薛靜秀，李 濤*，馬 哲，靳凱璐，趙 沙，張艷寧

(1.河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)院口腔預防科，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)院口腔病理科，河北 石家莊050017)

齲病是由多因素引起的牙體硬組織受破壞的感染性疾病，是影響人類健康的常見口腔疾病之一。第四次全國口腔健康流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，近十年來，我國兒童乳牙齲及年輕恒牙齲患病水平呈現(xiàn)上升趨勢。變異鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)是目前公認的最主要的致齲菌[1-2]，因其具有很強的產(chǎn)酸性和耐酸性[3-4]，并能夠黏附于牙齒表面形成復雜的生物膜結(jié)構(gòu)[5-6]，通過代謝碳水化合物持續(xù)產(chǎn)酸，引起牙齒脫礦，導致齲病發(fā)生[7]。產(chǎn)酸性能與黏附性能是S.mutans致齲的主要毒力因子[8]，其中產(chǎn)酸性能是造成齲病的最直接因素[9-10]，而黏附形成的細菌生物膜則是其持續(xù)作用、避免被口腔內(nèi)環(huán)境清除的重要手段。實驗證明，抑制或減少S.mutans產(chǎn)酸和對牙面的黏附可以有效降低齲病發(fā)生率[11-13]。蘆薈苷是從蘆薈中提取出的一種蒽醌類化合物，綠原酸是金銀花的提取物，水溶性較好，具有抗菌消炎等藥用價值，且對變異鏈球菌均存在一定的抑制作用[14-16]。探討兩種或多種藥物聯(lián)合應用，以達到降低單組分藥物的使用劑量和不良反應的研究方法也是藥物學研究的一個新方向[17]，將蘆薈苷與綠原酸聯(lián)合應用是否能夠加強其對變異鏈球菌的抑制作用目前尚無人研究。本研究采用蘆薈苷和綠原酸配伍應用，測定不同濃度混合液對變異鏈球菌產(chǎn)酸、黏附及生物膜形成的影響，以探討其對變異鏈球菌的生物學作用，并為其開發(fā)應用于臨床齲病預防提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1主要試劑 蘆薈苷、綠原酸(純度98%)；洗必泰購自深圳南粵藥業(yè)有限公司；牛腦心浸出液培養(yǎng)基(brain heart infusion,BHI)購自杭州微生物試劑有限公司；BHI固體培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；國際標準菌株變異鏈球菌ATCC25175購自廣東省微生物研究所。

1.2藥液制備

1.2.1實驗菌株及菌液制備 將凍存菌株復蘇，傳代，鑒定，然后挑取2～3個菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，離心，涂片，用生理鹽水調(diào)節(jié)菌濃度為1.5×108CFU/mL。

1.2.2實驗藥液的制備 ①蘆薈苷與綠原酸母液：將蘆薈苷與綠原酸分別溶解于無菌BHI液體培養(yǎng)基中，配置濃度為5 g/L蘆薈苷母液與20 g/L綠原酸母液，密封于4 ℃冰箱避光保存。②噻唑藍[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetraz-olium bromide,MTT]溶液：避光條件下稱取0.15 g MTT溶于30 mL PBS緩沖液中，配制成濃度為5 g/L儲備液，現(xiàn)配現(xiàn)用。③吖啶橙(acridine orange, AO)、溴化乙錠( ethidium bromide, EB)熒光染液：避光條件下稱取AO、EB各1 mg，分別溶于10 mL pH為7.0的PBS緩沖液中，無菌針頭過濾器濾過除菌，4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩Ｈ旧皩O、EB儲備液等比例混合后1∶20稀釋成工作液。

1.3不同濃度蘆薈苷-綠原酸聯(lián)用對變異鏈球菌生長的影響

1.3.1確定蘆薈苷、綠原酸的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值 二倍稀釋法將蘆薈苷母液稀釋成5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16 g/L，向96孔板中每孔加入各濃度梯度蘆薈苷藥液190 μL和1.2.1中制備好的菌液10 μL，此時菌濃度為7.5×106CFU/mL，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后取出，在暗色背景下肉眼觀察，最低濃度的孔中無菌生長者為其MIC值。并設置陽性對照(190 μL雙氯苯雙胍已烷+BHI液體培養(yǎng)基+10 μL菌液)、陰性對照(190 μL BHI液體培養(yǎng)基+10 μL菌液)、空白對照(200 μL BHI液體培養(yǎng)基)，實驗重復3次。同法確定蘆薈苷的MIC值。

1.3.2確定混合液的MIC值 在96孔板上橫排分別加入濃度為1.25、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04 mg蘆薈苷溶液95 μL，縱排分別加入等體積濃度為10、5、2.5、1.25、0.63、0.31 g/L綠原酸溶液，兩溶液充分混勻后，每孔分別加入菌液10 μL，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，并設置陽性對照、陰性對照、空白對照，實驗重復3次。

1.3.3聯(lián)合用藥效果評價 通過計算分級抑制濃度(fractional inhibitory concentration,FIC)指數(shù)來測定兩者的抑菌關(guān)系。FIC=A藥聯(lián)用時MIC/A藥單測時MIC+B藥聯(lián)用時MIC/B藥單測時MIC。FIC≤0.5時，兩藥為協(xié)同作用；0.5

1.4蘆薈苷-綠原酸對變異鏈球菌產(chǎn)酸能力的影響 選取聯(lián)合用藥實驗中MIC以內(nèi)5個濃度梯度(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 MIC)，用含1%蔗糖的BHI培養(yǎng)基二倍稀釋法配置以上5個濃度混合藥液，pH計調(diào)定初始pH=7.4，按菌液與藥液1∶20(體積分數(shù))比例接種變異鏈球菌，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，離心，pH計測量上清液pH值，計算培養(yǎng)前后的△pH，并設置陰性對照，實驗重復4次。

1.5蘆薈苷-綠原酸對變異鏈球菌24 h生物膜黏附作用的影響 將變異鏈球菌懸液接種于96孔板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，吸去孔板內(nèi)BHI培養(yǎng)基，分別加入上述5個濃度(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 MIC)的混合藥液，恒溫培養(yǎng)24 h后吸去孔板內(nèi)溶液，PBS漂洗2次，黏附于孔板底部的細菌用MTT法定量測定，全自動酶標儀波長490 nm 檢測吸光度(optical delnsity，OD)值，計算細菌抑制率，并設置陰性對照，實驗重復4次。

抑制率=(陰性對照組OD值-實驗組OD值)/陰性對照組OD值×100%。

1.6激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)觀察混合液對變異鏈球菌24 h生物膜作用的影響 在激光共聚焦小皿中加入變異鏈球菌菌液，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，吸去液體培養(yǎng)基，分別加入前述5個濃度(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 MIC)混合藥液，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，吸去混合藥液，PBS漂洗2次，于避光暗室中滴加AO、EB混合熒光染液200 μL，孵育15 min后，PBS漂洗去除多余染料。用放大倍數(shù)40×10(物鏡×目鏡)CLSM(波長488/543 nm)觀察細菌生物膜。設置陽性對照、陰性對照，實驗重復3次。

1.7統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1蘆薈苷和綠原酸的MIC值 二倍稀釋法抑菌試驗結(jié)果顯示，蘆薈苷、綠原酸的MIC值分別為0.63 g/L和5 g/L(圖1)。

圖1 蘆薈苷和綠原酸的MIC

2.2蘆薈苷-綠原酸混合液對變異鏈球菌生長的影響 蘆薈苷和綠原酸聯(lián)用時的MIC值為0.31 g/L蘆薈苷+2.5 g/L綠原酸。根據(jù)1.3.4的公式計算得到二者聯(lián)用時的FIC=1，存在相加作用,見表1。

表1 不同濃度蘆薈苷和綠原酸聯(lián)用對變異鏈球菌生長的影響Table 1 Effects of combined application of aloin and chlorogenic acid at different concentrations on the growth of Streptococcus mutans

2.3蘆薈苷-綠原酸混合液對變異鏈球菌產(chǎn)酸能力的影響 在1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 MIC 5個濃度的混合液，隨著藥物濃度的增加△pH值逐漸降低，各實驗組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 蘆薈苷-綠原酸混合液對變異鏈球菌產(chǎn)酸能力的影響Table 2 The effect of aloin-chlorogenic acid mixture on the acid production ability of Streptococcus mutans

2.4蘆薈苷-綠原酸混合液對變異鏈球菌24 h生物膜黏附作用的影響 選取1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 MIC 5個濃度的混合液，檢測其對變異鏈球菌黏附于96孔聚苯乙烯培養(yǎng)板上生物膜菌量的影響(厭氧孵育24 h)。隨著藥物濃度的增加生物膜的量(OD值)逐漸減少，抑制率增加。實驗組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 蘆薈苷-綠原酸混合液對變異鏈球菌24 h生物膜的黏附效果和抑制率比較Table 3 The adhesive effects and inhibition rates of 24 h biofilms of Streptococcus mutans by aloin-chlorogenic acid mixtures

2.5CLSM觀察蘆薈苷-綠原酸混合液對變異鏈球菌24 h生物膜作用的影響 CLSM觀察顯示，1/32 MIC混合液的圖像由于活菌數(shù)量大于死菌，綠色熒光強度高于紅色熒光強度，同一視野疊加后呈綠色，細菌多呈塊狀或網(wǎng)狀聚集，但是密集程度不及陰性對照組。隨著藥液濃度的增加綠色熒光面積逐漸減少，紅色熒光面積逐漸增加，同一視野疊加開始呈現(xiàn)黃綠色/黃色，細菌分布稀疏；濃度為1/2 MIC時，活菌量顯著減少，而陽性對照組則顯示極為分散的少量細菌。見圖2。

圖2 蘆薈苷-綠原酸混合液對變異鏈球菌24 h生物膜作用的結(jié)果(CLSM,綠色為活菌,紅色為死菌,×400)A.陰性對照組;B.陽性對照組;C.1/2 MIC組;D.1/4 MIC組;E.1/8 MIC組;F.1/16 MIC組;G.1/32 MIC組

3 討 論

天然植物內(nèi)含有諸多具有治療特性的物質(zhì)，可以用于篩選合成潛在藥物的前體成分。對于天然植物有效成分的基礎與應用研究已有大量報道，天然提取物在全球范圍內(nèi)的使用率也在日益提高[18]。蘆薈苷和綠原酸分別為植物蘆薈與金銀花中的提取物，其水溶液在常溫下均可呈現(xiàn)比較穩(wěn)定的狀態(tài)，并且可長時間保持其生物活性。蘆薈苷為蒽醌類化合物，可以通過破壞細菌細胞壁的聚糖骨架結(jié)構(gòu)、抑制細菌遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)的合成途徑，從而起到對微生物的殺滅作用[19-20]。而綠原酸不僅可以通過降低細菌細胞壁的硬度，減慢細菌的遷移，影響細菌細胞膜的穩(wěn)定性和誘導活性氧的產(chǎn)生來發(fā)揮抑菌作用[21]，而且還可以降低變異鏈球菌的黏附作用[22]。研究表明，單獨應用蘆薈苷或綠原酸均可對變異鏈球菌產(chǎn)生一定的抑制作用[16,23]，而將二者聯(lián)合應用是否可增強其抑菌效果，降低二者的不良反應目前尚無人報道。本研究分析了蘆薈苷與綠原酸單獨應用對變異鏈球菌的抑菌作用，并且將二者配伍應用，采用棋盤稀釋法研究不同濃度的混合溶液對變異鏈球菌的體外抑制作用。結(jié)果顯示，單獨抑菌時0.63 g/L蘆薈苷和5 g/L綠原酸均可以抑制變異鏈球菌的生長；而將二者配伍應用時，0.31 g/L蘆薈苷與2.5 g/L綠原酸即可達到其聯(lián)用時的MIC，且二者聯(lián)合應用時對其抑菌性能具有相加作用。其原因可能是二者分子式中都含有酚羥基結(jié)構(gòu)，均可對細菌的細胞壁造成破壞，從而使聯(lián)合應用時存在相加的抑菌效應。

本研究觀察了1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 MIC共5個濃度梯度混合溶液對變異鏈球菌產(chǎn)酸、黏附以及生物膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)二者配伍后隨著濃度的降低，培養(yǎng)基中變異鏈球菌的△pH值及OD值變化增加，表明二者配伍應用對變異鏈球菌產(chǎn)酸及黏附能力的抑制作用具有濃度相關(guān)性。有研究表明,變異鏈球菌在生物膜狀態(tài)下比在浮游狀態(tài)下有更強的生存能力，清除生物膜中的變異鏈球菌需要更高的藥物濃度和更合理的用藥方式[24]，因此，理想的防齲抗菌劑不僅要抑制變異鏈球菌的生長而且還可以有效減少生物膜的形成，從而達到減少變異鏈球菌聚集生長產(chǎn)酸的目的，取得較好的防齲效果。本研究利用CLSM觀察了蘆薈苷和綠原酸聯(lián)用后變異鏈球菌生物膜的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn),蘆薈苷與綠原酸配伍應用可以影響變異鏈球菌24 h生物膜的形成，蘆薈苷-綠原酸混合液的濃度越高其抑制生物膜的中細菌活性的能力越強。

綜上所述,蘆薈苷和綠原酸聯(lián)合應用對變異鏈球菌的生長具有顯著的體外抑制作用，并且降低了單組份應用的抑菌濃度，增強了抑菌效果。但是實驗僅提供了體外抑菌作用的研究結(jié)果，并未涉及體內(nèi)實驗及分子生物學機制方面的研究，因此蘆薈苷和綠原酸混合液在口內(nèi)的使用效果、其安全性如何以及相關(guān)作用機制等尚需進一步的研究探討，為開發(fā)與制備安全有效的防齲產(chǎn)品并應用于臨床提供實驗依據(jù)。