耿 欣，王新新，李紅麗

(南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇省生物醫(yī)學(xué)功能材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

吸煙不僅可以引起慢性肺病、肺癌，還與心血管疾病、腦中風(fēng)、慢性支氣管炎等多種疾病相關(guān)[1-2]。卷煙煙霧是包含6 000多種化學(xué)物質(zhì)的復(fù)雜混合體系，通常分為主流煙氣(MSS)和側(cè)流煙氣(SSS)兩種。MSS可以直接進(jìn)入人體，其中含有大量的一氧化碳(CO)、多環(huán)芳烴、亞硝胺、揮發(fā)性羰基化合物和揮發(fā)性酚等強(qiáng)致癌物質(zhì)，對(duì)人體健康產(chǎn)生極大危害[3-4]。因此，建立香煙主流煙氣中物質(zhì)成分的高效分析方法，對(duì)研究和理解吸煙對(duì)人體健康的影響極為重要。

主流煙氣(MSS)是一種氣溶膠顆粒，由顆粒物和氣相物組成。劍橋?yàn)V片將大于0.1 μm的粒相物截留，氣相部分則能通過濾片[5]。目前，主流煙氣的分析方法主要有光學(xué)分析法[6]、色譜法[7]和質(zhì)譜法等[8]。其中，光學(xué)分析法簡(jiǎn)單、快速，但不適用于復(fù)雜樣品體系中多種物質(zhì)的分析；色譜法分離耗時(shí)，方法建立和優(yōu)化繁瑣，且單一色譜分析對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品的定性能力差；質(zhì)譜法是物質(zhì)鑒定和結(jié)構(gòu)解析強(qiáng)有力的工具，通過與色譜聯(lián)用可對(duì)樣品進(jìn)行分離和分析。然而，在色譜-質(zhì)譜聯(lián)用中，受色譜時(shí)效的限制，分析效率有待提高[9]。原位電離質(zhì)譜(AIMS)可在環(huán)境條件下，將樣品直接暴露于電離介質(zhì)中進(jìn)行電離和分析，操作簡(jiǎn)便[10-12]。實(shí)時(shí)直接分析離子源(DART)是Cody等[13]于2005年開發(fā)的一種原位電離離子源，其在大氣壓環(huán)境下進(jìn)行操作，無需或僅需簡(jiǎn)單的樣品前處理，可直接對(duì)固體、液體、氣體樣品進(jìn)行快速電離和直接分析[14]。DART離子源通過由輝光放電產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)等離子體熱氣流對(duì)化合物進(jìn)行熱脫附，然后與樣品之間進(jìn)行潘寧電離(PI)使樣品離子化。近年來，DART已經(jīng)應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、衛(wèi)生等多個(gè)領(lǐng)域[15]，但主要用于特定目標(biāo)物的篩查分析。本課題組[16-17]使用DART-MS分析了主流煙氣的成分，結(jié)果表明，本方法對(duì)復(fù)雜樣品體系有較好的分析能力。

卷煙煙氣是一個(gè)復(fù)雜的樣品體系，物質(zhì)種類多，且多個(gè)物質(zhì)的成分含量低。樣品富集是煙氣成分分析的重要步驟。固相微萃取(SPME)由Furton等[19]在20世紀(jì)90年代建立。最初是為了縮短氣相色譜(GC)的樣品前處理時(shí)間，通過在石英玻璃纖維上涂有一定的固定相，對(duì)樣品進(jìn)行富集和純化，主要用于氣相色譜分析中的頂空富集[18]。當(dāng)SPME探針表面涂有不同材料的涂層時(shí)，如C18(非極性)、PDMS/DVB(極性)可對(duì)不同性質(zhì)的物質(zhì)萃取富集[20-21]。SPME具有樣品用量少、提取效率高、方便快捷等特點(diǎn)，已在多個(gè)領(lǐng)域的復(fù)雜基質(zhì)樣品前處理過程中展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[22]。樣品前處理技術(shù)與DART-MS的有效結(jié)合，對(duì)提高卷煙煙氣成分的分析性能非常重要。

本工作擬以主流煙氣粒相物為研究對(duì)象，采用SPME與高分辨DART-MS直接耦合的方法分析復(fù)雜卷煙煙氣成分。采用SPME探針對(duì)樣品直接富集，在DART離子源中，使SPME上吸附的物質(zhì)快速解吸附并電離，使用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

實(shí)時(shí)直接分析離子源(DART-SVP)：美國(guó)Ion Sense Inc公司產(chǎn)品；高分辨率Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；Whatman 44 mm劍橋?yàn)V片：英國(guó)Whatman公司產(chǎn)品；10 mL注射器：江蘇科勒醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；TGL16M離心機(jī)：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；親水PTFE針式濾器：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品；電子分析天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；水浴恒溫振蕩器：上海百典儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；MX-S型渦旋振蕩器：美國(guó)Scilogex公司產(chǎn)品；微型振蕩器(micro plate shaker)：印度Euation公司產(chǎn)品；D3820-07方孔型96孔深孔板：上海阿拉丁生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

甲醇(CH3OH)、乙腈(CH3CN)：高效液相色譜純，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；純凈水：南京娃哈哈有限公司產(chǎn)品；乙酸銨(CH3COONH4)粉末：南京晚晴化玻儀器有限公司；標(biāo)準(zhǔn)研究香煙(1R5F)：美國(guó)肯塔基大學(xué)產(chǎn)品；混合型香煙1、混合型香煙2、烤煙1、烤煙2、雪茄：均購(gòu)自超市，使用前于-20 ℃冷藏48 h；65 μm PDMS-DVB SPME探針和C18 SPE-it探針：美國(guó)Supelco公司產(chǎn)品。

1.3 樣品制備

1.3.1主流煙氣粒相物溶液的制備 以混合型香煙1為例，將直徑為44 mm的劍橋?yàn)V片放置于卷煙夾持器中，卷煙夾持器一端插入香煙，另一端連接10 mL注射器。用電動(dòng)打火機(jī)點(diǎn)燃香煙，拉動(dòng)注射器的活塞后，隨著主流煙氣氣相物收集到注射器中，主流煙氣中的粒相物質(zhì)被攔截收集到劍橋?yàn)V片上(該過程共抽吸1支香煙)。配制0.1 mol/L乙酸銨溶液，將截留有MMS粒相物的劍橋?yàn)V片放到離心管中，加入50 mL乙酸銨溶液，用水浴恒溫振蕩器振蕩30 min，萃取結(jié)束后棄去劍橋?yàn)V片，離心5 min后取上層清液，最后用過濾膜過濾3次，得到MMS粒相物母液。測(cè)試時(shí)，在MSS粒相物母液中加入甲醇進(jìn)行稀釋。同一樣品重復(fù)3次，其他的卷煙進(jìn)行相同處理。

1.3.2固相微萃取過程 以C18涂層的探針為例，首先將SPME探針浸入1.5 mL 50%乙腈溶液中潤(rùn)濕30 min，隨后快速轉(zhuǎn)移至母液中，進(jìn)行20～60 min的樣品富集，然后在水中洗滌10 s，去除雜質(zhì)，最后將SPME探針拿出晾干，待DART-MS檢測(cè)。SPME探針的潤(rùn)濕、富集和雜質(zhì)清潔均在置于微型振蕩器的96孔板上進(jìn)行，振蕩速率1 500 r/min。使用PDMS涂層的探針，用乙腈作為溶劑清潔洗滌。檢測(cè)后的SPME探針可放在裝有1 mL乙腈(C18涂層)或水(PDMS涂層)的液相色譜小甁中，置于微型振蕩器上洗脫60 min，實(shí)現(xiàn)SPME探針的再生和重復(fù)使用。

1.4 DART-MS分析

1.4.1樣品分析 DART-MS直接進(jìn)樣分析：使用移液槍吸取1 μL主流煙氣粒相物液體樣品，移至DIP-it玻璃棒底部，將玻璃棒放在移動(dòng)的滑軌上，放置12個(gè)樣品(Ion Sense, Inc.)。第1個(gè)樣品為空白溶劑，收集背景信號(hào)。

DART-MS結(jié)合SPME分析：將富集后的SPME探針放在可承載12個(gè)SPME探針的滑軌上。第1個(gè)樣品為空白的SPME探針，收集背景信號(hào)。為避免交叉污染，每根SPME探針樣品間隔放置。

1.4.2儀器檢測(cè)條件 使用高純氦氣(99.999%)進(jìn)行DART-MS分析，而氮?dú)?99.999%)用于待機(jī)模式。正離子模式下，在m/z50～300質(zhì)量范圍內(nèi)獲取質(zhì)譜數(shù)據(jù)。Orbitrap分辨率設(shè)置為60 000，離子轉(zhuǎn)移管溫度300 ℃，最大離子注入時(shí)間100 ms，自動(dòng)增益控制(automatic gain control, AGC)目標(biāo)2×105。吸附后的SPME探針進(jìn)行多次分析(n≥3)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Tune plus收集MS數(shù)據(jù)，Xcalibur 2.1軟件處理，所有實(shí)驗(yàn)譜圖都使用Origin 8.0繪制，根據(jù)高分辨質(zhì)譜得到的m/z值推斷化合物的分子式。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPME-DART-MS方法流程

卷煙主流煙氣粒相物的原位電離質(zhì)譜分析流程圖示于圖1。通過卷煙夾持器，卷煙MSS粒相物被截留在劍橋?yàn)V片上，使用乙酸銨水溶液溶解濾片上的截留物，獲得MSS粒相物母液。固相微萃取過程在96孔板上進(jìn)行，可同時(shí)對(duì)12個(gè)樣品進(jìn)行富集和純化。吸附后的SPME探針直接放置在DART離子源的樣品軌道上，多個(gè)SPME探針依次通過DART離子源中心。在DART離子源熱的等離子體氣流作用下，SPME探針上的物質(zhì)被快速解吸附、離子化，然后進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。本方法中SPME所有步驟可在96孔板上完成，操作簡(jiǎn)單；采用的SPME探針可以直接與DART離子源耦合，無需洗脫和其他中間步驟。DART離子化在大氣壓條件下進(jìn)行，單個(gè)SPME探針的分析時(shí)間在10～20 s，分析速度快，并且可以自動(dòng)進(jìn)樣。SPME與DART-MS聯(lián)用可提高復(fù)雜樣品中物質(zhì)的分析效率，步驟少、簡(jiǎn)單快速，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品的高通量分析。

圖1 SPME-DART-MS方法的整體流程圖Fig.1 Overall protocol of SPME-DART-MS method

2.2 SPME-DART-MS分析條件優(yōu)化

本工作優(yōu)化了SPME過程的萃取條件和DART離子源參數(shù)，選用C18涂層的SPME探針和混合型香煙1的粒相物溶液。在SPME中，分別選取萃取時(shí)間10、20、30、60 min對(duì)樣品成分富集，將萃取后的SPME探針進(jìn)行DART-MS分析，選取強(qiáng)度較高的離子對(duì)其信號(hào)峰進(jìn)行積分，結(jié)果示于圖2a?？梢钥闯觯?0～60 min萃取時(shí)間內(nèi)，樣品信號(hào)響應(yīng)并無太大變化。由于SPME探針表面涂層具有一定的飽和度，在探針萃取達(dá)到飽和后，即使延長(zhǎng)樣品提取時(shí)間也不會(huì)提取更多的樣品。在SPME樣品處理過程中優(yōu)化了樣品溶液的稀釋倍數(shù)，分別采用母液(無稀釋)、稀釋2倍、稀釋5倍、稀釋10倍的溶液，選定樣品離子的積分信號(hào)強(qiáng)度與稀釋倍數(shù)的關(guān)系示于圖2b?？梢园l(fā)現(xiàn)，選定的稀釋倍數(shù)對(duì)樣品中離子信號(hào)的強(qiáng)度無明顯影響。此外，在混合型香煙2的萃取時(shí)間和樣品濃度優(yōu)化中表現(xiàn)出相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未展示)。事實(shí)上，對(duì)于SPME萃取，樣品濃度還有進(jìn)一步稀釋的空間，然而，為了兼顧后續(xù)實(shí)驗(yàn)中與DART-MS直接分析的對(duì)比，稀釋倍數(shù)不宜太大。

注：a.SPME萃取時(shí)間；b.MSS粒相物溶液稀釋倍數(shù)；c.導(dǎo)軌移動(dòng)速率；d.氦氣加熱溫度圖2 SPME-DART-MS分析主流煙氣粒相物的實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化(混合型香煙1)Fig.2 Optimization of experimental conditions for analyzing mainstream smoke particulate matter by SPME-DART-MS (mixed cigarette 1)

在DART-MS進(jìn)樣時(shí)，多個(gè)SPME探針置于自動(dòng)滑軌上，按照一定的速率把探針傳輸至DART離子源中心，滑軌移動(dòng)速率直接影響樣品暴露在高溫等離子體流中的時(shí)長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)分別采用0.2、0.3、0.5、0.7 mm/s的軌道線性移動(dòng)速率，通過對(duì)比特定離子積分信號(hào)強(qiáng)度后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)滑軌移動(dòng)速率越大(即SPME探針停留在電離區(qū)域時(shí)間越短)，信號(hào)越低，示于圖2c。在DART-MS分析時(shí)，氦氣經(jīng)離子源被加熱，對(duì)SPME探針上吸附的物質(zhì)進(jìn)行熱解吸后再電離。本實(shí)驗(yàn)選擇250、300、350、400 ℃加熱溫度比較相應(yīng)物質(zhì)的積分信號(hào)強(qiáng)度，得到的氦氣溫度優(yōu)化圖示于圖2d。氦氣溫度在250 ℃的信號(hào)比其他溫度的信號(hào)略低，300～400 ℃時(shí)的信號(hào)無明顯差別。需要說明的是，實(shí)時(shí)直接分析離子源中的氦氣主要通過形成高溫等離子體流對(duì)樣品進(jìn)行解吸附電離。電離后的樣品在DART與質(zhì)譜之間的VapurTM接口上外接真空泵形成的負(fù)壓作用下，進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)使用商用DART離子源，氦氣流量無法改變，流量大小應(yīng)處于最佳狀態(tài)，故未對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。

綜上，本實(shí)驗(yàn)采用SPME探針萃取20 min、樣品母液稀釋5倍、樣軌道移動(dòng)速率 0.2 mm/s和氦氣加熱溫度350 ℃。

2.3 SPME-DART-MS分析主流煙氣粒相物

本研究中SPME探針包含C18和PDMS-DVB涂層，其吸附材料分別有利于非極性和極性化合物的提取，采用DART-MS玻璃棒直接分析和使用不同涂層的SPME探針吸附后對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)香煙MMS粒相物溶液進(jìn)行分析，其質(zhì)譜圖示于圖3。從圖3a可以看出，DART-MS直接分析檢測(cè)到的物質(zhì)主要集中在m/z250以下，其中m/z163.12主要為尼古丁等煙堿物質(zhì)，信號(hào)較強(qiáng)，在一定程度上抑制了其他物質(zhì)的信號(hào)。采用SPME-C18進(jìn)行樣品富集后，多個(gè)物質(zhì)的信號(hào)都得到了增強(qiáng)，尤其是m/z163.12后的離子信號(hào)，示于圖3b。

注：a.DART-MS直接分析；b.DART-MS結(jié)合SPME-C18；c.DART-MS結(jié)合SPME-PDMS圖3 不同分析手段檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)卷煙MSS粒相物的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of standard cigarette MSS particulate matter using different methods

與DART-MS直接分析相比，煙堿的基質(zhì)效應(yīng)明顯減小，多種成分的信噪比(S/N)得到了較大提高。PDMS涂層同樣表現(xiàn)出對(duì)MSS粒相物中多種成分的吸附，加強(qiáng)了質(zhì)譜分析信號(hào)，示于圖3c。 整體上，C18材料比PDMS探針表現(xiàn)出更好的萃取效率，吸附了更多成分；其中PDMS富集的部分物質(zhì)與SPME-C18探針一致。值得注意的是，SPME-DART-MS分析m/z<160的小分子離子峰信號(hào)沒有明顯提高。

使用兩種吸附材料探針分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)香煙1R5F、混合型香煙2、烤煙2和雪茄煙等4種不同類型的卷煙進(jìn)行SPME-DART-MS分析，并與DART-MS直接分析的信號(hào)(標(biāo)注為solwtion/soln)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果示于圖4。選擇的目標(biāo)離子為m/z169.08、183.09、187.12、197.11、201.14，信號(hào)強(qiáng)度為提取DART-MS離子流圖的積分面積。經(jīng)過SPME富集，這些離子的質(zhì)譜信號(hào)比直接檢測(cè)增強(qiáng)了5～20倍，并且C18涂層的SPME萃取能力大于PDMS涂層。同時(shí)，SPME對(duì)4種不同卷煙的富集效果基本一致，它們之間的信號(hào)沒有顯著差異。此外，通過進(jìn)一步分析m/z<150的離子峰信號(hào)積分強(qiáng)度，如m/z97.08、111.09、123.09等，發(fā)現(xiàn)這些離子的信號(hào)仍然存在，但SPME過程并沒有增強(qiáng)其信號(hào)。這可能是因?yàn)檫@些小分子質(zhì)量化合物不易吸附在探針上或者易揮發(fā)，在達(dá)到DART離子源中心之前，已經(jīng)在熱的離子源環(huán)境中解吸附，擴(kuò)散至空氣中。

根據(jù)高分辨質(zhì)譜得到的精準(zhǔn)質(zhì)量，對(duì)檢測(cè)到的主要質(zhì)譜峰進(jìn)行分子式、離子形式和化合物的推斷，結(jié)果列于表1。卷煙煙氣成分存在大量的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，原位電離質(zhì)譜檢測(cè)到的單一質(zhì)譜峰可對(duì)應(yīng)多個(gè)物質(zhì)。這些物質(zhì)主要為煙堿、吡啶、苯、吲哚、胺、醇、酚類等有機(jī)化合物。表1中所列的質(zhì)譜峰小于m/z300,所推斷的物質(zhì)質(zhì)量差(測(cè)定的分子質(zhì)量-精確分子質(zhì)量)小于1×10-3Dalton,準(zhǔn)確度較高。為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取1-甲基咪唑(1-methylimidazole)、2-氨基苯乙腈(2-aminobenzeneacetonitrile)、萘胺(naphthylamine)、8-氨基喹啉(8-aminoquinoline)、去甲煙堿(nornicotine)、1，8-二氨基萘(1, 8-diaminonaphthalene)、4-氨基聯(lián)苯(4-aminobiphenyl)和尼古丁(nicotine)等8種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行DART-MS分析，信號(hào)響應(yīng)主要為[M+H]+離子形式。通過與煙氣樣品數(shù)據(jù)比對(duì)，由精準(zhǔn)質(zhì)量推斷的化合物與標(biāo)準(zhǔn)品一致，該結(jié)果與文獻(xiàn)[23-28]報(bào)道一致。

表1 SPME-DART-MS檢測(cè)MSS粒相物中主要離子的化合物推斷Table 1 Compound identification of main ions in MSS particulate matter detected using SPME-DART-MS

DART-MS直接分析可以快速分析MSS粒相物成分，結(jié)合SPME富集后，不僅可降低復(fù)雜MMS樣品中尼古丁離子的基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)增強(qiáng)了多種成分的信號(hào)，尤其是相對(duì)含量較少的物質(zhì)。本文中的SPME操作和DART-MS均具有快速、簡(jiǎn)單、高通量的特點(diǎn)，兩者的結(jié)合可簡(jiǎn)化常規(guī)分析步驟，提高M(jìn)SS粒相物的分析檢測(cè)效率。

注：a.標(biāo)準(zhǔn)煙1R5F；b.混合型香煙2；c.烤煙2；d.雪茄圖4 DART-MS和SPME-DART-MS對(duì)不同卷煙MSS顆粒物分析的信號(hào)比較Fig.4 Signal comparison of DART-MS and SPME-DART-MS methods for the analysis of MSS particulate matters of different cigarettes

2.4 DART-MS對(duì)SPME探針解吸附效率的研究

SPME探針上化合物的洗脫是在DART離子源中快速(10～20 s)完成的，為了探究洗脫效率，對(duì)已提取MSS粒相物的兩種涂層的SPME探針進(jìn)行了連續(xù)多次的DART-MS分析。C18探針和PDMS探針富集了不同卷煙的MSS粒相物之后，在DART離子源中連續(xù)5次解吸附后的離子信號(hào)強(qiáng)度示于圖5?？梢?，第一次解吸附后檢測(cè)到的信號(hào)最強(qiáng)，后續(xù)多次的解吸附仍然有信號(hào)殘留；與第一次解吸附相比，后續(xù)的離子信號(hào)強(qiáng)度大幅度下降。對(duì)于C18探針(圖5a和圖5b)，第二次解吸附離子積分信號(hào)強(qiáng)度約為第一次的1/3，而PDMS吸附探針(圖5c和圖5d)第二次解吸附產(chǎn)生的信號(hào)約為第一次的1/5。隨著分析次數(shù)的增多，離子積分信號(hào)強(qiáng)度逐漸變?nèi)醯陆捣炔淮?。?jīng)過5次分析之后，SPME探針還有吸附物殘留，這可能是由本研究使用的樣品濃度過高(母液的稀釋倍數(shù)小)引起的。本文圖中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用第一次解吸附的離子峰信號(hào)。這種連續(xù)性解吸附實(shí)驗(yàn)表明，SPME探針具有長(zhǎng)期耐用性，在經(jīng)過不同溶劑洗滌后，可以重復(fù)使用。綜上，無論是哪種涂層的SPME探針，在DART離子源中第一次解吸附時(shí)就已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了最大的、有效的傳質(zhì)，大部分物質(zhì)都可以被DART離子源解吸附并離子化。

3 結(jié)論

本研究建立了一種固相微萃取結(jié)合實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜法，分析卷煙主流煙氣粒相物。SPME技術(shù)不僅可以增強(qiáng)復(fù)雜基質(zhì)樣品中多種成分的檢測(cè)信號(hào)，還可以降低待測(cè)樣品中主要物質(zhì)的信號(hào)抑制效應(yīng)。與直接DART-MS分析相比，SPME-DART-MS大大提高了對(duì)復(fù)雜樣品中多種物質(zhì)的檢測(cè)能力。結(jié)果表明，DART離子源對(duì)SPME探針上的物質(zhì)表現(xiàn)出較好的解吸附效率。該方法簡(jiǎn)單、快速、可實(shí)現(xiàn)高通量分析。