郭基恒，洪 義，蔣 濤，周 鵬，朱 輝，陳劍松，黃 保，黃正旭，周 振

(1.暨南大學(xué)質(zhì)譜儀器與大氣環(huán)境研究所，廣東 廣州 510632；2.廣州禾信儀器股份有限公司，廣東 廣州 510530；3.昆山禾信質(zhì)譜技術(shù)有限公司，江蘇 昆山 215300)

瘦肉精是一類具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，顯著提高瘦肉率的藥物，其能增加蛋白質(zhì)生成，促進(jìn)脂肪降解，曾在畜牧業(yè)生產(chǎn)中被當(dāng)作生長(zhǎng)促進(jìn)劑而得到廣泛應(yīng)用[1]。但添加和飼喂過多的瘦肉精會(huì)造成動(dòng)物組織器官藥物殘留，人們?cè)谑秤迷搫?dòng)物組織器官后可能出現(xiàn)肌肉震顫、頭疼、嘔吐等不良反應(yīng)，特別對(duì)高血壓、心臟病、甲亢等患者的危害極大，嚴(yán)重者可致死亡[2]。為了遏制瘦肉精濫用，我國于2002年出臺(tái)了《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物目錄》[3]法規(guī)，將鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等瘦肉精列為禁用藥物。然而，在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，不法商販為了減少飼料使用而降低成本，在飼料中添加瘦肉精使禽畜盡早成熟。為了有效監(jiān)管市場(chǎng)，減少此類事件的發(fā)生，發(fā)展食品安全快速檢測(cè)技術(shù)是非常必要的。

目前，瘦肉精殘留的檢測(cè)方法主要有液相色譜法(LC)[4]、液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[5]，氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[6]和酶聯(lián)免疫法(ELISA)[7]。其中，HPLC-MS和GC-MS法雖然具有較高的靈敏度，但操作過程繁瑣，檢測(cè)效率較低，難以滿足大批量樣品的檢測(cè)要求[8]；酶聯(lián)免疫法具有特異性強(qiáng)、靈敏、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[9]，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查，但容易受到基質(zhì)的影響出現(xiàn)假陽性，且不能同時(shí)檢測(cè)多類藥物。近年來，新型常壓電離技術(shù)的發(fā)展在一定程度上彌補(bǔ)了上述傳統(tǒng)方法的缺陷。2004年，Cooks教授等[10]提出了常壓電離質(zhì)譜技術(shù)(AIMS)，因其分析速度快、無需復(fù)雜的樣品前處理、可實(shí)時(shí)直接分析等特點(diǎn)，得到了廣泛應(yīng)用。近幾十年來，國內(nèi)外科研工作者提出了30多種常壓電離源[11]，如介質(zhì)阻擋放電電離(DBDI)[12]、實(shí)時(shí)直接分析技術(shù)(DART)[13]、低溫等離子體(LTP)[14]和微波等離子體炬(MPT)[15]等，這些電離源已被應(yīng)用于食品安全篩查中。例如，葉倩等[16]利用介質(zhì)阻擋放電技術(shù)快速篩查飼料和雞肉中磺胺類物質(zhì)；Khaled等[17]利用實(shí)時(shí)直接分析技術(shù)對(duì)牛組織中多類獸藥進(jìn)行快速分析。目前，國內(nèi)利用等離子體質(zhì)譜技術(shù)研究磺胺類獸藥的報(bào)道較多[18-19]，而對(duì)瘦肉精的研究卻少有報(bào)道。

基于本課題組的前期研究[20]，該實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步對(duì)熱解吸低溫等離子體(TD-LTP)離子源的氦氣流速和解吸溫度進(jìn)行優(yōu)化。在高溫?zé)峤馕鼦l件下，實(shí)現(xiàn)對(duì)瘦肉精的快速電離，從而建立一種快速篩查飼料中瘦肉精的有效方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

熱解吸低溫等離子體質(zhì)譜儀(TD-LTP-MS)：廣州禾信儀器股份有限公司產(chǎn)品；TD6B低速離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；PB-100均質(zhì)器：德國PRIMA公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

西馬特羅(cimaterol)、特布他林(terbutaline)、西布特羅(cimbuterol)、克倫特羅(clenbuterol)、馬布特羅(mabuterol)、馬賁特羅(mapenterol)標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心產(chǎn)品；乙腈、甲酸：均為色譜純，美國Aladdin公司產(chǎn)品；N-丙基乙二胺(PSA)粉末、C18粉末：天津博納艾杰爾公司產(chǎn)品；飼料：雙胞胎飼料有限公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg西馬特羅、特布他林、西布特羅、克倫特羅、馬布特羅、馬賁特羅，配制成1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋，得到2.5～500 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃冰箱中保存。

2.2 樣品制備

稱取(2.00±0.02) g飼料于50 mL離心管中，加入10 mL 0.1%甲酸-乙腈溶液，振蕩提取5 min，以2 500 r/min離心2 min。取上清液，加入250 mg PSA和50 mg C18，渦旋2 min，再以2 500 r/min離心2 min，取上清液，置于4 ℃冰箱中保存。

2.3 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)搭建

離子源條件：TD-LTP離子源與質(zhì)譜口呈30°放置；低溫等離子體流出口與質(zhì)譜口水平距離10 mm；等離子體束高于質(zhì)譜口中心約3 mm。質(zhì)譜條件：垂直引入式大氣壓飛行時(shí)間質(zhì)譜(15 000 FWHM)，正離子模式，離子傳輸管溫度90 ℃；載體為聚四氟乙烯帶；加熱平臺(tái)凹槽位于質(zhì)譜口正下方3 mm處，用于直接加熱聚四氟乙烯帶上的樣品液滴。實(shí)驗(yàn)過程中，待低溫離子體射流和加熱溫度穩(wěn)定后，用移液槍吸取10 μL樣品滴于聚四氟乙烯帶中心，通過傳送裝置將樣品傳送至質(zhì)譜口正下方。TD-LTP源原理圖示于圖1。

圖1 TD-LTP源原理示意圖(a)和實(shí)物圖(b)Fig.1 Schematic diagram (a) and real device diagram (b) of TD-LTP

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

3.1.1氦氣流速對(duì)解吸效果的影響 氦氣流速是影響TD-LTP源性能的重要因素之一，提高氦氣流速可以增加Hem和N2+等活性物質(zhì)，從而提高電離效果[21]。本實(shí)驗(yàn)以100 μg/L西馬特羅、特布他林、西布特羅、克倫特羅、馬布特羅、馬賁特羅6種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為樣本，考察氦氣流速在0.3～1.9 L/min范圍內(nèi)對(duì)樣品信號(hào)的影響，結(jié)果示于圖2a。在低流速情況下，隨著流速的增加，樣品信號(hào)強(qiáng)度有顯著增強(qiáng)，在0.9～1.2 L/min范圍內(nèi)達(dá)到最強(qiáng)；流速繼續(xù)增加，樣品信號(hào)強(qiáng)度減弱，這可能是由于氣流太大導(dǎo)致TD-LTP源放電不穩(wěn)定。因此，設(shè)定氦氣流速為1.0 L/min。

3.1.2加熱溫度對(duì)解吸效果的影響 低溫等離子體射流本身溫度較低，難以將高沸點(diǎn)液態(tài)樣品從溶劑中解吸出來，嚴(yán)重影響了TD-LTP源離子化效果，而通過對(duì)樣品加熱可以有效提高樣品解吸效果，提高樣品濃度。本實(shí)驗(yàn)以6種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為樣本，考察了熱解吸溫度在150～250 ℃范圍內(nèi)對(duì)樣品信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度的影響，結(jié)果示于圖2b?？梢姡S著溫度的升高，目標(biāo)離子的響應(yīng)強(qiáng)度顯著增加，在200～220 ℃范圍內(nèi)達(dá)到最高值且穩(wěn)定；而繼續(xù)升高溫度響應(yīng)強(qiáng)度下降。因此，選定熱解吸溫度為210 ℃。

3.2 定性分析

根據(jù)苯環(huán)上取代基不同，將瘦肉精劃分為胺取代型、酚羥基取代型和鹵取代型，瘦肉精分子結(jié)構(gòu)中存在共性，即均具有苯乙醇胺基本結(jié)構(gòu)。6種瘦肉精的沸點(diǎn)、母離子和子離子信息列于表1。

表1 6種瘦肉精的沸點(diǎn)、母離子和子離子信息Table 1 Boiling points, parent ions and daughter ions of 6 lean meat essence

在正離子模式下，利用TD-LTP-MS對(duì)6種瘦肉精的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析。苯乙醇胺上的—NH—基團(tuán)易與氫離子結(jié)合，形成質(zhì)子化的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+。通過調(diào)節(jié)大氣壓接口處電壓[22](如Voutplate和Vskimmer)，可使準(zhǔn)分子離子碎裂產(chǎn)生碎片離子，示于圖3。以特布他林為例，被TD-LTP離子源電離后得到特布他林準(zhǔn)分子離子m/z226.141 1 [M+H]+，通過調(diào)控Voutplate和Vskimmer，準(zhǔn)分子離子脫去1分子水以及與苯乙醇胺—NH—相連的基團(tuán)，得到碎片離子m/z152.064 2 [M+H—H2O—C4H8]+。其他幾種瘦肉精也有類似的電離及碎裂過程，相關(guān)裂解規(guī)律與文獻(xiàn)[23]報(bào)道一致。

注：a.氦氣流量?jī)?yōu)化；b.熱解吸溫度優(yōu)化圖2 TD-LTP源條件優(yōu)化曲線Fig.2 Condition optimization curves of TD-LTP

注：a.西馬特羅；b.特布他林；c.西布特羅；d.克倫特羅；e.馬布特羅；f.馬賁特羅圖3 6種瘦肉精的TD-LTP-MS圖Fig.3 TD-LTP-MS mass spectra of 6 lean meat essence

3.3 定量分析

3.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限 以豬飼料為基質(zhì)，配制5、10、25、50、100、250、500 μg/kg溶液，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后，每個(gè)濃度進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)。以瘦肉精濃度為橫坐標(biāo)，準(zhǔn)分子離子峰峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果示于圖4。可見，6種瘦肉精在5～500 μg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不小于0.992，以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算的檢出限(LOD)為1.2～3.1 μg/kg，結(jié)果列于表2。

表2 6種瘦肉精的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限Table 2 Linear ranges, correlation coefficients, LODs of 6 lean meat essence

圖4 瘦肉精濃度與特征離子峰響應(yīng)強(qiáng)度的關(guān)系Fig.4 Relationship between concentration of lean meat essence and intensity of characteristic ions

3.3.2方法回收率與精密度 以空白豬飼料添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行回收率測(cè)定。在5、50、500 μg/kg的添加水平下，進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算西馬特羅、特布他林、西布特羅、克倫特羅、馬布特羅、馬賁特羅等6種瘦肉精的回收率為71.4%～119.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15.2%，結(jié)果列于表3。

表3 6種瘦肉精的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and RSDs of 6 lean meat essence

3.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

按照2.2節(jié)方法對(duì)市場(chǎng)上常見的3種飼料進(jìn)行前處理，在3.1節(jié)實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣分析，通過比較監(jiān)測(cè)離子的豐度判定樣品中是否含有瘦肉精。3種飼料中均未檢出瘦肉精。

4 結(jié)論

本研究利用熱解吸低溫等離子體結(jié)合飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)飼料中6種瘦肉精進(jìn)行快速檢測(cè)。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，得到了最佳的解吸溫度和氦氣流速。通過0.1%甲酸-乙腈溶液提取、吸附劑凈化對(duì)飼料進(jìn)行前處理后，6種瘦肉精的檢出限均低于3.1 μg/kg，滿足快速篩查的需求。該方法具有分析速度快、準(zhǔn)確度高、消耗試劑少等優(yōu)點(diǎn)，在高通量快速篩查飼料方面有著廣闊的應(yīng)用前景。