黃 宣， 金林燦， 葉朝輝， 姜潔鋒， 施賢波

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 作物研究所，浙江 寧波 315040)

水稻(Oryzasativa)作為全球最重要的糧食作物之一， 養(yǎng)育著全世界半數(shù)以上的人口，我國(guó)是世界上最大的稻米生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)之一[1]。即使在越來(lái)越科學(xué)的管理下，水稻在大田生產(chǎn)過(guò)程中仍避免不了病蟲(chóng)害的威脅[2]。稻瘟病[3]、白葉枯病[4]、褐飛虱[5]是水稻生產(chǎn)上主要病蟲(chóng)害， 會(huì)對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響。農(nóng)藥防治成本較高并且容易污染環(huán)境，選用聚合不同抗性基因的多抗品種是保障水稻綠色生產(chǎn)的重要途徑。因此，針對(duì)這些病害的抗性基因定位和克隆工作一直備受關(guān)注。近年來(lái)，研究人員就水稻稻瘟病、白葉枯病、褐稻虱抗性基因進(jìn)行了較為深入的系統(tǒng)研究。利用分子標(biāo)記手段定位到100多個(gè)稻瘟病主效抗性基因，已克隆36個(gè)[6]；利用形態(tài)標(biāo)記和分子標(biāo)記定位抗白葉枯病基因40 個(gè)，已被定位的抗性基因有 32 個(gè)，其中被克隆的基因有 9個(gè)[4]；目前國(guó)際上已確認(rèn)并在期刊上報(bào)道的水稻抗褐飛虱基因有43個(gè)，其中38個(gè)已被定位[7]，Bph3 (Bph17)、Bph14、Bph26 (Bph2) 和Bph29 已經(jīng)被克隆[5]。基于以上抗性基因序列，人們開(kāi)發(fā)了一系列特異性分子標(biāo)記[8-10]，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)快速、準(zhǔn)確、系統(tǒng)地從大量水稻材料中鑒定抗病蟲(chóng)基因，為抗病蟲(chóng)水稻新品種培育帶來(lái)了新契機(jī)，提高了育種效率。

水稻是浙江省的主要糧食作物，在糧食生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位[11]。浙江省水稻種植基本呈“南秈北粳”的特點(diǎn)，秈稻推廣面積占水稻生產(chǎn)面積的 44.0%左右，粳稻占 56.0%左右，近年來(lái)，粳稻面積有增加的趨勢(shì)[12]。浙江省在水稻生長(zhǎng)季節(jié)高溫多雨，臺(tái)風(fēng)多，稻瘟病、白葉枯病、褐飛虱等病蟲(chóng)害高發(fā)。目前，普遍認(rèn)為培育抗病蟲(chóng)水稻新品種是提高品種抗性最經(jīng)濟(jì)有效的措施[13]。明確近年來(lái)育成的常規(guī)晚粳稻品種(系)的抗病蟲(chóng)基因組成是基于分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)改良品種抗性的重要前提。何海燕等[14]對(duì)40份浙江省水稻主栽品種中5個(gè)稻瘟病抗性基因進(jìn)行了分子檢測(cè)，初步明確了這些稻瘟病抗性基因的分布情況。蘭波等[15]利用特異性分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)44份江西早秈雜交稻的9個(gè)抗稻瘟病基因進(jìn)行檢測(cè)，初步明確了抗性基因在江西稻區(qū)早秈雜交稻的分布。本研究以Pigm、Pi2、Pita等十一個(gè)抗稻瘟病基因，Xa21、Xa23兩個(gè)抗白葉枯病基因，及Bph14、Bph15兩個(gè)抗褐飛虱基因?yàn)檠芯繉?duì)象，應(yīng)用特異性功能標(biāo)記對(duì)浙江省近年其新育成的61份常規(guī)晚粳品種(系)中的抗病蟲(chóng)基因進(jìn)行分子檢測(cè)，分析其在水稻中的分布和應(yīng)用情況，并利用部分抗性基因來(lái)改良本地品種的抗病蟲(chóng)性，驗(yàn)證其抗性，以期為通過(guò)分子聚合育種技術(shù)選育多抗水稻新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試61份常規(guī)晚粳稻品種(系)為浙江省內(nèi)7家育種單位近年來(lái)(2008—2019年)育成或生產(chǎn)中推廣的14個(gè)品種，以及參加聯(lián)合品比試驗(yàn)或區(qū)試的47份優(yōu)秀品系(表1)。所有材料于2020年種植在寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院水稻育種基地內(nèi)。

表1 供試品種(系)名稱(chēng)及來(lái)源

1.2 DNA提取與檢測(cè)

每個(gè)品種采集1個(gè)單株的2 cm長(zhǎng)葉片，放置離心管中并加入2～3顆鋼珠，加入CTAB抽提液在凈信Tissuelyser-II組織研磨儀上對(duì)樣品葉片進(jìn)行研磨，按步驟提取DNA，采用1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，加入適量無(wú)菌水(ddH2O)溶解后置于-20 ℃冰箱中備用。

1.3 PCR擴(kuò)增

檢測(cè)采用PCR擴(kuò)增方法。本研究所用抗稻瘟病、抗白葉枯病、抗褐飛虱PCR特異性引物信息見(jiàn)表2，委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成引物。10 μL的PCR反應(yīng)體系包含DNA模板1 μL、10 μmol·L-1正反向引物各1 μL、2×Easytaq PCR SuPerMix 3 μL，ddH2O 4 μL。在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性45 s，55～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30～35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。

表2 用于PCR反應(yīng)的引物名稱(chēng)、序列及預(yù)期片段長(zhǎng)度

1.4 產(chǎn)物檢測(cè)

抗病基因的擴(kuò)增產(chǎn)物用添加GelStain核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

利用15個(gè)抗病蟲(chóng)功能標(biāo)記對(duì)供試的61份粳稻品種(系)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有材料均未擴(kuò)增出抗稻瘟病基因Pi1和抗白葉枯基因Xa21和Xa23的抗病條帶，剩余的12個(gè)抗病蟲(chóng)基因則在61個(gè)材料中有不同程度的分布(圖1、圖2)：其中Pigm基因檢出率最低為1.64%，只在來(lái)源于浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院的品系R1825中檢出；Pb1、Bph14、Bph15三個(gè)抗性檢出率較低，分布頻率分別為6.56%、6.56%、11.48%；Pish/Pi54、Pi9、Pi5、Pit檢出頻率分別為24.59%、26.23%、32.79%、34.43%；分布頻率在65%左右的基因有3個(gè)，分別為Pita、Pi2、Pikm；檢出率最高的抗性基因Pib，達(dá)到91.80%，即61份材料中有56份材料中含有Pib。浙江新育成61份粳稻中品種(系)中稻瘟病分布頻率從高到低分別為Pib>Pikm>Pi2>Pita>Pit>Pi5>Pi9>Pish/Pi54>Pb1>Pigm>Pi1(圖3)。

圖1 十五個(gè)抗性基因在61個(gè)常規(guī)晚粳稻品種(系)中的分布

M，DL2000；Pigm對(duì)照為谷梅四號(hào)；Bph14、Bph15對(duì)照為B5。瓊脂糖電泳泳道1～30 ： 寧88、寧84、寧81、寧39、丙17-02、紹粳19-34、HZ16-78、丙19-26、R9079、丙19-339、春江190、ZH19-02、浙糯106、紹糯9714、ZH19-12、浙粳96、R1825、丙16-135、ZH16-98、甬粳19-46、春江糯8號(hào)、HZ-1137c、嘉禾628、R182、嘉16-48、春江糯7號(hào)、紹粳18、嘉124、甬粳18-60和秀水134。

就品種(系)而言，61份供試材料均有抗性基因檢出，檢出數(shù)量在2～8個(gè)。其中甬粳19-46、臺(tái)19-84、紹粳19-34、嘉60四份材料只攜帶兩個(gè)抗性基因，中嘉8號(hào)、寧84、寧88等33份材料有3～4個(gè)抗性基因被檢出，攜帶5～6個(gè)抗性基因的材料有20份，攜帶7～8個(gè)抗性基因的材料有4份，分別為丙17-204、丙17-02、丙16-135、丙16-111(表4)。以上結(jié)果表明，浙江粳稻品種(系)在攜帶的已知抗稻瘟病基因上存在明顯差異，Pikm、Pita、Pi2和Pib總體應(yīng)用較廣，其中Pib的應(yīng)用最廣?？购诛w虱基因Bph14、Bph15在61份材料中檢出率較低，只在嘉興農(nóng)科院“丙”系列材料中和中國(guó)水稻研究所“春江”系列中有檢出，而同時(shí)檢出Bph14、Bph15基因的材料有4份，分別為丙19-26、丙17-02、丙16-135、丙16-111。

表4 六十一個(gè)水稻品種(系)抗性基因分子標(biāo)記檢測(cè)

2.2 部分抗病蟲(chóng)基因的育種利用

由于在供試材料中未檢測(cè)到攜帶Xa23基因的品種(系)，本研究利用含有Xa23基因的秈稻品系R416和中感白葉枯病的粳稻品種寧84雜交，以寧84為輪回親本，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇將Xa23導(dǎo)入寧84背景中，在BC1F1代利用剪葉法進(jìn)行白葉枯病接種，混合菌液由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所提供，對(duì)含有Xa23的單株抗病效果進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，含有Xa23基因的單株均表現(xiàn)為高抗，未檢出的為中感(圖3)，初步表明，Xa23可以增強(qiáng)粳稻對(duì)白葉枯病的抗性。

M，DL2 000；Xa23的對(duì)照為R416。

為驗(yàn)證抗褐飛虱基因Bph14、Bph15的在粳稻中的抗性，本研究利用含有抗褐飛虱基因Bph14、Bph15的種質(zhì)丙16-111和不含抗褐飛虱基因的晚粳品種寧84、寧88雜交，雜交分離后代通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇含有Bph14、Bph15基因且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株，在F5代對(duì)基本穩(wěn)定的品系委托武漢大學(xué)何光存實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行褐飛虱抗性鑒定，鑒定方法采用標(biāo)準(zhǔn)苗期集團(tuán)法，每份材料重復(fù)3次。當(dāng)感蟲(chóng)材料TN1死苗率達(dá)到95%左右時(shí)，按照國(guó)際水稻所的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每個(gè)重復(fù)的待鑒定水稻材料分別進(jìn)行讀數(shù)，最后計(jì)算平均值。結(jié)果表明，不含有Bph14、Bph15基因的品種寧84、寧88抗性結(jié)果為感蟲(chóng)，導(dǎo)入Bph14、Bph15的品系均達(dá)到抗以上級(jí)別(表3)，結(jié)果表明，聚合了2個(gè)抗蟲(chóng)基因的水稻品系，相對(duì)于只有1個(gè)抗蟲(chóng)基因的水稻品系來(lái)說(shuō)，對(duì)害蟲(chóng)具有更強(qiáng)的趨避性和抗生性(圖4)。

圖4 水稻材料對(duì)褐飛虱的抗性表現(xiàn)

3 結(jié)論與討論

稻瘟病、白葉枯病、褐飛虱是水稻三大病蟲(chóng)害，浙江省品種審定委員會(huì)將稻瘟病、白葉枯病、褐飛虱抗性作為水稻品種審定的主要衡量指標(biāo)。因此，水稻抗病基因的定位克隆和分子機(jī)理研究一直是生物學(xué)家和育種家關(guān)注的焦點(diǎn)。隨著越來(lái)越多抗稻瘟病基因的定位、克隆，一大批基因特異性分子標(biāo)記被成功開(kāi)發(fā)，如Pita、Pib、Pit、Pb1等[16-18， 23-24]，為抗病育種帶來(lái)了新的契機(jī)。

本研究利用15個(gè)抗病蟲(chóng)功能標(biāo)記對(duì)61份浙江新育種的粳稻品種(系)進(jìn)行分子檢測(cè)，結(jié)果表明,浙江新育成品種(系)中未檢測(cè)到抗稻瘟病基因Pi1，其他抗稻瘟病基因都有不同程度的分布。Pi2、Pi9、Pigm等是位于第 6 染色體短臂靠著絲粒附近的一個(gè)抗性基因簇，它們雖然存在一定的抗譜差異，但對(duì)不同地區(qū)來(lái)源的絕大多數(shù)稻瘟病菌都具有良好的抗性[29]。何海燕等[22]2019年研究表明，Pi2、Pi9對(duì)浙江省稻瘟病生理小種的抗性頻率分別為58.87%和60.99%，具有較廣的抗譜，本研究表明，浙江新育種粳稻品(系)中Pi2基因的分布頻率為67.21%，Pi9基因的分布頻率為26.23%，說(shuō)明Pi2基因在浙江粳稻中得到了較廣泛的應(yīng)用，Pi9基因的利用應(yīng)該加強(qiáng)。Pigm是從四川秈稻“谷梅4號(hào)”中分離鑒定的一個(gè)廣譜持久抗性基因，有研究表明，Pigm基因?qū)Φ疚敛∩硇》N的抗性頻率高達(dá)91.9%，抗譜較等位基因Pi2、Pi9等更廣，達(dá)75%左右，且在粳稻中幾乎不存在該基因[30-31]，本研究中Pigm分布頻率僅為1.64%，61份品系中只有1份品系被檢測(cè)到Pigm基因，說(shuō)明Pigm基因在浙江粳稻中初步得到應(yīng)用，未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)其在粳稻育種中的應(yīng)用研究。Pib和Pita是最早克隆的兩個(gè)具有廣譜抗性的稻瘟病基因，它們普遍存在于中國(guó)現(xiàn)有粳稻栽培品種中，據(jù)陳濤等[31]研究，在江蘇粳稻中Pita、Pib的分布頻率分別為45.8%、 64.6%，且Pita、Pib組合表現(xiàn)出良好的抗性，而本研究中Pita和Pib的分布頻率為63.93%、91.80%，說(shuō)明這兩個(gè)基因在浙江粳稻中比江蘇粳稻得到更廣泛的利用。另外Pik位點(diǎn)的Pikh/Pi54、Pikm都在浙江粳稻中有一定的分布。本研究中浙江新育成粳稻品種(系)均攜帶多個(gè)抗稻瘟病基因，最少的2個(gè)，最多的有6個(gè)，據(jù)相關(guān)研究證明攜帶抗病基因并不代表表型抗病[15， 32]，抗性水平既與抗性基因數(shù)量的累加有關(guān)，亦與抗性基因之間的互作有關(guān)。掌握水稻品種的抗稻瘟病基因型是改善水稻抗稻瘟病育種工作合理布局的基礎(chǔ)，也是改良優(yōu)質(zhì)水稻抗性資源和培育抗病新種質(zhì)的有效途徑。

續(xù)表4 Continued Table 4

水稻白葉枯病是水稻最嚴(yán)重的病害之一，是由革蘭氏陰性菌黃單胞桿菌水稻變種侵染引起的細(xì)菌性病害。Xa21為成株期廣譜高抗白葉枯病基因[33]，Xa23基因則表現(xiàn)高抗、完全顯性和全生育期抗性[28]。本研究中在浙江新育成的61個(gè)粳稻新品種(系)中均未檢測(cè)到這2個(gè)基因，表明在浙江粳稻種中還沒(méi)用到這2個(gè)基因資源，浙江粳稻中的抗白葉枯病基因型有待進(jìn)一步明確。王付華等[34]研究表明，在20個(gè)沿黃粳稻中也未檢測(cè)到Xa21，而Xa23的分布頻率是60%。本研究中利用秈稻中的Xa23導(dǎo)入粳稻寧84中，在BC1F1中利用剪葉法接種發(fā)現(xiàn)Xa23能顯著的增強(qiáng)粳稻的抗性。因此，在未來(lái)的育種工作中，要針對(duì)性開(kāi)展Xa23 和Xa21抗性基因水稻資源的引進(jìn)與利用，進(jìn)一步提高浙江粳稻對(duì)白葉枯病的抗性。

褐飛虱，屬同翅目飛虱科，能遠(yuǎn)距離遷飛，是中國(guó)和許多亞洲國(guó)家當(dāng)前水稻首要害蟲(chóng)。本研究中利用抗褐飛虱Bph14、Bph15功能標(biāo)記對(duì)浙江61水稻新品種(系)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，同時(shí)檢出Bph14、Bph15基因的材料有4份，均來(lái)源于嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，說(shuō)明嘉興農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院在育種中重視對(duì)褐飛虱抗性基因的利用，為今后粳稻抗褐飛虱育種提供了良好的抗源。蔡之軍等[35]研究利用分子標(biāo)記技術(shù)將B5 中抗褐飛虱基因Bph14、Bph15導(dǎo)入浙北當(dāng)家栽培粳稻品種秀水134、嘉58中，結(jié)果表明B5 攜帶的抗性基因在粳稻背景中能夠有效表達(dá)，能夠增強(qiáng)褐飛虱抗性。本研究利用含有Bph14、Bph15基因的丙16-111與寧88、寧88雜交，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇在F5代對(duì)含有Bph14、Bph15的單株進(jìn)行抗性鑒定，結(jié)果表明，導(dǎo)入Bph14、Bph15的株系均達(dá)到抗以上級(jí)別。本研究結(jié)果與蔡之軍等[35]的研究結(jié)果相同，說(shuō)明Bph14、Bph15在浙江粳稻育種中具有較高的利用價(jià)值。

本研究結(jié)果表明，浙江省新育成的常規(guī)晚粳稻品種(系)具有多個(gè)抗稻瘟病基因，未檢測(cè)到Pil基因，部分品系中含有抗褐飛虱基因Bph14、Bph15，未檢測(cè)到抗白葉枯基因Xa21、Xa23，可能從一定程度上反映出浙江新育成水稻品種(系)部分抗蟲(chóng)害抗性基因的分布情況?？拱兹~枯基因Xa23、抗褐飛虱基因Bph14、Bph15在粳稻育種應(yīng)用表明以上3個(gè)基因均具有良好的應(yīng)用前景，其他抗病基因的實(shí)際抗性效果還需要通過(guò)田間檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果為今后利用分子標(biāo)記輔助技術(shù)將多個(gè)目標(biāo)抗性基因轉(zhuǎn)移到這些待改良品種中，從而培育廣譜多抗水稻新品種提供了科學(xué)依據(jù)。