鞏園園，毛 豪，晉湘宜，馮向東，陳茂彬，方尚玲*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 教育部發(fā)酵工程重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.湖北稻花香酒業(yè)股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

白酒作為世界六大蒸餾酒之一，其風(fēng)味物質(zhì)的種類與不同含量比對白酒的品質(zhì)有著巨大的影響。與其他國家的蒸餾酒相比，中國白酒的呈香呈味物質(zhì)量的含量與種類居于首位[1]。白酒作為一種新生代的養(yǎng)生保健食品，頻繁被媒體作為熱點關(guān)注。為了倡導(dǎo)科學(xué)養(yǎng)生，健康飲酒，各大酒廠開始挖掘白酒中的功能性風(fēng)味物質(zhì)來作為衡量保健效果好壞的指標(biāo)[2]。

4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（4-vinylguaiacol，4-VG）是一種丁香類香味的特殊揮發(fā)性成分，具有烘焙香、堅果香以及辛香，感官閾值低，為0.3 mg/L，其不僅是白酒中的主要香味成分之一，也是醫(yī)藥合成中間體，具有健康功能性[3-5]。研究表明，4-VG可以通過阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對癌細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制作用[6]，因此4-VG在食品中的含量及代謝途徑備受關(guān)注?，F(xiàn)有研究報道，4-VG的生物合成法有微生物發(fā)酵法、植物細(xì)胞培養(yǎng)法和酶法[7]。相較于其他兩種，微生物發(fā)酵法以其避免使用重金屬，有機溶劑以及強酸和強堿，成本低、環(huán)保的優(yōu)勢成為近年來生產(chǎn)4-VG的研究趨勢。產(chǎn)4-VG的微生物主要有細(xì)菌和真菌[8-9]。但是，真菌的代謝途徑比較復(fù)雜，且生長周期長，成本高，且細(xì)菌代謝合成4-VG是最經(jīng)濟(jì)的一條途徑，因此篩選高產(chǎn)4-VG的細(xì)菌是當(dāng)務(wù)之急[10-11]。

細(xì)菌產(chǎn)4-VG的主要途徑是以阿魏酸為底物，經(jīng)酚酸脫羧酶將阿魏酸脫羧形成4-VG[12]。酚酸脫羧酶是細(xì)菌中產(chǎn)4-VG的關(guān)鍵酶，由于4-VG在工業(yè)中巨大的潛在商業(yè)價值，酚酸脫羧酶被廣泛關(guān)注，尋找適用于工業(yè)生產(chǎn)的酶資源已成為必然需求[13-14]。但是，由于酶易失活、酶活力受環(huán)境變化影響較大，尋找一種酶活較高的酚酸脫羧酶解決4-VG產(chǎn)率低的問題急需解決。

本研究采用傳統(tǒng)篩選方法對酒醅中產(chǎn)4-VG細(xì)菌篩選，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行菌種鑒定，對產(chǎn)4-VG相關(guān)的酚酸脫羧酶基因進(jìn)行克隆與表達(dá)，探究酚酸脫羧酶的表達(dá)水平，并采用微生物發(fā)酵法應(yīng)用到白酒發(fā)酵過程，以期為實現(xiàn)提高白酒中4-VG含量提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

發(fā)酵酒醅：湖北某酒廠。

1.1.2 試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α、E.coliBL21（DE3）：天根生化試劑有限公司；質(zhì)粒pMD18-T和ExTaq聚合酶：日本Takara公司；質(zhì)粒pET28a（+）：德國Novagen公司；細(xì)菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒：美國Biomiga公司；限制性內(nèi)切酶NcoI-HF（20 000 U/mL）、XhoI（20 000 U/mL）、T4 DNA連接酶（400 000 U/mL）：美國New England Biolabs公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；4-VG（色譜級）：上海源葉生物技術(shù)有限公司；對香豆酸、咖啡酸、芥子酸、阿魏酸、異丙基β-D-半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離純化培養(yǎng)基[15]：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，使用前加入終質(zhì)量濃度為25 μg/mL的制霉菌素。

種子培養(yǎng)基[15]：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[16]：粗麩皮10 g，蒸餾水20 mL。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基[17]：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15 g。121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

S1000梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀：聯(lián)想生物技術(shù)有限公司；JY961N超聲波細(xì)胞粉碎機：寧波新芝生物科技有限公司；E6156 MiniProGel蛋白制膠與電泳系統(tǒng)：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Ulti-Mate 3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）儀：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵酒醅中菌株的分離純化

采用無菌生理鹽水按10倍梯度稀釋酒醅，紗布過濾，取稀釋度為10-3～10-6的稀釋液100 μL均勻涂布于分離純化培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，挑取單菌落進(jìn)行分離純化[18]。

1.3.2 發(fā)酵酒醅中產(chǎn)4-VG菌株的篩選

將分離純化的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，37℃、180r/min條件下培養(yǎng)24 h，以10%（V/V）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵7 d，每組做3組平行。取5 g（濕質(zhì)量）發(fā)酵產(chǎn)物加入50 mL蒸餾水，搖勻30 min，1 000 r/min離心10 min。取10 mL上清液于頂空瓶中，加入20 μL乙酸正戊酯（17.104 g/L）作為內(nèi)標(biāo)，55 ℃條件下平衡15 min，55 ℃條件下吸附30 min，220 ℃條件下解吸5 min，采用GC-MS檢測4-VG含量[19]。

1.3.3 產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將篩選得到的菌株接種于分離純化培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單菌落革蘭氏染色，采用油鏡觀察細(xì)胞形態(tài)[20]。

分子生物學(xué)鑒定：將篩選得到的菌株委托華大基因科技有限公司進(jìn)行16S rRNA基因序列測序，將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對，采用MEGA7.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 酚酸脫羧酶基因的TA克隆與異源表達(dá)

根據(jù)NCBI上的酚酸脫羧酶的基因序列設(shè)計該基因的特異性引物，上游引物為P（Bs）NcoI（5'-CATGCCATGGCCATGGAAAACTTTATCGGAAGCCACA-3'），下游引物為P（Bs）xhoI（5'-CCGCTCGAGTAATTTTCCCGCGCGAATAT CGTCT-3'）。采用細(xì)菌DNA試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，以其為模板PCR擴(kuò)增酚酸脫羧酶基因，PCR擴(kuò)增體系（25 μL）：雙蒸水（ddH2O）17.2 μL，10×ExTaqBuffer（Mg2+Plus）2.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）（10 mmol/L）2.0 μL，引物P（Bs）NcoI和P（Bs）xhoI（20 mmol/L）各1 μL，基因組DNA 1 μL，ExTaq（5 U/μL）0.3 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5-α，然后涂布于LB平板（加1%的100 mg/mL氨芐抗生素），37 ℃條件培養(yǎng)16 h，挑取陽性菌株進(jìn)行測序。提取克隆成功的菌株的質(zhì)粒，采用核酸內(nèi)切酶NcoI-HF、XhoI對該質(zhì)粒及載體pET-28a分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21，然后涂布于LB平板（加入1%的40 mg/mL硫酸卡那霉素），37 ℃條件培養(yǎng)16 h，挑取單菌落進(jìn)行測序驗證，測序成功的菌株為重組工程菌。將重組工程菌接種于100 mLLB液體培養(yǎng)基（加入1%的40 mg/mL硫酸卡那霉素）中，37 ℃、180 r/min條件下擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600nm值為0.8時，添加100 μL IPTG（濃度為500 mmol/L），在20 ℃、180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)16 h[21]。

1.3.5 4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量的測定

采用GC-MS檢測4-VG含量。

氣相色譜條件：DB-WAx色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度280 ℃；升溫程序為初始柱溫65 ℃，保持3min，以5℃/min升溫至150 ℃，保持2 min，再以10℃/min升溫至280 ℃，保持4 min；載氣為高純氦氣（He）（純度≥99.999%），流速0.8 mL/min；進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比20∶1；進(jìn)樣量為1 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；全掃描模式，質(zhì)量范圍45～400 amu；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；溶劑延遲時間3 min。

定性分析：采用美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（NIST）譜庫檢索，對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。

定量分析：以乙酸正戊酯（34.74 μg/mL）為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3.6 酚酸脫羧酶酶活的測定

取50 mL誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液在8 000 r/min條件下離心5 min，棄上清，加入10 mL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）搖勻，70%功率超聲破壁15 min，離心取上清，得到粗酶液，將粗酶液進(jìn)行鎳柱純化。

取50 mmol/L阿魏酸為底物，進(jìn)行酶活力的測定。反應(yīng)體系：Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 5.0）0.8 mL，50 mmol/L阿魏酸0.1 mL，酶液0.1 mL；反應(yīng)條件：37 ℃水浴反應(yīng)5 min后加2 mL甲醇終止反應(yīng)?？瞻讓φ諡镹a2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 6.0）0.9 mL，50 mmol/L阿魏酸0.1 mL[22]。

采用HPLC測定酶液中4-VG的含量。HPLC色譜條件：HypersilGOLD C18色譜柱（3 μm，4.6 mm×250 mm）。流動相為甲醇∶0.1%乙酸=60∶40（V/V），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20μL，檢測波長280 nm[14]。根據(jù)4-VG的生成量計算酚酸脫羧酶酶活，其計算公式如下：

式中：e為所加酶液的量，mL；x為4-VG含量，mmol/L；v為酶促反應(yīng)體系的最終體積，mL；t為酶促反應(yīng)時間，min。

酚酸脫羧酶酶活定義：每分鐘生產(chǎn)1 μmol 4-VG所需要的酶量為1個單位酶活力（IU/mL）。

1.3.7 酚酸脫羧酶分子質(zhì)量的測定

參照王勛等[23]的方法采用鎳柱親和層析純化重組菌發(fā)酵液，純化的酶液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測，測定酚酸脫羧酶的分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚菌株的分離及篩選

從發(fā)酵酒醅中共分離純化出23株細(xì)菌，其中5株細(xì)菌產(chǎn)4-VG，4-VG產(chǎn)量見表1。

表1 5株菌株的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量Table 1 4-vinylguaiacol yield of 5 strains

由表1可知，菌株NF1的4-VG產(chǎn)量最高，達(dá)到0.301 mg/g，高于王少磊等[24]從中高溫大曲中篩選到的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的4-乙基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量（32.89 μg/g）。故將菌株NF1作為目的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)鑒定。

2.2 菌株NF1的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株NF1的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 菌株NF1的菌落（A）及細(xì)胞（B）形態(tài)Fig.1 Colony (A) and cell (B) morphology of strain NF1

由圖1可知，菌株NF1的菌落表面粗糙不透明，呈污白色，外形不規(guī)則，外圈毛糙，內(nèi)有褶皺。在顯微鏡下觀察，細(xì)胞無莢膜，呈長桿狀，周邊有芽孢，芽孢呈橢圓或柱狀，革蘭氏染色為紫色，故為革蘭氏陽性菌。因此，初步鑒定該菌株為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

由圖2可知，菌株NF1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定菌株NF1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖2 基于16S rRNA基因序列菌株NF1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain NF1 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 酚酸脫羧酶基因的克隆及表達(dá)

2.3.1 酚酸脫羧酶基因的PCR擴(kuò)增

以NF1基因組DNA為模板，利用設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3。由圖3可知，目的基因片段堿基長度為483 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，共編碼161個氨基酸。

圖3 目的基因的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果Fig.3 Results of agarose gel electrophoresis analysis of the target gene

2.3.2 酚酸脫羧酶酶活及分子質(zhì)量測定

采用HPLC 測定純化后的發(fā)酵液的4-VG 含量為11.123 mmol/L，通過計算得到酚酸脫羧酶酶活力為66.741 IU/mL。采用SDS-PAGE測定酚酸脫羧酶的分子質(zhì)量，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，與pET28a空載相比，重組蛋白成功表達(dá)，其蛋白分子質(zhì)量大小約為20 kDa。該結(jié)果與文獻(xiàn)報道的解淀粉芽孢桿菌[14]、地衣芽孢桿菌[22]、短小芽孢桿菌[25]、植物乳桿菌[26]中的酚酸脫羧酶的分子質(zhì)量大小是一致的。

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE results of recombinant protein

3 結(jié)論

本研究從發(fā)酵酒醅中篩選出一株高產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的細(xì)菌NF1，其4-VG產(chǎn)量為0.301 mg/g。通過形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。從該菌株中成功克隆得到酚酸脫羧酶基因，并在大腸桿菌（Escherichia coli）表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以50 mmol/L的阿魏酸為底物時，酚酸脫羧酶酶活力為66.741 IU/mL，經(jīng)SDS-PAGE檢測，該酶的分子質(zhì)量約為20 kDa。本研究通過掌握產(chǎn)特殊風(fēng)味物質(zhì)的功能菌，以期對白酒中的特定風(fēng)味物質(zhì)的含量及比例進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而提升白酒的風(fēng)味物質(zhì)。對產(chǎn)特定風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)鍵酶進(jìn)行探究，為未來酶的開發(fā)及利用提供一定的參考依據(jù)，旨在解決酶產(chǎn)率低、不耐高溫等劣勢。