朱文倩，黃奕蔓，王正賢，蔣代華，王忠文，廖詠梅

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧，530004)

沃柑(Orah)是“塔普爾”桔橙與“丹西”紅桔的雜交種，屬于寬皮柑桔類型，來(lái)源于以色列。我國(guó)于2004年由國(guó)家果樹種質(zhì)重慶柑桔圃(依附單位為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所)從韓國(guó)濟(jì)州柑桔試驗(yàn)場(chǎng)引進(jìn)[1]。廣西南寧市武鳴區(qū)于2012年春季開始引種沃柑，至2018年種植面積13.33萬(wàn) hm2(約200萬(wàn)畝)，產(chǎn)量約100萬(wàn) t，估算2020年產(chǎn)量達(dá)到250萬(wàn) t[2-3]。近年，生產(chǎn)中沃柑植株黃化現(xiàn)象日漸突出。關(guān)于沃柑植株黃化的原因，僅見黃其椿等[4]綜述了前人的研究結(jié)果，認(rèn)為主要分為生理性障礙和病蟲危害兩大類原因。許多學(xué)者對(duì)溫州蜜柑、金柑、臍橙等多種柑桔的葉片黃化癥進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，葉片黃化主要是葉片中鈣、鎂、硼、鋅、氮、磷、鐵等營(yíng)養(yǎng)元素含量不足所引起的，多數(shù)屬于綜合缺素癥[5-8]。柑桔在生產(chǎn)上常通過“高接換種”的方式進(jìn)行品種更新，可能存在砧穗不親和性問題。Toplu等[9]研究柑桔不同砧木葉片礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，砧穗不親和會(huì)影響植株吸收、運(yùn)輸養(yǎng)分的效率，出現(xiàn)養(yǎng)分供給不足，從而葉片表現(xiàn)出缺素黃化。廖詠梅等[10]對(duì)茂谷柑根系和根區(qū)真菌進(jìn)行研究的結(jié)果認(rèn)為，黃化癥狀與根系及根區(qū)土壤真菌種群有關(guān)。菌根真菌可以促進(jìn)柑桔根系對(duì)鋅、鐵、鎂、磷、硼等元素的吸收，減輕黃化癥狀[11-15]。為了探明沃柑黃化的相關(guān)因子，進(jìn)而為沃柑黃化的綜合治理提供依據(jù)，筆者自田間采集沃柑黃化植株，盆栽2年后檢測(cè)葉片中的柑桔黃龍病菌，并對(duì)黃化植株與健康植株的根系生長(zhǎng)、土壤因子及根系真菌分子種群進(jìn)行了比較研究。

1 材料與方法

1.1 沃柑植株盆栽2018年4月26日自廣西南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)壇洛鎮(zhèn)富庶村田間采集葉片黃化的沃柑苗(2018年2月種植的香橙砧2年生嫁接苗)，自廣西熱帶作物研究所(廣西南寧市邕武路22號(hào))的從未耕種農(nóng)作物的松樹下采集表層土壤作為盆栽土壤，采用規(guī)格為口徑32 cm×高21 cm的聚乙烯花盆，盆栽采集到的黃化沃柑苗后置于防蟲玻璃溫室內(nèi)，日常管理主要為按常規(guī)方法澆水，每年冬季施一次腐熟雞糞，兩年盆栽期共施過兩次腐熟雞糞，從未換盆加土。在盆栽當(dāng)年7月所有植株恢復(fù)健康，盆栽1年半后部分盆栽植株開始再次出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。

1.2 沃柑盆栽土壤及根系樣品采集2020年6月15日選擇葉片健康綠色的沃柑盆栽植株3株(標(biāo)記為WGJ1—WGJ3)和葉片黃化的沃柑盆栽植株3株(標(biāo)記為WGH1—WGH3)為試驗(yàn)植株。將試驗(yàn)植株整株連土取出盆外，將周圍根系剪斷，并除去表面土壤和根系后，取盆栽土塊的中下部土壤和根系，一起裝入未啟用過的自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室。帶回實(shí)驗(yàn)室的根系樣品，充分抖落表面土壤后，用10目篩(孔徑2.0 mm)過篩，取不帶白色根尖的褐色根段5～10 g，用去離子水清洗干凈并自然晾干表面水分后置于4 ℃冰箱保存。帶回實(shí)驗(yàn)室的土壤樣品，置于空調(diào)室內(nèi)(28 ℃)自然風(fēng)干，剔除石礫、根系殘?bào)w等，用研缽磨碎后分別過18目篩(孔徑0.88 mm)和100目篩(孔徑0.15 mm)，用于土壤pH值及有機(jī)質(zhì)(Organic matter，OM)、全氮(Total nitrogen，TN)、堿解氮(Alkaline hydrolysis N，AN)、速效磷(Available P，AP)和速效鉀(Available K，AK)含量的測(cè)定。

1.3 柑桔黃龍病菌檢測(cè)2020年6月20日自“1.2”中的6株試驗(yàn)植株的東南西北四個(gè)方向采集葉片樣品，用Biospin Plant Genomic DNA Extraction Kit(杭州博日科技有限公司)試劑盒按照說(shuō)明書提取葉片樣品總DNA，用柑桔黃龍病菌特異引物HLBF468/ HLBR877[16]進(jìn)行PCR檢測(cè)。引物的核苷酸序列，HLBF468為5’-GCGATTAAGTTAGAGGTGA-3’，HLBR877為5’-TACCATCTCTGATATCGTCCTATA-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為433 bp。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，其中DNA模板2.0 μL(30 ng/μL)，正反向引物各0.5 μL(10 μmol/L)，Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)10 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃ 3 min，變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，終延伸72 ℃ 5 min，4 ℃保存。陰性對(duì)照模板為PCR檢測(cè)柑桔黃龍病菌結(jié)果呈陰性的沃柑健康植株葉片總DNA，陽(yáng)性對(duì)照模板為PCR檢測(cè)柑桔黃龍病菌結(jié)果呈陽(yáng)性的沃柑植株葉片總DNA。PCR擴(kuò)增完成后，取5.0 μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.4 沃柑根系樣品真菌高通量測(cè)序取在4 ℃冰箱中保存12 h的褐色根段樣品，用試劑盒Biospin Plant Genomic DNA Extraction Kit(杭州博日科技有限公司)提取褐色根段樣品總DNA。經(jīng)電泳未發(fā)現(xiàn)降解現(xiàn)象后，送生工生物工程(上海)股份有限公司，針對(duì)褐色根段樣品總DNA中真菌的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)的ITS2區(qū)域(ITS3：5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’；ITS4：5’-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3’)進(jìn)行PCR，用2%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，割膠回收目標(biāo)條帶，用GeneJET膠回收試劑盒(Thermo Scientific公司)純化PCR產(chǎn)物。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒構(gòu)建文庫(kù)，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用HiSeq2500進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(raw data)，通過拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)(clean data)。基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs(Operational Taxonomic Units，操作分類單位)聚類和物種分類分析，結(jié)合OTUs和物種注釋，得到每個(gè)樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結(jié)果。最后對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、多樣性指數(shù)分析，挖掘樣品之間真菌的組成差異。

1.5 沃柑盆栽土壤樣品分析參照鮑士旦(2000)[17]中的方法測(cè)定土壤樣品中的pH值、有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、速效磷和速效鉀。其中，pH值用雷磁PHS-25型pH計(jì)測(cè)定，有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀-濃硫酸氧化法測(cè)定，全氮含量采用半微量凱氏法測(cè)定，堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定，速效磷含量采用碳酸氫鈉-鉬銻抗比色法測(cè)定，速效鉀采用醋酸銨浸提-火焰光度法測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 20.0軟件中獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析(p>0.05為差異不顯著，p<0.05為差異顯著，p<0.01為差異極顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 盆栽表現(xiàn)2018年4月自田間采集的沃柑黃化苗(圖1-A)，在溫室內(nèi)盆栽定植后，2018年7月可見所有植株長(zhǎng)出的新梢葉片已恢復(fù)為綠色(圖1-B)。在兩年的盆栽過程中，一些盆栽沃柑植株再次出現(xiàn)葉片黃化現(xiàn)象(圖1-C，D)。2020年6月15日采集盆栽沃柑根系及土壤樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于黃化植株，健康植株的根系較發(fā)達(dá)(圖1-H，G)。隨后，將黃化植株枝條進(jìn)行深度修剪，并修剪掉外圍根系，再加土繼續(xù)盆栽，2個(gè)多月后長(zhǎng)出的新梢葉片基本恢復(fù)綠色(圖1-E，F(xiàn))。

2.2 柑桔黃龍病菌檢測(cè)用柑桔黃龍病菌特異引物對(duì)HLBF468/ HLBR877對(duì)6株沃柑盆栽植株(3株葉片健康綠色，3株葉片黃化)的葉片樣品總DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，未見擴(kuò)增條帶，說(shuō)明所檢測(cè)的6株沃柑植株均未感染柑桔黃龍病菌(圖2)。

注：A：2018年4月26日田間將被采集的葉片黃化沃柑苗；B：2018年7月5日拍攝盆栽于溫室內(nèi)的黃化沃柑苗，新梢葉片呈健康綠色；C—D：2020年6月15日拍攝的黃化沃柑苗(C)及其黃化葉片(D)；E—F：2020年8月29日拍攝修剪及斷根后的黃化沃柑苗(E)，葉片已恢復(fù)為健康綠色(F)；G：盆栽沃柑葉片黃化植株根系；H：盆栽沃柑健康植株根系。

2.3 褐色根段真菌高通量測(cè)序真菌門水平的相對(duì)豐度：表1可見，健康植株和黃化植株的褐色根段樣品中均以子囊菌門為主，相對(duì)豐度平均值分別為94.476%和96.479%，經(jīng)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，兩者無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

表1 沃柑褐色根段樣品真菌門水平相對(duì)豐度 %

真菌科水平的相對(duì)豐度：表2可見，在相對(duì)豐度平均值位居前5的科中，健康植株和黃化植株的褐色根段均以叢赤殼科(隸屬肉座菌目Hypocreales)的相對(duì)豐度最高，平均值分別為64.702%和54.844%，經(jīng)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，兩者無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

注：M：2 000 bp DNA分子標(biāo)記；1—3：健康植株(WGJ1- WGJ3)樣品；4—6：黃化植株(WGH1—WGH3)樣品；7：陰性對(duì)照；8：陽(yáng)性對(duì)照。

表2 沃柑褐色根段樣品中位居前5真菌科相對(duì)豐度 %

在叢赤殼科中，相對(duì)豐度最高的均為腐皮鐮孢菌Fusariumsolani，健康植株和黃化植株褐色根段中腐皮鐮孢菌相對(duì)豐度分別為60.347%和47.069%(見表3)，經(jīng)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，兩者無(wú)顯著差異。可見，腐皮鐮孢菌是盆栽沃柑褐色根段中的主要真菌種類。

表3 沃柑褐色根段樣品肉座菌目下真菌種類相對(duì)豐度 %

2.4 盆栽土壤分析表4可見，經(jīng)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，盆栽健康植株和黃化植株土壤之間的pH值及有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、速效磷、速效鉀含量均無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

表4 盆栽沃柑土壤性狀

3 討論

生產(chǎn)上導(dǎo)致沃柑葉片黃化的重要原因之一是缺素[4]。引起缺素的原因有兩個(gè)方面：一是土壤中缺乏相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)元素；二是根系不能正常吸收土壤中的營(yíng)養(yǎng)元素。本試驗(yàn)自田間采集的沃柑植株為新種植的沃柑苗，果園地面幾乎無(wú)雜草，經(jīng)詢問當(dāng)?shù)毓r(nóng)，原因是最近施用了除草劑。故推測(cè)，果園新種植沃柑的葉片黃化可能和施用除草劑傷根，導(dǎo)致根系吸收不良有關(guān)。采集的沃柑黃化苗在溫室中盆栽，3個(gè)月后長(zhǎng)出的第一批新梢，葉片恢復(fù)綠色。分析認(rèn)為，其原因一是挖出沃柑苗時(shí)挖斷了大部分的根系，有促發(fā)新根的作用，二是溫室中的盆栽土壤為自山上松樹下采集的未耕作農(nóng)作物的土壤，從未施用除草劑及其他化學(xué)藥劑，因此，黃化沃柑苗移植到溫室盆栽后，在健康土壤環(huán)境中，新根正常發(fā)育，吸收作用恢復(fù)，新梢葉片即恢復(fù)健康綠色。在盆栽近兩年后，一些植株再次出現(xiàn)葉片黃化現(xiàn)象，將盆栽植株取出花盆后發(fā)現(xiàn)，葉片黃化植株根系明顯比葉片健康綠色的植株少，經(jīng)過重修剪枝條及斷根處理，增加土壤繼續(xù)盆栽，再次長(zhǎng)出的新梢葉片呈健康綠色?？梢姡瑪喔幚砜纱龠M(jìn)新根生長(zhǎng)，提高吸收功能，進(jìn)而使黃化植株新梢恢復(fù)綠色；保持土壤健康和根系發(fā)達(dá)是預(yù)防沃柑葉片生理型黃化的重要措施。

腐皮鐮孢菌是土壤的習(xí)居菌，也是重要的植物病原菌[18-19]，主要為害植株的根系及近土壤的莖基部，引起植物根腐、莖基腐、枯萎等癥狀，如花椒根腐病[20]、西番蓮莖基腐病[21]、桉樹枯萎病[22]等。本文高通量測(cè)序結(jié)果表明，在盆栽沃柑的褐色根段(除去白色根尖)中，主要真菌種類是腐皮鐮孢菌。雖然健康植株褐色根段的重要真菌也是腐皮鐮孢菌，但健康植株根系發(fā)達(dá)，相對(duì)于黃化植株具有吸收功能的白色根尖數(shù)量多，使植株葉片保持綠色。因此，盆栽柑桔時(shí)，應(yīng)盡量避免導(dǎo)致爛根的不當(dāng)管理，如過量澆水和施肥等，要做到定期換盆、剪除過量的褐根，以促進(jìn)白根生長(zhǎng)和提高吸收功能；同時(shí)，進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹θ~修剪，誘發(fā)新梢抽發(fā)，增強(qiáng)植株長(zhǎng)勢(shì)，也有利于避免植株產(chǎn)生黃化現(xiàn)象。

土壤中有豐富的微生物資源，據(jù)估算，1 g土壤中有數(shù)千乃至數(shù)萬(wàn)種約數(shù)十億個(gè)微生物個(gè)體[23]，包括固氮菌、解磷菌、解鉀菌等，通過微生物的活動(dòng)，釋放土壤中的各種營(yíng)養(yǎng)元素，滿足植物的營(yíng)養(yǎng)需求。田間栽培條件下，柑桔的根毛很短[24]，一般被認(rèn)為柑桔根毛少甚至無(wú)，高度依賴叢枝菌根替代根毛吸收養(yǎng)分[25]。因此，在沃柑的栽培管理過程中，提倡果園生草、增施有機(jī)肥、減少使用化學(xué)肥料與農(nóng)藥，以增加土壤有機(jī)質(zhì)和豐富土壤中的微生物菌群，促進(jìn)沃柑菌根的形成及土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的釋放；栽培過程適當(dāng)進(jìn)行斷根處理，促進(jìn)新根生長(zhǎng)，提高吸收土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，減少沃柑自然黃化的概率。

4 結(jié)論

在未感染柑桔黃龍病的前提下，田間表現(xiàn)黃化的沃柑植株，移栽到健康土壤環(huán)境中盆栽即可恢復(fù)綠色；在盆栽過程中，再次出現(xiàn)黃化現(xiàn)象時(shí)，經(jīng)修剪枝條和斷根處理，新梢葉片也可恢復(fù)綠色。在土壤條件基本一致的情況下，根系發(fā)達(dá)、白根數(shù)量多是沃柑植株健康的必要條件。沃柑褐色根段上的真菌種類主要是腐皮鐮孢菌，該菌可加速盆栽沃柑根系的老化和腐爛，使根系群體數(shù)量減少，導(dǎo)致植株出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。及時(shí)換盆斷根，可促進(jìn)新根生長(zhǎng)，提高吸收能力，減少黃化植株。在生產(chǎn)中，加強(qiáng)肥水管理，增施有機(jī)肥，保持土壤健康，適當(dāng)修剪枝條和斷根處理，可避免或減輕沃柑生理型葉片黃化現(xiàn)象的發(fā)生。