蘇 凱 雷 英 金修哲 李金邦

(太原動(dòng)物園，太原，030009)

腸道中的細(xì)菌菌群因物種不同而不同，也因飲食、年齡、棲息地、疾病等因素而不同[1-2]。大量研究發(fā)現(xiàn)[3-5]，腸道微生物區(qū)系的動(dòng)態(tài)平衡與宿主的免疫、發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收和能量代謝息息相關(guān)，在維持宿主健康方面的潛在意義日益凸顯。因此，腸道菌群研究在保護(hù)瀕危動(dòng)物領(lǐng)域受到越來(lái)越多的關(guān)注[6-7]。He等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與母乳喂養(yǎng)的東北虎(Pantheratigrisaltaica)幼崽相比，哺乳山羊奶的幼崽腸道內(nèi)益菌較少，致病菌較多，微生物多樣性較高。Butowski等[9]發(fā)現(xiàn)在高蛋白、高脂肪的生紅肉日糧中添加植物性膳食纖維，可以改變家貓(Feliscatus)的糞便細(xì)菌群豐度和有機(jī)酸質(zhì)量濃度。

孟加拉白虎(Pantheratigristigris，以下簡(jiǎn)稱白虎)是孟加拉虎的白化變種，數(shù)量稀少，目前全部為人工飼養(yǎng)，由于其基因突變導(dǎo)致的高度遺傳缺陷，使其在飼養(yǎng)管理和繁殖育幼上存在較大難度。

通過(guò)16S rDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)特定環(huán)境樣品中所有的細(xì)菌進(jìn)行高通量測(cè)序，以研究環(huán)境樣品中微生物群體的組成，解讀微生物群體的多樣性、豐富度及群體結(jié)構(gòu)，探究微生物與環(huán)境或宿主之間的關(guān)系漸成主流[10-11]。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分別對(duì)圈養(yǎng)條件下亞成年和成年白虎的腸道菌群進(jìn)行研究，旨在探明其腸道優(yōu)勢(shì)菌群，分析對(duì)比不同年齡白虎腸道微生物組成的差異，為提高白虎的飼養(yǎng)管理水平和疾病防治能力提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

同等飼養(yǎng)條件下的白虎，用滅菌采樣管分別挑取10只白虎當(dāng)日清晨的新鮮糞便，其中2.0—2.5歲的亞成年白虎5只，記為SAWT組；10.0—12.0歲的成年白虎5只，記為AWT組，樣品標(biāo)記清楚后置于干冰上，采樣結(jié)束后全部-80℃保存。

1.2 微生物組總DNA提取

將2組樣品分別混合均勻后，利用E.Z.N.A.?Stool DNA試劑盒(Omega，USA)提取微生物組總DNA，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，同時(shí)采用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量。

1.3 PCR反應(yīng)

采用引物341F：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；805R：5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′；靶向擴(kuò)增16S rDNA的V3—V4片段。PCR反應(yīng)體系(25.0 μL)，Phusion?Hot start flex 2×MasterMix 12.5，模版DNA 50 ng，上下游引物(10 μmol/L)各2.5 μL，超純水加至25.0 μL。反應(yīng)條件為，95℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)：72℃延伸10 min。

1.4 產(chǎn)物純化和文庫(kù)構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)AMPure XT beads(Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，USA)純化，Qubit(Invitrogen，USA)定量。通過(guò)擴(kuò)增子池進(jìn)行測(cè)序，擴(kuò)增子文庫(kù)的大小和數(shù)量分別在Agilent 2100生物分析儀(Agilent，USA)和Illumina(Kapa Biosciences，Woburn，MA，USA)的文庫(kù)定量試劑盒上進(jìn)行評(píng)估。

1.5 高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析

樣品在Illumina NovaSeq平臺(tái)上按照制造商的建議進(jìn)行測(cè)序，由LC-Bio提供。根據(jù)樣品獨(dú)特的條形碼，將配對(duì)端序列分配給樣品，并將建庫(kù)引入的條形碼和引物序列去除。使用FLASH合并匹配端讀取。根據(jù)fqtrim在特定的過(guò)濾條件下對(duì)原始讀數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，以獲得高質(zhì)量的clean標(biāo)簽。使用Vsearch軟件對(duì)嵌合序列進(jìn)行過(guò)濾，利用DADA2進(jìn)行解調(diào)，得到特征表和特征序列。Alpha多樣性通過(guò)歸一化到相同的隨機(jī)序列來(lái)計(jì)算。然后根據(jù)SILVA分類器，利用每個(gè)樣本的相對(duì)豐度對(duì)特征豐度進(jìn)行歸一化。Alpha多樣性用于分析樣本物種多樣性的復(fù)雜性，包括Chao1、Observed species、樣品文庫(kù)覆蓋率(goods coverage)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、辛普森指數(shù)(Simpson)5個(gè)指標(biāo)，這些指標(biāo)均由QIIME2計(jì)算得出。

2 結(jié)果與分析

2.1 白虎腸道菌群樣品測(cè)序有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙端拼接、質(zhì)量控制、嵌合體過(guò)濾后，進(jìn)行高質(zhì)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，10份白虎糞便樣得到原始序列共計(jì)834 978條；質(zhì)控后的序列共計(jì)694 506條，Q20、Q30和GC比例均屬于合理區(qū)間(表1)，樣品質(zhì)控后的序列長(zhǎng)度為400—500 bp(圖1)。

2.2 亞成年和成年白虎腸道菌群的Alpha多樣性

對(duì)2組樣品結(jié)果進(jìn)行Alpha多樣性分析(表2)，利用Chao1指數(shù)評(píng)估樣本中特征序列(OTU)數(shù)目多少，Chao1指數(shù)越大，特征序列數(shù)目越多，說(shuō)明豐富度越高。結(jié)果中Chao1指數(shù)為70.00—277.05，表明豐富度不高；香農(nóng)和辛普森數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越高，均一性越好。圖2和圖3為豐富度指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)的稀釋曲線，從圖中可以看出，當(dāng)測(cè)序量達(dá)到5 000時(shí)，各樣品的特征序列數(shù)目增加基本趨向平緩，說(shuō)明更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量特征序列數(shù)目，表示該試驗(yàn)的測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。亞成年和成年白虎所有樣品豐富度曲線，均已經(jīng)達(dá)到平緩的走勢(shì)，這也反映了樣品量較為合理。樣品文庫(kù)覆蓋率均為1，試驗(yàn)結(jié)果能很好地反應(yīng)微生物群落情況。

表2 成年和亞成年白虎腸道菌群Alpha多樣性

2.3 白虎腸道菌落組成

2.3.1 菌群OUT數(shù)目組的相似性及重疊情況

通過(guò)QIIME2檢測(cè)得到亞成年和成年白虎樣品中共包含特征序列ID(OTU)877個(gè)，其中亞成年白虎特有特征序列299個(gè)；成年白虎特有特征序列353個(gè)，2組共有的特征序列225個(gè)(圖4)。

2.3.2 門水平上的菌群組成及其豐富度

圖5和圖6是根據(jù)物種豐度表和物種注釋表，默認(rèn)選取豐度最高的30個(gè)物種分類，展示每個(gè)樣本以及分組的相對(duì)豐度的柱狀堆疊圖。在10組白虎的樣本中，豐富度較高的有5個(gè)菌門，其中放線菌門(Actinobacteria)在兩組樣本中所占比例最高，平均含量達(dá)45.3%，其次是厚壁菌門(Firmicutes)，平均含量為37.3%，另外，梭桿菌門(Fusobacteria)平均含量為7.9%，變形菌門(Proteobacteria)為7.1%，擬桿菌門(Bacteroidetes)僅為2.1%。

2.3.3 屬水平上的菌群組成及其豐富度

在10份白虎的糞便樣本中，柯林斯菌屬(Collinsella)所占比例最高，平均含量達(dá)43.8%，梭桿菌屬(Fusobacterium)和布勞特氏菌屬(Blautia)分別占到7.9%和7.5%，瘤胃球菌類群(Ruminococcusgnavusgroup)為7.0%，其余埃希氏菌屬-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、擬桿菌屬、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)以及狹義梭菌屬1(Clostridiumsensustricto1)、Paeniclostridium、鏈球形菌屬(Catenisphaera)平均含量都不足3.0%。圖7和圖8是將每個(gè)樣本以及分組的相對(duì)豐度進(jìn)行不同形式的熱圖。圖中色塊越靠近紅色表示某份樣品對(duì)應(yīng)的某一物種比例越高，反之，色塊越靠近藍(lán)色表示某份樣品對(duì)應(yīng)的某一物種比例越低，圖中可以看出，亞成年白虎組的物種豐度變化更加豐富，亞成年和成年白虎組間的物種多樣性存在差異。

2.4 亞成年和成年白虎腸道菌群組間物種差異

根據(jù)樣品物種豐度表，利用LEfSe方法[12]分析并得出樣品組間進(jìn)化分支圖(圖9)。圖9中不同圓圈層從內(nèi)至外輻射分別代表界、門、綱、目、科、屬、種7個(gè)分類級(jí)別，各個(gè)節(jié)點(diǎn)代表該水平下的一個(gè)物種分類，該物種豐度越高節(jié)點(diǎn)越大。其中節(jié)點(diǎn)顏色為黃色的表示該物種在比較組中無(wú)顯著性差異，如果節(jié)點(diǎn)顏色為紅色則表示該物種在比較組中有顯著性差異，且該物種在紅色分組中的豐度更高，其他顏色以此類推。

LDA評(píng)分直方圖(圖10)顯示各組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物學(xué)標(biāo)志。由圖10可見(jiàn)，亞成年和成年白虎組間具有明顯的微生物種群差異。亞成年組的微生物種類中梭桿菌門和擬桿菌門明顯低于成年組(P<0.05)；琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio)，Eggerthellaceae科未分類屬(Eggerthellaceae unclassified)，巨單胞菌屬(Megamonas)，梭桿菌屬，瘤胃球菌屬等顯著低于成年組(P<0.05)；而腸球菌屬(Enterococcus)，乳球菌屬(Lactococcus)，狹義梭菌屬2(Clostridiumsensustricto2)，乳酸菌屬(Lactobacillus)，鏈球菌屬(Globicatella)，放線菌屬(Actinomyces)顯著高于成年組(P<0.05)；其中亞成年組特有的有狹義梭菌屬2、乳球菌屬、明串珠菌屬(Leuconostoc)，成年組特有的為琥珀酸弧菌屬、Eggerthellaceae科未分類屬、氣單胞菌屬(Aeromonas)，LDA值分布柱狀圖與進(jìn)化分支圖的結(jié)果是一致的。

3 討論

本研究結(jié)果表明，在門水平上，亞成年與成年白虎各樣品腸道菌群中的變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和梭桿菌門是優(yōu)勢(shì)菌群，與和鳳平[13]研究基本一致，不同的是，在圈養(yǎng)東北虎腸道微生物組中相對(duì)豐度最高的是變形菌門(45.25%)，而本研究的孟加拉白虎菌群中，放線菌門豐度最高，為45.30%，變形菌門為7.10%。在屬水平上，本研究發(fā)現(xiàn)柯林斯菌屬最為優(yōu)勢(shì)(43.80%)，這也與之前的相關(guān)研究[8，14]一致。

Karmacharya等[15]在對(duì)尼泊爾境內(nèi)的孟加拉白虎腸道菌群研究分析后得出其豐度最高的是變形菌門(37.1%)，在其棲息地的土壤分析后也得出了相似的結(jié)果(32.9%)，這說(shuō)明不同的棲息環(huán)境對(duì)動(dòng)物腸道菌群有一定影響。

劉廣帥[16]在對(duì)雪豹(Pantherauncia)腸道菌群分析后也得出，多樣性最高的分別是厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和變形菌門；AN等[17]在對(duì)3種圈養(yǎng)的肉食動(dòng)物豹貓(Prionailurusbengalensis)、水獺(Lutralutra)和貉(Nyctereutesprocyonoides)做腸道微生物分析也得出豐度較高的是擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門和放線菌門。由此可見(jiàn)，對(duì)哺乳動(dòng)物尤其是肉食性動(dòng)物來(lái)說(shuō)，優(yōu)勢(shì)菌群是相對(duì)固定的[18-20]，比例高低各有不同是由物種基因差異、年齡、動(dòng)物食性以及棲息環(huán)境不同導(dǎo)致的[21]，同時(shí)也說(shuō)明本研究的結(jié)果是合理的。

組間物種差異分析顯示：成年組白虎的梭桿菌門和擬桿菌門明顯高于亞成年白虎組(P<0.05)；在屬水平上，亞成年組的梭桿菌屬，巨單胞菌屬，Eggerthellaceae科未分類屬，琥珀酸弧菌屬，活潑瘤胃球菌屬等顯著低于成年組(P<0.05)；而乳桿菌屬，腸球菌屬，乳球菌屬，狹義梭菌屬2，放線菌屬等顯著高于成年組(P<0.05)；Deusch等[22]曾經(jīng)對(duì)18、30和42周齡的幼貓(雄性16只，雌性14只)糞便的縱向研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，18周齡時(shí)微生物群落以乳桿菌屬和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)為主(平均豐度分別為35%和20%)；42周齡時(shí)最豐富的屬為類桿菌屬(Bacteroides，16%)和普氏桿菌屬(Prevotella，14%)。Peng等[23]研究發(fā)現(xiàn)不同年齡圈養(yǎng)大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)的腸道細(xì)菌組成不同，尤其是乳桿菌屬的含量老年大熊貓顯著地低于成年大熊貓。Vaiserman等[24]也曾指出不同年齡段的人腸道微生物區(qū)系在主要微生物門水平上的組成有顯著差異，放線菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度增加，擬桿菌門相對(duì)豐度減少。

綜上，當(dāng)飲食和環(huán)境受到控制時(shí)，孟加拉白虎的糞便微生物群主要是由年齡決定的。隨著年齡變化，菌群的種類以及豐度都會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，其相關(guān)功能的變化有待進(jìn)一步研究。