姚瑞祺，高 敏，葛含靜

（1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西學(xué)前師范學(xué)院，西安 710061）

光皮木瓜［Chaenomelessinensis（Thouin）Koehne］，又名榠楂、木瓜，屬于薔薇科木瓜屬植物，原產(chǎn)中國，主要分布于陜西、湖北等地，其果實(shí)成熟后色澤金黃，個(gè)大肉多，氣味芳香，具有良好的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能。近年來，全國木瓜的種植面積和產(chǎn)量均不斷上升，以陜西省白河縣為例，截至2017年底，種植面積已達(dá)9 333 hm2，其中掛果面積4 667 hm2，年產(chǎn)量2.6萬t。伴隨木瓜種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，亟需延長產(chǎn)業(yè)鏈，大力發(fā)展深加工。

在食品工業(yè)中，木瓜已被成功地開發(fā)為木瓜酒、木瓜醋等［1，2］，但鮮見相關(guān)益生菌飲料的開發(fā)報(bào)道。研究證實(shí)［3-5］，益生菌能競爭性抑制腸道致病菌的生長，促進(jìn)人體消化吸收、提高人體免疫力；柴曉霞［6］將雙歧桿菌三聯(lián)活菌用于治療潰瘍性結(jié)腸炎，臨床效果顯著。馬幸等［7］發(fā)現(xiàn)益生菌能夠有效促進(jìn)非酒精性脂肪性肝病患者的細(xì)胞因子表達(dá)恢復(fù)正常。目前，益生菌被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)生產(chǎn)中，如酸乳、泡菜的加工等，益生菌果汁飲料亦成為研究熱點(diǎn)，其安全性已經(jīng)得到有效驗(yàn)證。

木瓜富含糖、VC［8，9］及礦物質(zhì)［10］等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還含有多種有機(jī)酸、酚類物質(zhì)［11，12］，是益生菌發(fā)酵的理想基質(zhì)。但由于木瓜原料酸度較高，直接接種未經(jīng)馴化的益生菌株會(huì)導(dǎo)致其發(fā)酵性能大大下降，難以快速生長繁殖，也無法產(chǎn)生良好的營養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì)。本研究利用馴化后的植物乳桿菌及類干酪乳桿菌為混合發(fā)酵菌種，復(fù)配后加入木瓜汁中進(jìn)行發(fā)酵，以活菌數(shù)和產(chǎn)酸量為評價(jià)指標(biāo)，對木瓜益生菌發(fā)酵飲料工藝進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)，對發(fā)酵前后木瓜汁的總酸、游離態(tài)酚和結(jié)合態(tài)酚進(jìn)行比較，分析益生菌發(fā)酵對木瓜汁品質(zhì)的影響。本研究可為木瓜的益生菌發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)及飲料產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

光皮木瓜：采自陜西省白河縣木瓜園。

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）、類干酪乳桿菌（Lactobacillusparacasei），購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

MRS培養(yǎng)基購自北京緣生化科技有限公司。

1+1混合酶：由果膠酶與纖維素酶按等量配比，果膠酶與纖維素酶購自山東濟(jì)寧和信生物技術(shù)有限公司。

DNP-9272恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZM-80KCS-Ⅲ立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；PHS-25型pH計(jì)，上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司；FA1204C電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TG16臺(tái)式高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木瓜汁的制備 將木瓜洗凈，去除種子后切成2 cm×2 cm的方塊，立即投入2倍體積的85℃熱水中軟化、護(hù)色15 min，趁熱打漿。調(diào)整漿液溫度為45℃，按照0.25%的用量投入1+1混合酶酶解3 h，過濾，調(diào)整糖度至15%，在121℃條件下滅菌20 min，冷卻待用。

1.2.2 馴化培養(yǎng)基的制備［13］將木瓜汁與MRS培養(yǎng)基混合，木瓜汁所占比例分別為20%、40%、60%、80%、100%。121℃條件下滅菌20 min，冷卻待用，制得5個(gè)濃度的馴化培養(yǎng)基。100%濃度的馴化培養(yǎng)基即純木瓜汁。

1.2.3 益生菌的馴化與復(fù)配 利用5個(gè)濃度的馴化培養(yǎng)基進(jìn)行益生菌的傳代培養(yǎng)，直至馴化成功。選取植物乳桿菌與類干酪乳桿菌配比2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)，確定最佳復(fù)配比例并用于后期的發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.4 發(fā)酵單因素試驗(yàn) 選取發(fā)酵溫度22、26、30、34、38、42℃，復(fù)合菌種用量1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，發(fā)酵時(shí)間6、12、18、24、30、36 h，以產(chǎn)酸量和活菌數(shù)為指標(biāo)，通過控制其他因素水平不變，僅改變其中一個(gè)因素的水平來進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.5 正交試驗(yàn) 以產(chǎn)酸量和活菌數(shù)為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，得出木瓜益生菌發(fā)酵飲料最優(yōu)工藝。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵試驗(yàn)因素與水平

1.2.6 酚類物質(zhì)的提取 參照田新惠等［14］的方法，略作改動(dòng)。采用最優(yōu)工藝發(fā)酵木瓜汁，分別收集木瓜汁、發(fā)酵飲料中的游離態(tài)酚和結(jié)合態(tài)酚，以便后期測定含量。

1）游離態(tài)酚的提取。分別稱取木瓜汁及發(fā)酵液5.00 g，加入20 mL 80%甲醇，振搖10 min，5 000 r/min高速離心10 min，取上清液。重復(fù)3次，合并上清液。將上清液過0.22μm濾膜，分別用80%甲醇定容至100 mL容量瓶備用。

2）結(jié)合態(tài)酚的提取。分別收集高速離心后的沉淀物，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入20 mL 2 mol/L NaOH振搖水解1 h，用濃鹽酸調(diào)節(jié)水解液pH至2.0。用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用80%甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶備用。

1.2.7 測定方法 產(chǎn)酸量：以乳酸計(jì)，采用GB/T 12456—20008（pH電位法）；活菌數(shù)：GB 4789.35—2016食品微生物實(shí)驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)；維生素C：GB 5009.86—2016（2，6-二氯靛酚滴定法）；總酚：Folin-Ciocalteu比色法。

1.3 數(shù)據(jù)整理與分析

采用SPSS 17.0、Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌的馴化與復(fù)配結(jié)果

利用不同木瓜汁濃度的馴化培養(yǎng)基對益生菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代效果見圖1。100%濃度的培養(yǎng)基中益生菌活菌數(shù)達(dá)7.00 lg（cfu/mL）以上時(shí)，便可認(rèn)為馴化成功［15，16］。由圖1可知，植物乳桿菌和類干酪乳桿菌在純木瓜汁中的活菌數(shù)均達(dá)7.00 lg（cfu/mL）以上，達(dá)到了馴化標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 益生菌馴化效果

為獲得植物乳桿菌、類干酪乳桿菌的適宜配比，以產(chǎn)酸量和活菌數(shù)為指標(biāo)，對復(fù)合益生菌在木瓜汁中的發(fā)酵情況進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，植物乳桿菌與類干酪乳桿菌在配比為4∶6時(shí)活菌數(shù)與產(chǎn)酸量均達(dá)到最高點(diǎn)，發(fā)酵效果最佳，因此植物乳桿菌與類干酪乳桿菌的適宜配比為4∶6。

圖2 復(fù)合益生菌配比效果

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 溫度對木瓜汁發(fā)酵的影響 溫度對木瓜汁發(fā)酵的影響見圖3。在22～42℃，隨著發(fā)酵溫度的升高，活菌數(shù)和產(chǎn)酸量均呈先上升后下降的趨勢。不同的是，活菌數(shù)在34℃時(shí)達(dá)到最高后急劇下降（P＜0.05），而產(chǎn)酸量則下降趨勢平緩（P＞0.05）。這可能是因?yàn)殚L時(shí)間高溫發(fā)酵，復(fù)合菌種出現(xiàn)老化、甚至死亡，導(dǎo)致活菌數(shù)下降明顯，產(chǎn)酸量變化也不顯著。綜合考慮，適宜的發(fā)酵溫度為34℃。

圖3 溫度對發(fā)酵效果的影響

2.2.2 菌種用量對木瓜汁發(fā)酵的影響 菌種用量對木瓜汁發(fā)酵的影響見圖4。當(dāng)菌種用量低于2.5%時(shí)，隨著菌種用量的增加，發(fā)酵液中的活菌數(shù)及產(chǎn)酸量均逐漸增加（P＜0.05），但當(dāng)菌種用量超過2.5%后，增大菌種量則對活菌數(shù)與產(chǎn)酸量均影響不顯著（P＞0.05）。因此，適宜的接種量為2.5%。

圖4 菌種用量對發(fā)酵效果的影響

2.2.3 時(shí)間對木瓜汁發(fā)酵的影響 發(fā)酵時(shí)間對木瓜汁發(fā)酵的影響見圖5。在發(fā)酵時(shí)間6～24 h，產(chǎn)酸量和活菌數(shù)均明顯上升。24 h以后產(chǎn)酸量雖有少量增長，但變化不顯著（P＞0.05）。活菌數(shù)18～24 h趨于平穩(wěn)，30～36 h出現(xiàn)下降趨勢，這可能是因?yàn)閺?fù)合菌種的生長曲線已經(jīng)接近衰亡期。綜合考慮，適宜的發(fā)酵時(shí)間為24 h。

圖5 時(shí)間對發(fā)酵效果的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表2，數(shù)據(jù)方差分析見表3。由表2和表3可知，以活菌數(shù)為指標(biāo)，各個(gè)因素均顯著（P＜0.05），因素主次順序依次為菌種用量（B）＞溫度（A）＞時(shí)間（C），優(yōu)組合為A3B2C2，即菌種用量2.5%，發(fā)酵溫度36℃，發(fā)酵時(shí)間24 h；以產(chǎn)酸量為指標(biāo)，溫度（A）極顯著（P＜0.01），菌種用量（B）和時(shí)間（C）顯著（P＜0.05），因素主次順序?yàn)闇囟龋ˋ）＞菌種用量（B）＞時(shí)間（C），優(yōu)組合為A3B3C2，即發(fā)酵溫度36℃，菌種用量3.0%，發(fā)酵時(shí)間24 h。

表2 復(fù)合益生菌發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析

由于評價(jià)指標(biāo)不同，優(yōu)組合也不盡相同，主要表現(xiàn)在菌種用量（B）方面，分別有B2和B3兩種可能性。綜合考慮活菌數(shù)與產(chǎn)酸量2個(gè)指標(biāo)，在B2條件下活菌數(shù)最高，對產(chǎn)酸量的影響與B3差異不是特別大，且能降低菌種使用量，節(jié)約成本，最終確定A3B2C2為最優(yōu)組合，即發(fā)酵溫度36℃，菌種用量2.5%，發(fā)酵時(shí)間24 h。在此條件下，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，木瓜益生菌發(fā)酵飲料中的活菌數(shù)平均值為8.79 lg（cfu/mL），產(chǎn)酸量平均值為12.2 g/kg。

2.4 木瓜汁發(fā)酵前后品質(zhì)分析

以正交試驗(yàn)最優(yōu)工藝得到的木瓜益生菌發(fā)酵飲料和原始木瓜汁為測定對象，對木瓜汁發(fā)酵前后的總酸、游離態(tài)酚和結(jié)合態(tài)酚等指標(biāo)進(jìn)行比較，分析益生菌發(fā)酵對木瓜汁品質(zhì)的影響，結(jié)果見表4。總酸可直接反映發(fā)酵飲料的品質(zhì)，通過總酸的增幅也可反映益生菌的代謝能力［17］。游離態(tài)酚和結(jié)合態(tài)酚均有良好的抗氧化活性，但在相同劑量下，游離態(tài)酚的抗氧化活性要優(yōu)于結(jié)合態(tài)酚［18］。

從表4可以看出，益生菌發(fā)酵產(chǎn)生了新的有機(jī)酸，總酸含量增幅高達(dá)8.01%。另外，益生菌發(fā)酵使得木瓜汁中游離態(tài)酚和結(jié)合態(tài)酚的數(shù)量及比例發(fā)生明顯變化（P＜0.05）。游離態(tài)酚由原來的4.21 mg/g升為5.83 mg/g，增加了38.5%；結(jié)合態(tài)酚由原來的1.56 mg/g降為0.75 mg/g，減少了51.9%。這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中產(chǎn)生了中間代謝物質(zhì)，使得結(jié)合態(tài)酚的部分糖苷鍵、酯鍵發(fā)生分解，釋放出游離態(tài)酚，其作用機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

表4 益生菌發(fā)酵對木瓜汁品質(zhì)的影響

3 小結(jié)

通過逐級耐酸馴化，植物乳桿菌與類干酪乳桿菌均達(dá)到了馴化標(biāo)準(zhǔn)，可成功地應(yīng)用于木瓜汁的發(fā)酵。經(jīng)優(yōu)選，兩種益生菌的復(fù)配比例為4∶6。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以產(chǎn)酸量和活菌數(shù)為指標(biāo)，對發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行了L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得出木瓜益生菌發(fā)酵飲料的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度36℃，菌種用量2.5%，發(fā)酵時(shí)間24 h，各因素均顯著。在此條件下，飲料中的活菌數(shù)平均值為8.79 lg（cfu/mL），產(chǎn)酸量平均值為12.2 g/kg。復(fù)合益生菌發(fā)酵使得木瓜汁的品質(zhì)發(fā)生了較大的改善，表現(xiàn)為總酸含量增加8.01%，游離態(tài)酚增加38.5%，結(jié)合態(tài)酚減少51.9%。試驗(yàn)成功開發(fā)了木瓜復(fù)合益生菌發(fā)酵飲料，解決了益生菌馴化、發(fā)酵工藝等技術(shù)難題，可為木瓜的益生菌發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)及飲料產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考，具有較好的應(yīng)用推廣效果。