張 棚，張 希，楊雪妍，劉元林，李 儒，龍 鳴，田曉靜，*，張福梅，陳士恩，馬忠仁

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 甘肅 蘭州 730124； 2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 中國—馬來西亞國家聯(lián)合實驗室，甘肅 蘭州 730030； 3.云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500； 4.蘭州海關(guān)綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730100)

三七又稱“全不須”(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)，為五加科植物人參屬的干燥根，具有凝血、抗三高、抗炎癥等功能，以云南文山州為道地產(chǎn)地[1]?！吨袊幍洹穂2]規(guī)定三七飲片可直接以粉入藥，但常有以其他產(chǎn)地三七假冒道地產(chǎn)地三七或以側(cè)根、葉等摻雜至三七主根中[3]，三七粉劑中摻假尤為嚴(yán)重。三七摻假不僅會擾亂市場，還會對消費(fèi)者健康帶來潛在危害，因此三七產(chǎn)地及成分摻雜的檢測具有重要意義。目前，三七品質(zhì)檢測時主要依據(jù)其外部感官性狀進(jìn)行判別[4]，如形狀、直徑、紋理、氣味、色澤等(呈圓錐形，根長2～3.5 cm，上、下端直徑0.6～0.8 cm，表面灰黃棕色或灰褐色，頂端周圍有瘤狀突起)，但要依賴于中醫(yī)長期臨床經(jīng)驗，且難以判別三七粉的摻假[5]。依據(jù)理化指標(biāo)，如總皂苷[6]等指標(biāo)，可以實現(xiàn)三七主根和側(cè)根的鑒別[7]；童宇茹等[8]對三七粉摻雜品的DNA進(jìn)行熔解曲線分析，實現(xiàn)了三七和大米、土豆等的鑒別；張艷美[9]通過感官判別，實現(xiàn)了具有感官特性三七的鑒別；此外，近紅外光譜技術(shù)在三七粉中摻雜植物粉[10]、須根粉[11]及非道地產(chǎn)地[12]快速檢測中也獲得了較好的效果，可用于三七粉的真?zhèn)舞b定[13-14]；Yang等[15]以ITS2序列通過DNA條形碼技術(shù)實現(xiàn)了三七和越桔根的有效鑒別，其根莖葉形態(tài)及其化學(xué)成分雖相似，但三七皂苷R1和人參皂苷含量不同。依據(jù)其理化指標(biāo)可以對三七及其偽品進(jìn)行鑒別。

基于Pb、Cd、As、Cu 4種重金屬元素的含量，陶亮等[16]研究發(fā)現(xiàn)，云南不同地區(qū)三七中重金屬的污染程度差異較大，故重金屬含量可作為三七判別依據(jù)；金航等[3]利用ICP-AES對道地與非道地產(chǎn)區(qū)三七中微量元素進(jìn)行測定，得出道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)三七微量元素含量有顯著差異，其中與文山(道地產(chǎn)區(qū))三七相比Mn、Zn含量相對較高；劉明地等[17]利用原子吸儀光譜法(AAS)對云南、陜西、甘肅等13個產(chǎn)地進(jìn)行12種微量元素分析，發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)地12種微量元素差異顯著；趙靜等[18]采用濕法消解結(jié)合(ICP-AES)法對12個不同產(chǎn)地多個三七樣品進(jìn)行As、Cu等6種重金屬元素的測定，對37個樣品測定的結(jié)果進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)12個產(chǎn)地三七微量元素含量具有相似性、差異性，可針對微量元素角度對三七進(jìn)行系統(tǒng)的歸類與判別；侯皓然等[19]基于微量元素含量角度，采用聚類、逐步判別等統(tǒng)計學(xué)方法對加拿大、美國、中國東三省的西洋參進(jìn)行了產(chǎn)地鑒別，判別率100%。故依據(jù)微量元素對三七等中藥材進(jìn)行鑒別，方法科學(xué)、可行。

本研究擬建立基于電感耦合等離子體發(fā)射光譜技術(shù)(ICP-OES)同時測定Ca、Cu等11種金屬元素含量的方法，并應(yīng)用于云南5個不同產(chǎn)地三七主根和側(cè)根中元素含量的檢測，探討多元統(tǒng)計分析方法在三七產(chǎn)地判別及部位判別中的效果，為三七產(chǎn)地追溯及摻雜植物粉、須根粉檢測奠定理論基礎(chǔ)，為市場監(jiān)督三七品質(zhì)提供方法基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及前處理方法

試驗用三七樣品分別于2017年11月采集于云南省文山州丘北縣、紅河州個舊市、曲靖市沾益縣、曲靖市師宗縣和曲靖市羅平縣五個不同產(chǎn)地，每個產(chǎn)地采集40～50顆三七，設(shè)平行樣本，重復(fù)3次。樣本經(jīng)干制后，分別將每個產(chǎn)地的主根和側(cè)根粉碎(FS100S-3高速粉碎機(jī)，濟(jì)南飛馳機(jī)械設(shè)備公司)過100目篩，密封保存于4℃冰箱待用(表1)。實驗前采用干法消化后[20]過0.45 μm水系濾膜，待測。

表1 不同產(chǎn)地三七樣品信息

1.2 試劑

Ca、Cu、Fe、Mg、Mn、Na、Zn(100 μg·mL-1)，Se、Cd、Pb、As(1 000 μg·mL-1)單元素標(biāo)準(zhǔn)貯備液，購于(北京)檢驗認(rèn)證有限公司(北京，中國)；硝酸(GR)購于煙臺市雙雙化工有限公司(煙臺，中國)；超純水(甘肅省膜科學(xué)技術(shù)研究院醫(yī)藥純水設(shè)備)。

1.3 儀器與標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度

電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(5110，安捷倫科技有限公司)主要工作參數(shù)：RF功率，1 200 W；等離子體氣流量，12 L·min-1；輔助氣流量，1 L·min-1；觀察方式，SVDV；觀察高度，8。標(biāo)準(zhǔn)系列濃度見表2。

表2 不同元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列質(zhì)量濃度

1.4 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件初步整理，利用SAS 9.4軟件進(jìn)行方差分析(analysis of variance，ANOVA)比較各產(chǎn)地以及其主側(cè)根之間元素含量的差異性。通過SPSS 21軟件，采用主成分分析(principal component analysis，PCA)、典則判別分析(canonical discriminant analysis，CDA)、聚類分析(clustering analysis，CA)、因子分析(factor analysis，F(xiàn)A)對三七樣品基于微量元素分析進(jìn)行產(chǎn)地判別。結(jié)果圖由Origin 8.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 ICP-OES多元素檢測方法的建立

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及其各元素檢出限

以11次空白溶液中各元素含量計算標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限[21]回歸方程和相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表3。由表3可知，各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r值均在0.971 98～0.999 97，標(biāo)準(zhǔn)曲線在陳述濃度范圍內(nèi)，線性度較好；11種元素中檢出限較低的為Cd元素(0.000 678 μg·L-1)；檢出限較高的為Ca元素(0.719 574 mg·L-1)。其他介于0.000 678 μg·L-1到0.719 574 mg·L-1，檢出限符合要求。

表3 各元素的回歸方程及相關(guān)系數(shù)及其檢出限

2.1.2 加標(biāo)回收率、精密度、RSD值

根據(jù)GB 5009.268—2016[22]，按1.1節(jié)前處理樣品，在1.3節(jié)中ICP-OES測定條件下，兩次獨(dú)立測定ZZ產(chǎn)地三七樣品，判斷其精密度(判別準(zhǔn)則：含量>或<1 mg·kg-1，精密度<10%或20%)；再分別加入一定量的Ca、Cu、Fe、Mg、Mn、Na、Zn、Se、Cd、Pb、As單元素標(biāo)準(zhǔn)貯備液測定其樣品濃度，經(jīng)質(zhì)量換算計算回收率，加標(biāo)回收率=(加標(biāo)后元素質(zhì)量-加標(biāo)前元素質(zhì)量)/加標(biāo)量[23]。結(jié)果精密度、加標(biāo)回收率、RSD值[18]見表4。由表4可知， 所處理方法精密度良好，除As元素兩次重復(fù)的絕對差值與算術(shù)平均值的比值略超過20%外，其他元素絕對值占算術(shù)平均值結(jié)果均在國家標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。由于As元素本身屬于極其微量的元素，且三七中As含量較低，低于檢出限，導(dǎo)致As元素的精密度不理想；各元素加標(biāo)回收率范圍在95.72%～102.30%；各元素RSD值在0.09%～2.88%，均小于3%，所建立方法重復(fù)性良好。

表4 各元素加標(biāo)回收率

2.1.3 不同產(chǎn)地及其主側(cè)根三七元素含量

采用上述所建ICP-OES法檢測表1中5個產(chǎn)地三七主、側(cè)根粉11種元素含量，其結(jié)果及方差分析見表5。既然分析主根、側(cè)根粉元素差異，就應(yīng)該弱化產(chǎn)地，著重從主側(cè)根元素差異分析。

由表5可知：對于三七同一產(chǎn)地主根與側(cè)根而言，F(xiàn)e、Na、Mn、Pb、As元素含量差異顯著。各產(chǎn)地Fe、Mg、Na元素含量側(cè)根均高于其主根；除曲靖市師宗縣產(chǎn)地外，Mn元素含量側(cè)根均高于其主根；重金屬元素中，Pb元素含量側(cè)根均高于其主根；除曲靖市師宗縣產(chǎn)地外，As、Cd元素含量側(cè)根均高于其主根。

表5 十種三七樣品各元素含量測定結(jié)果與方差分析

于5種產(chǎn)地而言，不同產(chǎn)地之間Cu、Fe、Mn、Na、Cd、Pb、As元素含量差異顯著，可以看出三七M(jìn)g、Fe、Ca、Na四種元素含量較高，Mn、Zn、Cu、Se、Cd、Pb、As六種元素含量相對較低。

于重金屬元素含量而言，主根中重金屬元素Cd含量最高的是ZZ產(chǎn)地，Pb、As重金屬元素含量最高均為HZ產(chǎn)地。側(cè)根三七中Cd重金屬元素LC產(chǎn)地含量最高，Pb、As重金屬元素HC產(chǎn)地含量最高。表5所有樣品中Cd元素含量在0.29～3.98 μg·kg-1，Pb元素含量在0.33～17.32 μg·kg-1，As元素含量在0.89～6.44 μg·kg-1，Cd、Pb、As重金屬含量均未超標(biāo)[24-25]。HZ產(chǎn)地三七主側(cè)根中Pb、As兩種重金屬元素含量比其他產(chǎn)地主側(cè)根重金屬含量都高。

2.2 基于多元統(tǒng)計分析的三七產(chǎn)地和主側(cè)根判別分析

對11種元素組成含量進(jìn)行PCA、CDA、FA、CA分析，其結(jié)果見圖1～圖4。

圖1 不同產(chǎn)地三七主側(cè)根PCA結(jié)果

2.2.1 基于PCA與CDA的三七產(chǎn)地的分析

由圖1可知，前三個主成分的累積貢獻(xiàn)率高達(dá)74.96%，包含了原始信息的大部分信息[26]。對于三七主側(cè)根判別而言：5個產(chǎn)地的主根分布靠左，均落在左側(cè)橢圓內(nèi)；而5個產(chǎn)地的側(cè)根分布在右側(cè)橢圓內(nèi)，沒有區(qū)域重疊。三七產(chǎn)地主根與側(cè)根區(qū)域分布在主成分1、主成分2水平上有明顯的距離差(主根主成分1、主成分2<0；側(cè)根主成分2>0)。PCA很好地實現(xiàn)了主根與側(cè)根的區(qū)分。

對于三七5個產(chǎn)地間判別而言：主根在Prin3上呈現(xiàn)顯著差異性，主根5個產(chǎn)地間沒有區(qū)域重疊；側(cè)根在主成分1、主成分2、主成分3均有距離的落差，彼此間分布沒有區(qū)域的重疊。PCA很好地實現(xiàn)了三七5個產(chǎn)地間的區(qū)分。

由圖2可知，同一個產(chǎn)地的重復(fù)性非常好，對于三七主側(cè)根判別而言：5個產(chǎn)地主根分布在左下側(cè)橢圓區(qū)域，側(cè)根三七各產(chǎn)地分布在其他區(qū)域，沒有區(qū)域的重疊，三七產(chǎn)地主根與側(cè)根區(qū)域分布在特征值1、特征值2水平上有明顯的距離差，CDA很好地實現(xiàn)了主根與側(cè)根的區(qū)分。對于三七5個產(chǎn)地間判別而言：5個主根在特征值1、特征值2水平上落差較小，但依舊區(qū)分明顯，沒有區(qū)域的重疊；5個側(cè)根在特征值1、特征值2水平上落差較大，產(chǎn)區(qū)間區(qū)分顯而易見?；谠胤治?，PCA、CDA結(jié)果呈現(xiàn)一致性，可以實現(xiàn)產(chǎn)地、主根和側(cè)根的定性判別。為三七粉產(chǎn)地判別、以側(cè)充主鑒別提供了高效準(zhǔn)確的方法。

圖2 不同產(chǎn)地三七主側(cè)根CDA結(jié)果

2.2.2 基于FA的三七產(chǎn)地的分析

以5個不同產(chǎn)地三七主根和側(cè)根中11種元素組成含量為輸入，進(jìn)行FA分析，并由Origi繪制loading圖，見圖3。在loading圖中，Component1除Cu、Mg、Ca元素外，各元素變量比重均≥0.413，由As、Cd、Fe、Mn、Na、Pb、Se、Zn元素，8個變量解釋，主變量因子即As、Fe、Pb元素；Component2中特征變量元素為Na 、Ca、Zn元素；結(jié)合表5，各產(chǎn)地間及其主側(cè)根中As、Fe、Pb三種元素含量差距較大，特征規(guī)律明顯，可直觀看出各含量數(shù)量級差異的變化。在鑒別工作中優(yōu)先選擇As、Fe、Pb三種元素進(jìn)行檢測判別，可達(dá)到縮小檢測元素范圍的目的，使檢測工作更為簡單、快速、準(zhǔn)確。

圖3 三七各產(chǎn)地微量元素因子分析loading圖

2.2.3 基于CA的三七產(chǎn)地的分析

以10種三七樣品微量元素三次含量的重復(fù)值為輸入進(jìn)行聚類分析，采用組間連接(平方Euclidean距離)，標(biāo)準(zhǔn)化(Z得分)后進(jìn)行聚類，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)D3=2時5個產(chǎn)地及其主側(cè)根均分類明顯，同一產(chǎn)地的3次含量結(jié)果均首先聚類在一起，正確率100%；D1=22時，10種樣品三七聚為2類，即主根和側(cè)根，主根又可以在D2=10時分為三類，SC產(chǎn)地、HZ產(chǎn)地、其他主根產(chǎn)地，其中SC 產(chǎn)地被誤判為主根類別。CA可實現(xiàn)對三七主與側(cè)根的分類判別，準(zhǔn)確率達(dá)到90%。CA分析證明，所選云南三七及其主側(cè)根間微量元素含量具有差異性和相似性，通過計算其組間距離即可實現(xiàn)產(chǎn)地分類與判別，驗證PCA、CDA的判別結(jié)果，與其具有高度一致性，錯誤率僅為10%。

圖4 不同產(chǎn)地三七聚類分析樹狀圖

3 討論

目前越來越多的研究將微量元素作為評價三七藥材道地性的指標(biāo)之一[24]。本研究采用ICP-OES技術(shù)測定云南三七主側(cè)根微量元素含量。劉明地等[27]利用AAS法測定13個產(chǎn)地三七12種微量元素，其r值在0.8673～0.992，低于本研究利用ICP-OES所得相關(guān)系數(shù)。本研究探討了以干法消解結(jié)合ICP-OES同步檢測三七中多種微量元素方法的精密度、RSD值等，該方法重復(fù)性好、精密度高。

本研究表明，不同產(chǎn)地Cd、Pb、As重金屬含量差異較大，易受生長環(huán)境、土壤的影響，這與趙靜等[18]在研究云南三七中重金屬含量的規(guī)律具有相似性；金航等[3]研究發(fā)現(xiàn)，道地三七(文山州)Mn元素含量高于非道地產(chǎn)地，Cd重金屬元素明顯低于非道地產(chǎn)地，本研究中Mn、Cd元素同樣呈現(xiàn)相同規(guī)律。

目前，對于三七主根與側(cè)根的判別報道文章極少，王潤云等[4]在三七及其易混淆品真?zhèn)舞b別分析中僅談到利用支根上下端直徑的大小和支根呈現(xiàn)的外形、顏色等作為判斷依據(jù)。三七用作炮制品頗為頻繁常見，多以三七粉的形式展現(xiàn)在人民群眾的視線中，失去了原有的性狀鑒別特點(diǎn)，此類偽品難以依靠感官檢驗分辨真?zhèn)?，而對三七主?cè)根中微量元素規(guī)律的探究文章暫無。

趙恒強(qiáng)等[28]采用多元素分析結(jié)合PCA、LDA分析用于丹參產(chǎn)地的溯源，回判正確率為100%，為中藥溯源提供方法支持；李成義等[29]基于Fe、Na等12種微量元素含量分析結(jié)合CA、FA分析對14個產(chǎn)地的板藍(lán)根進(jìn)行歸屬和鑒別，其方法科學(xué)、有效。本研究同樣基于微量元素含量角度進(jìn)行三七產(chǎn)地及其主側(cè)根的溯源與鑒別，并結(jié)合PCA、CDA分析使5種產(chǎn)地三七得到區(qū)分，且各自主根與側(cè)根也實現(xiàn)了區(qū)分，CA分析又系統(tǒng)地對三七主側(cè)根進(jìn)行了分類，并驗證了PCA、CDA的判別結(jié)果，分類正確率90%。故此，基于三七元素分析，結(jié)合PCA、CDA、CA實現(xiàn)三七不同產(chǎn)地及其主根與側(cè)根之間判別的目的，其判別方法科學(xué)、有效。

綜上所述，本研究利用ICP-OES結(jié)合PCA、CDA、CA、FA分析方法實現(xiàn)了云南道地產(chǎn)地三七(文山)及其周邊產(chǎn)地三七的主側(cè)根及其產(chǎn)地間的判別，發(fā)現(xiàn)了不同產(chǎn)地三七及其主側(cè)根元素含量具有顯著的差異性，通過多元統(tǒng)計分析確立了不同產(chǎn)地三七及其主側(cè)根判別數(shù)學(xué)模型依據(jù)，縮小了檢測元素范圍，對主根與側(cè)根系統(tǒng)地進(jìn)行了分類，通過微量元素含量的角度進(jìn)行判別，結(jié)果與實際產(chǎn)地一致，為產(chǎn)地判別、摻假鑒別提供了一種高效準(zhǔn)確的方法，為三七判別領(lǐng)域提供新思路。