狄丹丹，王昭涵，胡 斌

(1.暨南大學質(zhì)譜儀器與大氣環(huán)境研究所，廣東 廣州 510632；2.暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632)

煙草燃燒的煙霧中含有大量有害物質(zhì)，吸煙被證實能夠誘導多種人體疾病的發(fā)生[1-3]，空氣中的二手煙霧會對人體的呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的健康產(chǎn)生影響[4-5]。人的眼睛每天長時間暴露于空氣環(huán)境中，在有煙草煙霧時，人眼不僅會感覺不適[6]，還可能誘導產(chǎn)生多種眼部疾病并造成視力下降[7-8]。人體淚液中含有大量的水、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細胞因子以及代謝物，這些成分除了保持眼球潤滑和免疫的生理功能，還能反映人體的生理病理狀態(tài)及環(huán)境暴露情況[9]。因此，通過對淚液中煙草特征成分的直接分析檢測，可以快速評估煙草煙霧在人眼的暴露水平。然而，由于人體淚液分泌量在微升級，常規(guī)的樣品采集與化學分析方法面臨巨大挑戰(zhàn)[10]，亟需無創(chuàng)、微量、高靈敏度的分析方法。

質(zhì)譜(MS)技術具有靈敏度高、特異性好和信號響應快等優(yōu)點，尤其是原位質(zhì)譜(ambient mass spectrometry)技術的發(fā)展，在無需或僅需簡單樣品預處理的條件下，可以實現(xiàn)包括人體體液在內(nèi)的復雜樣品的原位分析[11-12]。以紙、木簽、金屬針等固相基底材料為電噴霧電離探針的原位質(zhì)譜技術具有操作簡便、樣本消耗量少、分析速度快、靈敏度高等特點[13-15]，極大地推動了臨床人體體液分析技術的發(fā)展。醫(yī)用Schirmer試紙用于臨床檢驗干眼癥，具有安全、無創(chuàng)、吸水性好等特點，可以快速收集和測定微量體積的淚液[16]。在前期工作中，本課題組結(jié)合Schirmer試紙的無創(chuàng)采集與紙噴霧質(zhì)譜技術的特點，發(fā)展了基于Schirmer試紙的紙噴霧質(zhì)譜(PSMS)技術，探索了淚液成分的無創(chuàng)采集與質(zhì)譜分析[17]。

本工作將進一步微小化Schirmer試紙，實現(xiàn)人體在煙草煙霧環(huán)境暴露下微量淚液的精準無創(chuàng)收集，并采用紙噴霧質(zhì)譜方法測定煙霧的標志物尼古丁?？疾霺chirmer試紙噴霧質(zhì)譜檢測尼古丁的靈敏度、精密度、回收率、定量檢測線性范圍等分析性能，以及人體淚液中尼古丁含量與在煙草煙霧環(huán)境暴露時間的關系和尼古丁的滯留動力學。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Q Exactive四極桿-靜電軌道高分辨質(zhì)譜儀：美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品，配有納升電噴霧電離源(nano-ESI)及Xcalibur3.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，在正離子模式下采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.2 主要材料與試劑

尼古丁(NC)及其內(nèi)標物尼古丁-d4(NC-d4)標準溶液：美國Cerilliant公司產(chǎn)品；醫(yī)用Schirmer試紙：遼寧梅茲林藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；香煙(盒標煙氣煙堿量(即尼古丁)為1.2 mg/支)：廣東中煙工業(yè)有限責任公司產(chǎn)品；甲醇(HPLC級)：北京百靈威科技公司產(chǎn)品。

1.3 采樣方法

將購買的醫(yī)用Schirmer試紙(寬度5 mm，長度40 mm)剪成帶有尖端的細紙條(寬度2.5 mm，長度30 mm，尖端尺寸<0.1 mm)，示于圖1a；將紙條尖端輕輕觸碰眼角吸取淚液進行無創(chuàng)采樣，示于圖1b，根據(jù)紙條濕潤長度測定收集的淚液體積。將健康志愿者流出的淚液收集到1.5 mL離心管中用于制備加標樣品。本實驗受試者在簽署了知情同意書后參加關于煙草煙霧暴露的研究和淚液采集及分析。

注：a.細化Schirmer紙條；b.人體淚液采集；c.Schirmer紙噴霧質(zhì)譜示意圖；d.Schirmer紙噴霧質(zhì)譜實物裝置圖1 Schirmer紙噴霧電離質(zhì)譜測定淚液Fig.1 Schirmer PSMS analysis of human tears

1.4 實驗條件

1.4.1電離條件 將收集的紙條樣品靜置干燥后置于nanoESI裝置，試紙尖端與質(zhì)譜儀入口間的距離約4.0 mm，采用優(yōu)化的試劑(1.0 μL甲醇)和高壓電(3 kV)直接產(chǎn)生電噴霧電離后通過質(zhì)譜測定，示于圖1c，實物裝置示于圖1d。

1.4.2質(zhì)譜分析 質(zhì)譜離子傳輸管毛細管溫度150 ℃。使用全掃描(Full MS)和平行反應監(jiān)測(PRM)模式，分辨率分別為70 000和17 500，至少記錄30 s，掃描速率4.8次/秒，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500；對于MS/MS實驗，隔離窗口設置為0.4 u。測定樣品的質(zhì)譜圖以空白Schirmer試紙在純甲醇條件下為背景信號進行扣減。

1.5 標準溶液配制與標準曲線繪制

使用淚液配制濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/L尼古丁工作液，采用噴霧試劑甲醇配制內(nèi)標物尼古丁-d4(濃度為10.0 μg/L)。測定并計算尼古丁與尼古丁-d4的信號比值，每個濃度測定3次，取平均值，根據(jù)信號比值與尼古丁濃度的關系繪制標準曲線。

1.6 分析性能測試

在淚液中添加尼古丁標準溶液，配制尼古丁濃度分別為3.0、15.0、30.0 μg/L的加標樣品，采用加內(nèi)標的甲醇作為噴霧試劑，測定尼古丁與尼古丁-d4的信號比，每個濃度重復測定5次，計算重現(xiàn)性，并與工作曲線比對，計算回收率。逐級稀釋尼古丁加標的淚液，測得該方法的檢出限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10)。

2 結(jié)果與討論

2.1 淚液采集及電離條件考察

采用修剪好的Schirmer試紙測定0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 μL不同體積的淚液在紙條上潤濕的長度，觀測到淚液體積與濕潤長度具有線性關系，可用于淚液體積的定量分析，示于圖2a。同時發(fā)現(xiàn)，滴加1.0 μL淚液即可獲得細化后的Schirmer試紙超過5.0 mm的潤濕長度，具有較大的擴散度，滴加1.0 μL甲醇即可完全滿足噴霧電離實驗的要求，噴霧持續(xù)時間超過1 min，示于圖2a插圖。此外，考察了1.0 μL含有1 ng尼古丁的淚液在2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 kV不同噴霧電壓下的信號響應，發(fā)現(xiàn)噴霧電壓在3.0 kV時，質(zhì)子化尼古丁[M+H]+m/z163.122 7的信號響應最強，示于圖2b。

注：a.淚量與試紙濕潤長度的關系(插圖為1.0 μL淚液的信號持續(xù)時間)；b.電離電壓的優(yōu)化圖2 實驗條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of experimental parameters

2.2 淚液中尼古丁的檢測

首先，使用Schirmer試紙噴霧電離質(zhì)譜分析0.1 μg/L尼古丁與尼古丁-d4的甲醇溶液，獲得質(zhì)子化尼古丁的特征信號峰(尼古丁m/z163.122 7，尼古丁-d4m/z167.147 5)，示于圖3a。對尼古丁與尼古丁-d4離子進行二級質(zhì)譜掃描，其主要的碎片離子分別示于圖3b、3c。然后，使用修剪后的Schirmer試紙分別對暴露于正常環(huán)境與煙草煙霧環(huán)境下的志愿者眼淚進行無創(chuàng)采樣，對采集淚液的試紙條進行直接質(zhì)譜分析，同時進行一級質(zhì)譜掃描和m/z163.116 9離子的二級質(zhì)譜掃描。在正常大氣環(huán)境下，人體淚液中未檢測到尼古丁離子的特征信號及其碎片離子，示于圖4a；在暴露于煙霧的淚液中檢測到尼古丁的特征離子m/z163.122 7，并且其碎片離子與尼古丁標準品一致，示于圖4b。

圖3 尼古丁與尼古丁-d4的一級質(zhì)譜圖(a)，尼古丁(b)和尼古丁-d4(c)的二級質(zhì)譜圖Fig.3 MS spectrum of nicotine and nicotine-d4 (a), MS/MS spectra of nicotine (b) and nicotine-d4 (c)

實驗還考察了尼古丁的定量檢測性能，示于圖4c。尼古丁在0.5～50.0 μg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系(R2=0.991 8)，測得淚液中的尼古丁檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別為0.1 μg/L(S/N≥3)和1.0 μg/L(S/N≥10)。

為進一步評估方法的穩(wěn)定性，配制低、中、高3個濃度水平的尼古丁加標淚液，分別為3.0、15.0、30.0 μg/L，按照上述優(yōu)化方法分析測定，每個濃度平行操作5次，計算回收率和穩(wěn)定性，結(jié)果列于表1。可見，使用Schirmer紙噴霧電離質(zhì)譜分析檢測淚液中的尼古丁具有較好的精確度和穩(wěn)定性。

表1 尼古丁的回收率與相對標準偏差(n=5)Table 1 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the nicotine (n=5)

2.3 煙草煙霧環(huán)境暴露淚液分析

本實驗考察了4名成年不吸煙志愿者(3名女性和1名男性，年齡均在22～25歲之間)的淚液在煙霧環(huán)境下的暴露情況。在無風靜態(tài)環(huán)境下，距離志愿者眼睛約40 cm處點燃一支香煙，人眼暴露在煙草煙霧環(huán)境中0.5、1.0、3.0、5.0、8.0 min后，立即采用細化的Schirmer 試紙進行無創(chuàng)采樣，滴加1.0 μL 10.0 μg/L尼古丁-d4的甲醇溶液進行紙噴霧電離質(zhì)譜檢測，并根據(jù)淚液采集量(1.0 μL)及標準曲線計算檢測的尼古丁濃度，繪制暴露時間與尼古丁濃度的條狀圖，示于圖5a。人體淚液中尼古丁的濃度隨暴露時間的增加而增加，一支煙燃盡(約8.0 min)時，暴露在人淚液中的尼古丁濃度達到45.0 μg/L左右，暴露于眼睛的煙堿占煙草煙霧總煙堿的3.75×10-6%(根據(jù)盒標煙氣煙堿含量1.2 mg/支)，表明煙草煙霧中尼古丁在人眼中有較高的環(huán)境暴露水平。

注：a.未暴露于煙草煙霧環(huán)境的淚液質(zhì)譜圖(插圖為m/z 163.116 9離子的二級質(zhì)譜圖)； b.暴露于煙草煙霧環(huán)境的淚液質(zhì)譜圖(插圖為m/z 163.122 7離子的二級質(zhì)譜圖)； c.尼古丁信號比與濃度的關系圖圖4 淚液中尼古丁的質(zhì)譜測定Fig.4 Schirmer PSMS detection of nicotine in human tears

本實驗進一步考察了人眼中尼古丁的滯留動力學，在煙霧中暴露8 min后，即一支煙燃盡后，在暴露后的0、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0 min監(jiān)測淚液中尼古丁的含量變化，示于圖5b。結(jié)果表明，淚液中尼古丁的濃度隨時間增加而迅速下降，滯留動力學呈指數(shù)衰減曲線下降，滯留半衰期t1/2約為4 min；在20.0 min后，淚液中的尼古丁將代謝完全(<5.0%)，表明淚液中尼古丁已經(jīng)從眼部轉(zhuǎn)移至其他部位。

注：a.煙草煙霧環(huán)境下暴露時間；b.暴露8 min后淚液中尼古丁的滯留動力學圖5 暴露時間與滯留時間對淚液中尼古丁的影響Fig.5 Effects of exposure time and storage time on nicotine in tears

3 結(jié)論

本實驗采用Schirmer試紙采集微量人體淚液，并結(jié)合紙噴霧質(zhì)譜分析，考察了該方法的分析性能，檢測了人眼暴露在煙草煙霧環(huán)境不同時間下淚液中尼古丁的濃度變化，并探索了淚液中尼古丁的滯留動力學。結(jié)果表明，該方法活體無創(chuàng)、靈敏、快速，有望結(jié)合小型質(zhì)譜儀器用于現(xiàn)場分析[18]，為眼部疾病診斷與環(huán)境健康研究提供了有效的方法。