朱騰高，陳 靜，吳德波，李發(fā)亮，徐加泉

(1.東華理工大學，江西省質譜科學與儀器重點實驗室，江西 南昌 330013； 2.江西正譜奕和科技有限公司，江西 南昌 330000)

雞蛋殼的形成過程為成熟的卵泡進入輸卵管，輸卵管分泌的蛋白將卵黃包住，然后逐漸下行形成內外殼膜，最后到達子宮部，子宮部利用自身代謝產(chǎn)生的CO2在碳酸酐酶的作用下與水結合成H2CO3，H2CO3解離產(chǎn)生CO32-，CO32-再與血液中的Ca結合形成CaCO3，CaCO3均勻的沉積于蛋殼膜上，形成堅硬的蛋殼[1]。蛋殼從外到內依次為表皮層，柵層和突起層，以及纖維膜層[2]。表皮層是蛋殼最外面的包圍部分，主要由含鈣鹽較多的物質組成；柵層為從內部的突起層發(fā)散至表皮層，其形狀是板條狀晶體結構；突起層為蛋殼內層，蛋殼的晶體發(fā)育由此而起，一般為乳狀；在蛋殼的內部還有纖維膜層，由蛋白質網(wǎng)狀纖維組成。對于一般的雞蛋殼[3]，表皮層大約厚10 μm，起到防水層的作用，主要由蛋白質類組成(90%)，其他物質是碳水化合物和油脂。柵層和突起層主要由以蛋白質為基體的復合材料組成，包括95%碳酸鈣、3.3%蛋白質和1.6%水分。柵層較為致密和堅硬，以彈性較好的多孔質為基體。總體來說，雞蛋殼的基本成分是CaCO3，含量大約為83%～85%，蛋白質含量為15%～17%，并含有鋅、銅、錳、鐵、硒等微量元素[4]。分析雞蛋殼中微量元素，不僅可以判斷雞蛋的質量，如是否重金屬超標，還可以鑒別雞蛋的產(chǎn)地。另外，通過判斷雞蛋殼中微量元素的含量和種類，可以了解母雞攝入微量元素的情況及母雞的健康狀況。

目前，固體樣品中微量元素的分析通常采用強酸或強堿等化學試劑將樣品中相應的組分提取出來，制備待測液，然后使用原子發(fā)射光譜法(AES)[5]、原子吸收光譜法(AAS)[6]或電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)[7]離線檢測待測液，獲得元素組成及含量信息，但這些離線方法需要繁瑣的樣品預處理過程，分析效率和通量較低[8]。而激光剝蝕電感耦合等離子體質譜(LA-ICP-MS)[9]、X射線熒光[10]等方法雖然能實現(xiàn)固體樣品中微量元素的直接分析，但在定量分析方面存在不足。比如LA-ICP-MS的定量分析需要采用與待測樣品基體相匹配的標準樣品進行校正，對于許多待測樣品來說，獲得相應的標準物質非常困難。

本課題組基于前期常壓質譜分析基礎[11-15]，發(fā)展了一種順次電離質譜分析技術，即基于組分的理化性質，調控試劑與樣品進行作用(包括萃取、反應等)，對混雜樣品中的組分進行順次提取。同時，為了提高提取效率，可對體系施加超聲、微波、加熱等不同形式的能量。順次提取的組分經(jīng)不同的電離方式(如電噴霧電離源、電感耦合等離子電離源)電離后進入質譜儀檢測。該技術具有僅需少量樣品預處理、分析速度快、檢測靈敏度高、樣品消耗量小等優(yōu)點，已實現(xiàn)了合金[16-17]、組織[18]、礦樣[19-20]等不同混雜樣品中有機及無機組分的順次電離分析。

為此，本研究將基于順次電離質譜分析技術，建立一種可用于雞蛋殼中微量元素快速分析的質譜方法。該方法將在ICP-MS前端耦合在線提取裝置，將微量待測雞蛋殼樣品放置于在線提取裝置中，先后采用水和稀硝酸分別對雞蛋殼中的微量元素進行提取，提取的組分實時在線傳輸至ICP-MS進行分析檢測，以獲取雞蛋殼中微量元素信息。本文將采用該方法對贛州鮮土雞蛋、贛州營養(yǎng)雞蛋、贛州草雞蛋、毛庵村毛氏雞蛋以及泰和土雞蛋不同部位(小頭、中部、大頭)中15種微量元素(Na、K、Mg、Cr、Mn、Fe、Zn、Cu、Pb、Al、Cd、As、Sn、Ni、Ti)水溶性組分和酸溶性組分進行分析。

1 實驗部分

1.1 儀器裝置

iCAP RQ電感耦合等離子體質譜儀：美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，配有Qtegra數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；順次電離在線洗脫裝置：江西省質譜科學與儀器重點實驗室自制；UPHW-111-90T優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)：四川優(yōu)普超純科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

濃硝酸(質量濃度65%，分析純)：國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；二次去離子水(18.2 MΩ·cm)：由超純水系統(tǒng)制備；定量濾紙：杭州特種紙業(yè)有限公司產(chǎn)品；氬氣、氦氣(99.999%)：贛州輝浩氣體有限公司產(chǎn)品；塑料尖嘴鑷子：使用前用5%稀硝酸清洗。

取2.2 mL 65%硝酸，在攪拌下緩慢滴加至98 mL純凈水中，配制成2%稀硝酸；取5.5 mL 65%硝酸，在攪拌下緩慢滴加至95 mL純凈水中，配制成5%稀硝酸。

贛州鮮土雞蛋、贛州營養(yǎng)雞蛋、贛州草雞蛋、毛庵村毛氏土雞蛋、江西吉安泰和土雞蛋：購自當?shù)爻小?/p>

1.3 實驗條件

霧化氣流速1.1 L/min，輔助氣流速0.8 L/min，等離子氣流速14.0 L/min，透鏡電壓9.25 V，射頻功率1 550 W，模擬檢測器電壓-1 900 V，數(shù)字檢測器電壓1 000 V，動能歧視(KED)模式，其他條件由質譜儀自動優(yōu)化獲得。

1.4 實驗過程

用干凈的尖嘴鑷子將雞蛋從中部戳開，倒出蛋黃和蛋清，注意避免污染雞蛋殼。用尖嘴鑷子分別取1 mm×1 mm小頭頂部、蛋殼中部(蛋殼高度一半處)、大頭頂部的雞蛋殼，需要去除雞蛋殼內層的半透膜。

首先，根據(jù)所需分析的元素確定特征信號(m/z)；然后，搭建圖1裝置，淋洗液分別為超純水和5%硝酸，淋洗液流速0.3 mL/min，輸液管路內徑0.3 mm，超聲功率120 W，加熱溫度60 ℃，2%稀硝酸以0.3 mL/min流速與提取后的金屬溶液進行在線混合，以提供ICP-MS檢測所需要的酸性條件。將取好的雞蛋殼樣品直接放置于順次電離在線洗脫裝置中，從0時刻開始，首先采用水溶液作為洗脫劑，對雞蛋殼進行在線淋洗，以提取樣品表面的微量元素組分，然后在線輸送至ICP-MS進行檢測，實時監(jiān)測水溶性微量元素組分信號，當信號降至基線后，表示水溶性組分提取結束；然后將水溶液更換為5%稀硝酸溶液，繼續(xù)淋洗雞蛋殼，并通過ICP-MS實時監(jiān)測稀硝酸提取液，以檢測雞蛋殼中酸溶性微量元素組分信息，當組分信號降至基線后，分析結束。

圖1 順次電離分析裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of sequential ionization analysis device

2 結果與討論

2.1 雞蛋殼不同部位微量元素分析

首先選取贛州鮮土雞蛋，根據(jù)順次電離分析流程，對雞蛋殼小頭、中部以及大頭3個不同部位上的Na、K、Mg、Cr、Mn、Fe、Zn、Cu、Pb、Al、Cd、As、Sn、Ni、Ti等15種微量元素水溶性組分和酸溶性組分進行分析。利用質譜高通量的檢測特性，通過單次分析流程，可在10 min內獲得單個樣品中15種微量元素的信息。由于不同雞蛋殼樣品及不同樣品的分析時長均存在一定的差異，整個分析過程大約耗時10 min。

雞蛋中部K元素的順次電離質譜分析離子流圖示于圖2。可以看出，在50 s和400 s處有2個明顯的信號峰，根據(jù)實驗分析過程可知，其分別為水溶性和酸溶性鉀元素的信號峰。

圖2 贛州鮮土雞蛋蛋殼中部水溶性和酸溶性K組分的順次電離質譜分析離子流圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of water-soluble and acid-soluble potassium on the middle part of the eggshell from Ganzhou fresh native eggs

贛州鮮土雞蛋蛋殼不同部位15種微量元素水溶性和酸溶性組分分析結果示于圖3?？梢钥闯觯琋a是含量最豐富的元素，其次為Mg、Ti、K、Cr、Pb、Fe、Zn、Ni、Cu等元素，幾乎觀察不到Mn、Al、As、Cd、Sn等元素，而且對于大部分元素，酸溶性組分含量高于水溶性組分。在空間分布上，不同元素在小頭、中部和大頭3個部位的分布情況不同，如Na、K、Pb在小頭部位分布較多， Mg、Ti在中部的分布略多于小頭和大頭部位，而Cr、Fe在3個部位的分布幾乎相同?？梢?，不同微量元素在雞蛋殼不同部位的分布具有顯著差異。

圖3 贛州鮮土雞蛋蛋殼不同部位15種微量元素水溶性和酸溶性組分檢測結果(n=3)Fig.3 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell from Ganzhou fresh native eggs (n=3)

2.2 不同類型雞蛋蛋殼表面微量元素分析

為了進一步考察不同類型雞蛋蛋殼表面微量元素的分布情況，實驗選取了贛州營養(yǎng)雞蛋和贛州草雞蛋進行順次電離質譜分析，結果示于圖4、圖5。從圖4可以看出，贛州營養(yǎng)雞蛋中Na依然是含量最高的元素，其次為Mg、Ti、Cr、Fe、K、Zn、Pb、Ni、Cu、Mn、Al等元素，而幾乎未檢測到Cd、As、Sn等元素。在形態(tài)分布上，不同元素具有不同的分布特征，對于Na、K、Mg、Zn、Pb，其水溶性組分大于酸溶性組分；而對于Cr、Fe、Ti，其酸溶性組分大于水溶性組分。在空間分布上，不同元素也具有顯著差別，Cr、Fe、Cu、Pb在小頭、中部和大頭部位分布差別不大；Na、K、Mg、Ti在中部分布最少，而在小頭和大頭部位分布較多，但差別不大。

圖4 贛州營養(yǎng)雞蛋蛋殼不同部位15種微量元素水溶性和酸溶性組分檢測結果(n=3)Fig.4 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell from Ganzhou nutritional eggs (n=3)

圖5 贛州草雞蛋蛋殼不同部位15種微量元素水溶性和酸溶性組分檢測結果(n=3)Fig.5 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell from Ganzhou grass eggs (n=3)

從圖5可以看出，贛州草雞蛋蛋殼中微量元素含量最高的依然是Na，其次為Zn、K、Mg、Fe、Ti、Pb、Cu等元素，而Cr、Mn、Al、Cd、As、Sn、Ni等元素的含量非常少。在形態(tài)分布上，Na、K、Zn以水溶性組分為主，Mg、Ti以酸溶性組分為主，F(xiàn)e的水溶性和酸溶性組分含量幾乎相同。在空間分布上，Na、K、Zn在小頭和中部分布較多，Mg在大頭部位分布較多，F(xiàn)e在中部分布較多，而Ti在小頭、中部和大頭3個部位的分布幾乎一樣。

通過對比圖3、4、5可以發(fā)現(xiàn)，這3種雞蛋雖然都產(chǎn)自同一地方，但由于養(yǎng)殖方式和喂食原料不同，雞蛋蛋殼中微量元素的含量、形態(tài)以及分布均有顯著差異。比如，草雞蛋中微量元素含量明顯高于另外2種雞蛋；鮮土雞蛋蛋殼中K主要以酸溶性組分存在，而營養(yǎng)雞蛋和草雞蛋蛋殼中K主要以水溶性組分存在；鮮土雞蛋蛋殼中Mg在中部分布最多，而在營養(yǎng)雞蛋和草雞蛋中，Mg在中部分布最少?？梢姡u蛋蛋殼中微量元素信息具有非常明顯的“指紋”特性，利用這些特性可以有效區(qū)分同一產(chǎn)地不同種類雞蛋，在質量監(jiān)控方面具有潛在的應用價值。

2.3 不同產(chǎn)地雞蛋蛋殼表面微量元素分析

為了進一步考察不同產(chǎn)地雞蛋蛋殼中微量元素的差別，選取了毛庵村毛氏土雞蛋和江西吉安泰和土雞蛋進行分析，結果示于圖6、圖7。從圖6可以看出，毛庵村毛氏土雞蛋中Na依然是含量最高的元素，其次為Mg、Ti、Cr、Zn、K、Fe、Pb、Cu等元素，而Mn、Al、Cd、As、Sn、Ni元素含量非常少。在形態(tài)分布上，Na、K、Zn、Pb、Cu均以水溶性組分為主，Mg、Cr、Ti以酸溶性組分為主，而Fe的水溶性和酸溶性組分幾乎相同。在空間分布上，Na主要分布于大頭部位，Zn主要分布于小頭部位，Mg、Cr、Fe、Ti在中部的含量最低，而在小頭和大頭部位的分布相差不大。

圖6 毛庵村毛氏土雞蛋蛋殼不同部位15種微量元素水溶性和酸溶性組分檢測結果(n=3)Fig.6 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell of Maoancun Maoshi native eggs (n=3)

圖7 泰和土雞蛋蛋殼不同部位15種微量元素水溶性和酸溶性組分檢測結果(n=3)Fig.7 Analytical result of 15 trace elements with water-soluble and acid-soluble fractions on different parts of the eggshell from Taihe native eggs (n=3)

從圖7可以看出，泰和土雞蛋蛋殼中Na依然是含量最高的元素，但是Ti、Mg、Cr、Fe等元素的比例相比于毛庵村毛氏土雞蛋和贛州土雞蛋都有明顯增加，Al、Cd、As等元素含量依然很低。在形態(tài)分布上，Mg、Cr、Fe、Pb、Ti均以酸溶性組分為主，而K、Zn以水溶性組分為主。在空間分布上，Na、K、Cr、Fe、Pb等在小頭、中部和大頭部位的含量相差不大，Mg、Zn在中部含量略高于兩端，Ti在大頭部位的分布最多。

對比圖3、6、7可以發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地同類雞蛋蛋殼中微量元素的含量、形態(tài)、分布具有顯著差異，不同雞蛋之間具有特征的微量元素信息“指紋”，利用這些指紋信息，可有效區(qū)分不同產(chǎn)地的同類型雞蛋。

2.4 顯著性差異表征

為了表征不同種類雞蛋之間結果的差異性，采用平均值±標準差表示連續(xù)變量，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較5種雞蛋之間各元素含量的差異，所有的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均在IBM SPSS 22.0軟件上完成。5種雞蛋不同部位酸提取和水提取的顯著性差異表征結果示于圖8?？梢钥闯觯治鼋Y果之間具有顯著差異，p值均小于0.001，表明由微量元素構成的“指紋譜”可用于鑒別雞蛋的來源和品質。

注：a.小頭(水)；b.中頭(水)；c.大頭(水)；d.小頭(酸)；e.中頭(酸)；f.大頭(酸)；*代表p<0.001圖8 5種雞蛋不同部位水提取及酸提取微量元素分析結果差異性Fig.8 Difference of the analytical results of the trace elements extracted from different parts of 5 kind of eggs

導致不同種類雞蛋蛋殼中金屬元素不同的因素很多。根據(jù)蛋殼的形成過程可知，其中的金屬元素主要來源于血液，而血液中的金屬元素主要來源于攝取的食物和水。其中，對于養(yǎng)殖雞，其差異主要取決于飼料和水；而對于放養(yǎng)雞，由于其食物來源較復雜，將具有較強的地域特色。此外，由于運動、光照等因素會影響金屬元素的吸收，也是導致血液中金屬元素含量不同的原因。實驗結果表明，贛州草雞蛋蛋殼中的微量金屬元素含量顯著高于其他種類雞蛋，這與其放養(yǎng)過程中食物的復雜性和運動有關，其在放養(yǎng)過程中會大量攝入環(huán)境中的食物和水，其金屬含量將高于飼料中的金屬含量，而且運動有助于提高食物的攝入量。

3 結論

本工作耦合在線提取與ICP-MS分析，發(fā)展了一種雞蛋殼中微量元素順次分析的質譜方法。該方法具有樣品預處理少、分析速度快(10 min)、樣品消耗量小(1 mm×1 mm)、元素信息豐富(15種微量元素水溶性和酸溶性信息)等優(yōu)點。采用該方法成功獲得了贛州土雞蛋、贛州營養(yǎng)雞蛋、贛州草雞蛋、毛庵村毛氏土雞蛋、吉安泰和土雞蛋中15種微量元素含量、形態(tài)及分布信息。結果顯示，整合雞蛋蛋殼上微量元素的含量、形態(tài)和分布信息可構建雞蛋“指紋譜”，該“指紋譜”與雞的飼料、水、運動、光照等因素有關，不同種類雞蛋的微量元素“指紋譜”具有顯著區(qū)別(p<0.001)，該“指紋譜”可為雞蛋種類鑒別和質量鑒定提供參考。

致謝：感謝國家鎢與稀土產(chǎn)品質量監(jiān)督(贛州)檢驗中心為本工作提供的幫助。