陳慧君，顧曉菲，田江華，戴元榮，涂軍偉

中性粒細(xì)胞在哮喘的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，中性粒細(xì)胞性哮喘患者具有痰液中性粒細(xì)胞數(shù)目增多、易感染病毒、有較長(zhǎng)的吸煙史和對(duì)糖皮質(zhì)激素抵抗等特點(diǎn)[1-2]。S100A9是鈣結(jié)合蛋白S100家族中重要的一個(gè)成員，具備細(xì)胞調(diào)節(jié)活性，參與花生四烯酸、骨髓細(xì)胞成熟及細(xì)胞遷移等病理過(guò)程，在免疫炎癥性疾病、腫瘤和疼痛等疾病的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用[3]。S100A9在中性粒細(xì)胞哮喘中的作用尚不清楚，哮喘患者痰液的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示S100A9蛋白表達(dá)水平明顯升高[4-5]。羅紅霉素屬于新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對(duì)哮喘的治療有一定價(jià)值，但是其作用機(jī)制目前尚未完全明確[6]。本研究旨在探討S100A9在中性粒細(xì)胞哮喘中的作用及羅紅霉素可能的干預(yù)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 18只6～8周健康雄性SPF級(jí)Brown Norway（BN）大鼠，體質(zhì)量150～180 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0022，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有大鼠均自由進(jìn)食和進(jìn)水，12 h/12 h晝夜明暗交替照明。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠分為對(duì)照組、模型組和羅紅霉素組，每組6只。動(dòng)物操作嚴(yán)格遵循美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院頒發(fā)的《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用及關(guān)愛(ài)指南》。試劑和儀器：卵清白蛋白（OVA）和弗式完全佐劑（FCA）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，羅紅霉素購(gòu)自美國(guó)MCE公司，苯巴比妥購(gòu)于天津阿爾塔科技有限公司，瑞氏-吉姆薩染色試劑盒購(gòu)于上海歌凡生物科技有限公司，多聚甲醛購(gòu)于浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，S100A9、IL-17和IL-25酶聯(lián)免疫吸附試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司。BLD-200Z攝像型三目倒置生物顯微鏡購(gòu)于北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司，HBS-1096C型酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立和藥物干預(yù) 參考Dejager等[7]研究建立中性粒細(xì)胞哮喘模型。模型組和羅紅霉素組大鼠造模第1天、第8天時(shí)腹腔注射乳化（抗原乳化方法）于0.5 ml FCA的含10%OVA的0.9%氯化鈉注射液5 ml。第15天時(shí)，將上述兩組大鼠放置于霧化箱中，給予8周的1%OVA霧化吸入（隔天吸入1次，每次30 min），激發(fā)哮喘。羅紅霉素組大鼠在每次激發(fā)前30 min，給予羅紅霉素灌胃，劑量為30 mg/kg；而對(duì)照組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.2.2 標(biāo)本采集 末次氣道激發(fā)24 h后，腹腔注射苯巴比妥（50 mg/kg）麻醉大鼠，從腹主動(dòng)脈采血3 ml，2 500 r/min離心15 min，留取上層血清。將大鼠左側(cè)支氣管進(jìn)行結(jié)扎，用無(wú)菌0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行左肺支氣管肺泡灌洗，收集灌洗液，1 500 r/min離心10 min，留存上清液，灌洗液離心后的沉渣用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。取大鼠右肺上葉組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為4 m。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)（1）哮喘評(píng)分：0分：活動(dòng)靈活，沒(méi)有出現(xiàn)呼吸急促；0.5分：呼吸急促但并未伴腹式呼吸；1分：呼吸困難；2分：呼吸困難并伴有咳嗽；3分：深入呼吸、張口呼吸、口耳鼻發(fā)紺；4分：休克死亡[8]。（2）肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)：肺泡灌洗液1500 r/min離心10 min，沉淀細(xì)胞經(jīng)處理后取細(xì)胞懸液，經(jīng)瑞氏-吉姆薩染色后顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，包括中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)。每張切片在顯微鏡400倍視野下進(jìn)行觀察，取5個(gè)視野，每視野分類計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算炎癥細(xì)胞所占比例。（3）支氣管肺組織病理學(xué)觀察：將石蠟切片脫蠟至水，隨后進(jìn)行蘇木素染色和伊紅染色（HE染色），最后脫水封片。用顯微鏡觀察大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。顯微鏡下放大200倍，選取20個(gè)完整的支氣管橫斷面，用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量基底膜周徑（Pbm）、支氣管總管壁面積（WAt）、氣道內(nèi)壁面積（WAi）及平滑肌面積（WAm），為消除管徑、氣道狀態(tài)和切片方向等造成的誤差，用Pbm將上述測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)化。以總管壁厚度（WAt/Pbm）、內(nèi)壁厚度（Wai/Pbm）和平滑肌厚度（WAm/Pbm）判斷氣道重塑程度[9]。（4）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清和肺泡灌洗液中S100A9、IL-17和IL-25水平：嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)S100A9、IL-17和IL-25水平，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置為450 nm。（5）免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠肺組織S100A9蛋白表達(dá)：經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、枸櫞酸溶液抗原修復(fù)后，聚乙二醇辛基苯基醚通透，用3%過(guò)氧化氫溶液滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，隨后用山羊血清封閉。滴加S100A9一抗（1∶500），孵育過(guò)夜。用DAB顯色，蘇木精復(fù)染。梯度酒精脫水，二甲苯溶液透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下進(jìn)行觀察，棕黃色為表達(dá)陽(yáng)性。用Image Pro Plus 6.0軟件分析平均光密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況 對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，毛色正常，呼吸均勻。模型組大鼠首次激發(fā)后，表現(xiàn)出呼吸急促、呼吸節(jié)律不規(guī)則及煩躁不安；多次激發(fā)后呼吸癥狀加重，體質(zhì)量稍下降，毛色不光澤。羅紅霉素組大鼠呼吸癥狀較模型組減輕。對(duì)照組和羅紅霉素組哮喘評(píng)分分別為（0.34±0.12）分和（1.25±0.08）分，均低于模型組的（3.02±0.99）分（F=20.001，P＜0.05）。

2.2 各組肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)比較與模型組比較，對(duì)照組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增高（均P＜0.05），而淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯下降（均P＜0.05）。與模型組比較，羅紅霉素組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低（均P＜0.05），而淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增高（均P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 %

2.3 病理學(xué)觀察 對(duì)照組大鼠支氣管壁完整，管腔規(guī)則，基地膜較薄，未見(jiàn)炎癥性改變。模型組大鼠支氣管、肺間質(zhì)、肺泡腔中有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管皺襞較多，并且氣管壁增厚，管腔變窄（封二彩圖3），鏡下可見(jiàn)黏膜上皮細(xì)胞的脫落和壞死；羅紅霉素組大鼠的病理表現(xiàn)較模型組輕。與對(duì)照組比較，模型組WAt/Pbm、Wai/Pbm和WAm/Pbm明顯增高（均P＜0.05）；與模型組比較，上述指標(biāo)明顯降低（均P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 血清和肺泡灌洗液中S100A9、IL-17和IL-25的表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，模型組血清和肺泡灌洗液中S100A9、IL-17和IL-25表達(dá)水平較高（均P＜0.05）；與模型組比較，羅紅霉素組上述指標(biāo)表達(dá)水平較低（均P＜0.05），見(jiàn)表3。血清中S100A9分別與IL-17、IL-25呈正相關(guān)（r=0.797、0.493，均P＜0.05）；肺泡灌洗液中S100A9也分別與IL-17、IL-25呈正相關(guān)（r=0.858、0.708，均P＜0.05）。

表3 血清和肺泡灌洗液中S100A9、IL-17和IL-25的表達(dá)水平 ng/L

2.5 肺組織S100A9的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色顯示S100A9表達(dá)于上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、粒細(xì)胞胞質(zhì)，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色（封二彩圖4）。模型組S100A9平均光密度值為（0.27±0.09），高于對(duì)照組的（0.02±0.05）（P＜0.05），羅紅霉素組 S100A9平均光密度值為（0.09±0.02），低于模型組（P＜0.05）。

3 討論

中性粒細(xì)胞哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能涉及免疫炎癥損傷、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑[10]。因此，闡明中性粒細(xì)胞性哮喘的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。S100家族包含20多個(gè)成員，S100A9定位于人染色體q21上，具有抑制酪氨酸激酶活性[3]。S100A9能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化和黏附，在腫瘤、心血管疾病、風(fēng)濕性疾病及感染性疾病中起到重要作用[4,11-13]。周四芳等[14]發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞S100A8/A9表達(dá)水平與兒童哮喘的病情嚴(yán)重程度和布地奈德治療效果有關(guān)。以上提示S100A9可能在中性粒細(xì)胞哮喘中發(fā)揮重要作用。本研究模型組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、氣道重塑指標(biāo)和炎癥指標(biāo)明顯增高。與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清和肺泡灌洗液中S100A9均較高，這提示S100A9可能參與了中性粒細(xì)胞哮喘的發(fā)生。Kim等[15]研究發(fā)現(xiàn)，S100A9可以通過(guò)促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞因子分泌，抑制中性粒細(xì)胞凋亡，進(jìn)而參與哮喘進(jìn)展。氣道重塑是哮喘重要的病理變化，本研究以WAt/Pbm、Wai/Pbm和WAm/Pbm來(lái)判斷氣道重塑程度，模型組上述指標(biāo)明顯增高，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致。IL-17和IL-25在中性粒哮喘中起到重要作用，與氣道重塑和哮喘嚴(yán)重程度密切相關(guān)[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)血清和肺泡灌洗液中血清中S100A9分別與IL-17和IL-25呈正相關(guān)，這說(shuō)明S100A9可能參與了中性粒細(xì)胞哮喘的氣道重塑。

本課題組前期發(fā)現(xiàn)羅紅霉素可以通過(guò)抑制微囊蛋白-1和磷酸化p42/p44原蛋白激活蛋白激酶，抑制哮喘大鼠的氣道重塑[19]；另外，還能抑制哮喘大鼠的氣道平滑肌增殖[6]。微囊蛋白-1和磷酸化p42/p44原蛋白激活蛋白激酶可能影響了S100A9的活性[6]。筆者推測(cè)羅紅霉素可能是通過(guò)S100A9而發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示與模型組比較，羅紅霉素組S100A9、IL-17和IL-25表達(dá)水平明顯下降，血清和肺泡灌洗液中S100A9分別與IL-17和IL-25呈正相關(guān)。這提示羅紅霉素可能通過(guò)S100A9發(fā)揮抗炎和調(diào)節(jié)氣道重塑作用。

綜上所述，本研究證實(shí)S100A9在中性粒細(xì)胞哮喘的氣道炎癥和氣道重塑中可能起到重要作用，羅紅霉素可能通過(guò)抑制S100A9表達(dá)發(fā)揮治療哮喘的作用。未來(lái)需要進(jìn)一步分析S100A9的具體生物學(xué)機(jī)制，開(kāi)展臨床實(shí)驗(yàn)，分析S100A9在中性粒細(xì)胞哮喘診斷和治療中的作用。