǎn)移患者卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達(dá)情況比較 卵巢癌組織中miR-107及VEGFA基因mRNA在是否發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移患者卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達(dá)比較Table 6 Comparison of miR-107 and VEGFA mRNA expression in ovarian cancer tissues of patients with or without lymph node metastasis

2.8卵巢癌組織中miR-107表達(dá)量對(duì)卵巢癌的診斷意義 miR-107診斷卵巢癌的ROC曲線下面積(AUC值)為0.936，95%可信區(qū)間為0.895～0.976，與AUC=0.5比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖1。說(shuō)明卵巢癌組織中miR-107表達(dá)對(duì)卵巢癌的診斷具有較高的準(zhǔn)確性。最優(yōu)截?cái)帱c(diǎn)(cut-off值)為1.639，在最優(yōu)截?cái)帱c(diǎn)敏感度和特異度分別為94.6%和76.7%。

圖1 卵巢癌組織中miR-107表達(dá)水平判斷卵巢癌的ROC曲線

3 討 論

卵巢癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，大多數(shù)在確診時(shí)已為晚期，發(fā)生了腫瘤浸潤(rùn)、盆腹腔內(nèi)種植播散，具有極差的預(yù)后。因此研究卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制，同時(shí)尋找有效抑制卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移的方法，是婦科腫瘤臨床醫(yī)師研究的熱點(diǎn)。VEGFA在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用。本研究通過(guò)分析比較了VEGFA及可能調(diào)控其表達(dá)的miR-107在卵巢癌組織與正常卵巢組織中的表達(dá)情況，并探討了它們與卵巢癌病理特征的關(guān)系，為后續(xù)研究卵巢癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制提供前期基礎(chǔ)，同時(shí)為卵巢癌的診斷和治療尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物及藥物治療靶點(diǎn)。

20世紀(jì)70年代學(xué)者們提出了腫瘤血管生成理論，該理論指出如果沒(méi)有新生血管形成，腫瘤不會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且只能生長(zhǎng)到1～2 mm3，只有在新生血管形成后，腫瘤的生長(zhǎng)會(huì)加倍增長(zhǎng)，發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)率也隨之上升。形成新生血管是腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)生轉(zhuǎn)移的前提，這同樣適合于卵巢惡性腫瘤。VEGFA作為一種高效、特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，具有促進(jìn)血管生成和維持血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的功能，在腫瘤生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。先前的研究報(bào)道了VEGFA在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著高于其在良性或低度惡性卵巢腫瘤中的表達(dá)，且VEGFA的表達(dá)水平與卵巢癌患者的化療敏感性及預(yù)后相關(guān)，其表達(dá)水平越高患者的預(yù)后則越差[9-11]。因此，VEGFA的高表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及患者預(yù)后密切相關(guān)。本研究應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)了VEGFA基因mRNA在卵巢癌組織與正常卵巢組織中的表達(dá)情況，結(jié)果與先前的報(bào)道一致，VEGFA基因mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常卵巢組織，表明VEGFA表達(dá)上調(diào)可能在卵巢癌變過(guò)程中起作用。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者的卵巢癌組織中VEGFA表達(dá)水平顯著高于其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者中的表達(dá)，說(shuō)明VEGFA表達(dá)可能與卵巢癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。FIGO分期是判斷卵巢癌患者預(yù)后重要的指標(biāo), 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅲ、Ⅳ期患者的卵巢癌組織中VEGFA基因mRNA的表達(dá)水平顯著高于其在Ⅰ、Ⅱ期患者中的表達(dá),，說(shuō)明VEGFA表達(dá)水平有可能作為判斷卵巢癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

VEGFA表達(dá)升高在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，然而其在卵巢癌組織中表達(dá)上調(diào)的調(diào)控機(jī)制目前仍不明確。miRNAs作為一類(lèi)重要的基因調(diào)控分子，在調(diào)控組織特異性基因表達(dá)方面起重要作用。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中存在許多異常表達(dá)的miRNAs，miRNA通過(guò)與靶基因mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合，促進(jìn)靶基因mRNA降解或者抑制其翻譯，從而來(lái)調(diào)控基因表達(dá)[12]。本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)在線軟件(targetscan、 PicTar、miRanda)進(jìn)行預(yù)測(cè)表明miR-107與VEGFA存在靶向關(guān)系，且先前許多文獻(xiàn)報(bào)道了異常表達(dá)的miR-107通過(guò)靶向調(diào)控VEGFA表達(dá)，在人類(lèi)多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[13-16]。本研究通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)了miR-107在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中miR-107的表達(dá)顯著低于正常卵巢組織，臨床病理參數(shù)分析顯示miR-107的表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且相關(guān)性分析顯示其表達(dá)量與VEGFA基因mRNA表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)性，這與上面報(bào)道的結(jié)果相似。我們的結(jié)果表明miR-107表達(dá)減少可能通過(guò)上調(diào)VEGFA的表達(dá)來(lái)增加卵巢癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力，從而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。

本研究還采用ROC曲線分析了miR-107表達(dá)對(duì)卵巢癌的診斷價(jià)值，結(jié)果表明miR-107對(duì)卵巢癌的診斷準(zhǔn)確性較高，可作為一個(gè)卵巢癌的診斷預(yù)測(cè)指標(biāo)。經(jīng)過(guò)分析cut-off值為1.639，其敏感度為94.6%，特異度為76.7%，考慮組織標(biāo)本的不易獲得性，在今后的研究中，將進(jìn)一步檢測(cè)卵巢癌患者外周血中miR-107的表達(dá)情況，進(jìn)一步明確外周血中miR-107的表達(dá)水平的診斷價(jià)值。此外，我們還將在卵巢癌細(xì)胞系中進(jìn)一步驗(yàn)證miR-107與VEGFA的靶向關(guān)系。

綜上所述，卵巢癌組織中miR-107表達(dá)降低可能通過(guò)靶向上調(diào)VEGFA基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力，從而在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中起作用。因此，進(jìn)一步探索其在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制，可為卵巢癌的早期診斷、預(yù)防及治療提供新思路。