宋明波 賀疆滔 謝春剛 蔡林鋼 王松 劉延 時春明

摘? ? 要：為了積極救護準(zhǔn)噶爾雅羅魚的種質(zhì)資源，2019年首次在新疆精河入艾比湖三角洲開展準(zhǔn)噶爾雅羅魚標(biāo)記放流，放流地點為艾比湖南岸湖濱區(qū)，標(biāo)記方法有4種，分別是PIT頻射芯片、色素注射、CWT線碼和熒光（ARS）浸染標(biāo)記，2019—2020年共標(biāo)記3.2萬尾。結(jié)果表明：準(zhǔn)噶爾雅羅魚PIT頻射芯片標(biāo)記傷口使用100 mg·L-1的高錳酸鉀溶液涂抹消毒，有利于損傷組織迅速結(jié)痂，減少損傷處病原體感染;色素注射標(biāo)記顏色以綠色為佳，植入魚類上額的皮下組織，標(biāo)記橫向長度為10～12 mm;CWT線碼標(biāo)記的植入位置為上額的皮下組織;熒光浸染標(biāo)記中茜素紅S（ARS）濃度160～180 mg·L-1對準(zhǔn)噶爾雅羅魚未造成明顯損傷;4種標(biāo)記成活率均高于98.8%，標(biāo)記保持率均高于93.7%，說明4種方法適合準(zhǔn)噶爾雅羅魚的放流標(biāo)記。該結(jié)果可為準(zhǔn)噶爾雅羅魚的增殖放流及效果評估工作提供科研基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：準(zhǔn)噶爾雅羅魚;標(biāo)記放流;CWT線碼標(biāo)記;PIT頻射芯片標(biāo)記;色素注射標(biāo)記;熒光（ARS）浸染標(biāo)記

中圖分類號：X835? ? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.05.011

Abstract： In order to actively rescue the germplasm resources of Leuciscus merzbacheri， the experiment was conducted to release the labeled Leuciscus merzbacheri from JingheRiver to Ebinur Lake delta in Xinjiang firstly in 2019， and the releasing place was the lakeside area in the Southern Ebinur Lake. Four labeling methods including Passive integrated transponder（PIT）， pigment injection labeling， Coded Wire Tag（CWT） line code and fluorescence （Alizarin Red S， ARS） staining were used， and a total of 32 000 fish were labeled from 2019 to 2020.The results showed that 100 mg·L-1 potassium permanganate solution could be used in the fish wound formed in the PIT label method， which was conducive to the formation of injured tissue scab rapidly and the reduction of pathogen infection.The optimum color of pigment injection labeling method was green， the optimum injecting position was the subcutaneous tissue of the upper forehead，and the transverse length was 10-12 mm. The implantation position of CWT method was subcutaneous tissue of the upper forehead. The fluorescent staining showed that Alizarin Red S（ARS） concentration of 160-180 mg·L-1 did not cause obvious damage to the fish. The survival rate of the four markers was higher than 98.8%， and the retention rate was higher than 93.7%，indicating that all the four methods were suitable for the release marking of Leuciscus merzbacheri. This study could provide a scientific basis for the proliferation and release of Leuciscus merzbacheri and its effect evaluation.

Key words： Leuciscus merzbacheri; labeled release; Coded Wire Tag line code labeling; Passive integrated transponder; visible implant elastomer; fluorescence（Alizarin Red S， ARS）? staining labeling

標(biāo)記放流技術(shù)最初用于研究魚類的洄游，通常是給魚做上標(biāo)記后放流，再根據(jù)標(biāo)志魚的回捕記錄，繪制該魚的洄游路線圖和回捕分布圖，用以推測其游動的方向、路線、范圍和速度;利用標(biāo)志魚類的回捕率以及體長、體重等生物學(xué)數(shù)據(jù)，可以估算標(biāo)志魚類種群的變動，評價增殖放流的效果[1]。近年來，由于標(biāo)記方法和產(chǎn)品不斷創(chuàng)新和完善，標(biāo)記技術(shù)也隨之獲得很大發(fā)展[2]。魚類標(biāo)記技術(shù)大致分為 5 類：外部標(biāo)記技術(shù)（External tag and mark）、內(nèi)部標(biāo)記技術(shù)（Internal tag and mark）、化學(xué)標(biāo)記技術(shù)（Chemical mark）、生物標(biāo)記技術(shù)（Biological mark）及分子標(biāo)記技術(shù)（Genetic mark）[3]。其中，常用的標(biāo)記方法包括：PIT頻射芯片標(biāo)記（PIT，Passive integrated transponder）、CWT線碼標(biāo)記（CWT，Coded Wire Tag）、色素注射標(biāo)記（VIE，Visible implant elastomer） 、茜素紅S（ARS ，Alizarin red S）熒光浸染標(biāo)記等，前二者均屬物理標(biāo)記，后二者屬于化學(xué)標(biāo)記。PIT頻射芯片標(biāo)記即將規(guī)格為8 mm×1.4 mm的玻璃材質(zhì)芯片，采用皮植方法注射于魚體背鰭下端的肌肉里進行標(biāo)記，每個芯片有獨自編碼，使用手持掃碼器即可檢出;CWT線碼標(biāo)記也稱十進制編碼魚類標(biāo)記線，是通過特定的標(biāo)志器將有標(biāo)編碼的細小金屬絲注入魚體的一種體內(nèi)標(biāo)志，此方法保留時間較長，手持金屬探測器可檢出，方便回捕跟蹤調(diào)查研究魚類生活習(xí)性;色素注射標(biāo)記即用魚類熒光標(biāo)記與魚類熒光標(biāo)記催化劑混合后，在6～24 h內(nèi)將標(biāo)記注入魚體皮下，標(biāo)記后魚體肉眼可清晰辨別色素帶，主要應(yīng)用于種群區(qū)分，封閉流域，保護物種放流;茜素紅S是一種染料型配位劑，可與鈣離子配合以沉淀沉積在骨骼中形成熒光標(biāo)記[4]。

對于瀕危物種而言，大規(guī)模人工放流之后，對其進行標(biāo)記回捕可以建立數(shù)據(jù)庫，進行數(shù)學(xué)模型分析，定期監(jiān)測野生種群動態(tài)變化，評估人工放流的成效等[5]。與新疆裸重唇魚（Gymnodiptychus dybowskii）共同列為I級保護水生野生動物[6]的準(zhǔn)噶爾雅羅魚（Leuciscus merzbacheri）屬鯉科雅羅魚屬，為冷溫帶平原區(qū)的上層魚類，該魚為河湖型的小型魚類，體長形，側(cè)扁，腹部圓，體長和體質(zhì)量分別可達31 cm和403 g，屬雜食性魚類，主要以有機碎屑、水生植物和水生昆蟲為食，其在精河天然水域中性腺發(fā)育到Ⅳ期的時間為4～6月，成熟卵粒為淡黃色。準(zhǔn)噶爾雅羅魚在世界范圍僅分布于中國新疆北部的準(zhǔn)噶爾盆地（45°N，85°E），是該區(qū)域內(nèi)標(biāo)志性物種，也是新疆獨有的土著魚類，為準(zhǔn)噶爾盆地諸河中唯一一種具有較高經(jīng)濟價值的魚類[6-7];其早期自然分布的水域包括瑪納斯河、奎屯河、精河、博爾塔拉河等;由于水生生態(tài)環(huán)境的變化，以及人類的經(jīng)濟活動，準(zhǔn)噶爾雅羅魚生存的天然河道渠系化、水量減少、魚類棲息生境破碎化和生態(tài)阻隔，造成了準(zhǔn)噶爾雅羅魚分布范圍不斷萎縮，目前僅在精河入艾比湖三角洲、奎屯河入艾比湖河口區(qū)域內(nèi)有分布;1998年準(zhǔn)噶爾雅羅魚被《中國瀕危動物紅皮書》（魚類）列為易危物種[8]。

近年來，由于人類活動、自然生境改變以及水質(zhì)下降等因素的影響，新疆漁業(yè)資源量明顯降低，土著魚類增殖放流作為恢復(fù)和改善漁業(yè)資源量的一項主要措施在新疆已執(zhí)行多年[9]。2018年，新疆已開展額爾齊斯河、伊利河和塔里木河水系3種代表性土著魚種──扁吻魚（Aspiorhynchus laticeps）、高體雅羅魚（Leuciscus idus）和新疆裸重唇魚（Gymnodiptychus dybowskii）標(biāo)記放流[9]，但尚未開展準(zhǔn)噶爾雅羅魚增殖放流標(biāo)記工作，因此開展新疆準(zhǔn)噶爾雅羅魚的增殖放流以及效果評估，對準(zhǔn)噶爾雅羅魚種群的恢復(fù)和改善意義重大。

本研究對準(zhǔn)噶爾雅羅魚增殖放流苗種開展標(biāo)記工作，篩選有利于大規(guī)模標(biāo)記放流的適用性好、穩(wěn)定性高、識別性強、操作簡單的標(biāo)記方法，旨在為了解準(zhǔn)噶爾雅羅魚種群的動態(tài)變化規(guī)律并掌握其放流效果提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗魚

試驗用準(zhǔn)噶爾雅羅魚由新疆水生野生動物救護中心自繁提供，均為子一代培育種，共2種規(guī)格，其中0+齡子一代魚種平均體質(zhì)量（12.82±4.66） g，平均體長（10.16±0.86） cm;1+齡子一代魚種體質(zhì)量（63.75±10.22） g，體長（15.14±0.94） cm。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗魚暫養(yǎng) 標(biāo)記前的魚種均在PE桶（150 cm×150 cm×100 cm）內(nèi)進行暫養(yǎng)5～7 d，標(biāo)記前1 d停止投喂。

1.2.2 試驗魚標(biāo)記 標(biāo)記所用器材及標(biāo)記物于標(biāo)記前均浸于75%酒精中消毒。2種規(guī)格的試驗魚在標(biāo)記過程中均使用濃度為700～800 μL·L-1的2-苯氧乙醇進行麻醉，使試驗魚在3～5 min內(nèi)進入麻醉狀態(tài)，上下唇能夠微微張合，魚體基本無擺動，麻醉的效用在于減少魚體應(yīng)激狀態(tài)，標(biāo)記完成后放入清水中，2～3 min即可恢復(fù)游動。魚體標(biāo)記完成后需使用適宜藥劑進行涂抹消毒。

試驗于2019—2020年采用PIT頻射芯片標(biāo)記、色素注射標(biāo)記、CWT線碼標(biāo)記、熒光浸染標(biāo)記4種方法對準(zhǔn)噶爾雅羅魚進行標(biāo)記。

（1）PIT頻射芯片標(biāo)記采用美國NMT公司提供的電子芯片，對準(zhǔn)噶爾雅羅魚1+齡子一代魚種標(biāo)記1 000尾，標(biāo)記規(guī)格平均體長（15.14±0.94） cm，標(biāo)記部位為背鰭下側(cè)，橫向進針深度10～15 mm，按照消毒和注射程序每尾標(biāo)記電子芯片1個，芯片編碼區(qū)間為900219000018661～900219000019660（圖1-A）。標(biāo)記后的傷口殺菌消毒藥劑設(shè)高錳酸鉀、紅霉素軟膏和聚維酮碘溶液等3種開展對比試驗，每組100尾標(biāo)記魚，設(shè)2個平行組，按照藥物對準(zhǔn)噶爾雅羅魚的殺菌效果和成活率篩選適宜的殺菌消毒藥劑。

（2）色素注射標(biāo)記采用魚類熒光標(biāo)記（VIF，青島海星儀器有限公司）與魚類熒光標(biāo)記催化劑（青島海星儀器有限公司）混合后，設(shè)置綠色和藍色2種顏色，均以0.01～0.02 mL的注射體積對準(zhǔn)噶爾雅羅魚進行色素注射標(biāo)記（圖1-B），同時設(shè)上額的皮下組織、眼眶后緣的角質(zhì)層和鰓蓋膜下緣的角質(zhì)層3個標(biāo)記部位開展對比試驗，每組標(biāo)記100尾試驗魚，設(shè)置2個平行組，根據(jù)色素帶注射判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷不同部位的注射效果，以篩選出最適色素顏色和最佳注射部位。色素帶判斷標(biāo)準(zhǔn)[9]：Ⅰ.水體中及漁獲中清晰辨別色素帶;Ⅱ.可辨別，但魚體體色轉(zhuǎn)換逐漸影響色素帶判斷;Ⅲ.無法判斷，不能辨別魚體色素帶，標(biāo)記無效。

（3）使用美國NMT公司提供的CWT線碼標(biāo)記槍與線碼對準(zhǔn)噶爾雅羅魚進行標(biāo)記，植入位置為上額的皮下組織（圖1-C），標(biāo)記槍進針深度10～12 mm，0+齡準(zhǔn)噶爾雅羅魚子一代魚種標(biāo)記1 000尾，標(biāo)記規(guī)格平均體長（10.16±0.86） cm，每段標(biāo)記線編碼相同，編碼均為271471（圖1-D） ，表示同一批次增殖放流魚種。

（4）選取Sigma牌茜素紅S鈉鹽（上海安譜實驗科技股份有限公司）作為標(biāo)物，選用濃度為160～180 mg·L-1，浸染24～36 h，對試驗魚進行熒光浸染標(biāo)記，標(biāo)記后可在上下頜（圖1-E）、耳石、鰭條、鰓蓋和鱗片等骨質(zhì)結(jié)構(gòu)上形成相應(yīng)標(biāo)記環(huán)。

統(tǒng)計上述4種方法標(biāo)記的死亡率、保持率等數(shù)據(jù)，以篩選適宜準(zhǔn)噶爾魚的最適標(biāo)記方法。標(biāo)記死亡率以標(biāo)記完成后，在增殖放流時進行統(tǒng)計，以死亡個體百分比計。復(fù)測方法：標(biāo)記完成后的試驗魚暫養(yǎng)7～10 d，根據(jù)標(biāo)記數(shù)量隨機取 5%～10%個體復(fù)測標(biāo)記，保持率以可復(fù)測個體百分比計。所有類型標(biāo)記魚種放流前均于水生野生動物救護中心留存200尾，在經(jīng)過150 d的暫養(yǎng)留存后，用于標(biāo)記留存時效的后期觀察。

1.3 放流

將已標(biāo)記過的準(zhǔn)噶爾雅羅魚的試驗魚，通過液態(tài)氧氣罐車運輸至精河入艾比湖三角洲的南岸湖濱區(qū)。該水域水深為2.0～3.5 m，水質(zhì)清澈，水草豐富，適合其試驗魚的索餌、越冬和洄游，為優(yōu)質(zhì)的放流棲息地。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌藥物對PIT頻射芯片標(biāo)記傷口的影響

PIT頻射芯片標(biāo)記受到其個體大小、肌肉損傷程度和藥物治療效果的影響，而出現(xiàn)不同的死亡情況。在采取相同的肌肉注射和個體大小的條件下，高錳酸鉀溶液成活率大于99.5%（表1），因此選擇100 mg·L-1的高錳酸鉀溶液對植入的損傷部位進行涂抹，更有利于損傷組織迅速結(jié)痂，減少損傷處病原體感染（圖1-F）。

2.2 色素注射顏色與標(biāo)記部位的篩選

色素注射標(biāo)記不同位置與顏色的效果對比表明（表2），準(zhǔn)噶爾雅羅魚上額的皮下組織標(biāo)記長度最長、損失率最低，且該標(biāo)記部位的綠色色素帶長度和辨識度均優(yōu)于藍色，說明色素注射標(biāo)記對準(zhǔn)噶爾雅羅魚來說宜選擇綠色，且注射在上額的皮下組織效果較好。

2.3 標(biāo)記保持率和死亡率

在標(biāo)記保持率方面，CWT線碼和PIT頻射芯片標(biāo)記保持率均在99.5%以上（表3），植入位置分別為上額的皮下組織和背鰭下側(cè)肌肉內(nèi)，效果顯著。色素注射標(biāo)記保持率最低值93.7%，并隨著時間的延長，會出現(xiàn)一定的丟失現(xiàn)象。在標(biāo)記死亡率方面，PIT頻射芯片標(biāo)記死亡率小于1.2%（表3），熒光（ARS）浸染、CWT線碼和色素注射標(biāo)記死亡率均小于0.1%。

3 結(jié)論與討論

2019—2020年新疆水產(chǎn)科研所采取4種方法，共標(biāo)記準(zhǔn)噶爾雅羅魚3.2萬尾，陸續(xù)向艾比湖南岸湖濱區(qū)開展增殖放流活動，成活率均高于98.8%，標(biāo)記檢出率高于93.7%。通過研究不同的側(cè)重點，如PIT頻射芯片標(biāo)記側(cè)重于大規(guī)格親魚的跟蹤;CWT線碼、熒光（ARS）浸染和色素注射標(biāo)記適合大規(guī)模的同批次鑒定標(biāo)記，也各有不同的優(yōu)點，增殖放流和效果評價時可根據(jù)需求選取上述對應(yīng)的標(biāo)記方法，進而研究其種群動態(tài)參數(shù)，包括種群年齡組成、成活率、死亡率、性別比例、資源量、遷移率、食性等。這對合理使用資源，保護準(zhǔn)噶爾雅羅魚等易危物種具有重要意義。

3.1 PIT頻射芯片標(biāo)記

PIT頻射芯片標(biāo)記是近年來迅速發(fā)展的電子生物標(biāo)記技術(shù)，在野生和養(yǎng)殖魚類以及其他動物研究中取得廣泛成功，該技術(shù)準(zhǔn)確率高，可以讓每一個被標(biāo)記動物個體有1個唯一的身份證，有助于對有價值的物種進行跟蹤監(jiān)測[10]。PTT標(biāo)記以其能夠跟蹤到個體水平、持久性、試驗魚類感染率低、早期標(biāo)記、標(biāo)記重讀率高，目前已經(jīng)應(yīng)用到露斯塔野鯪（Labeo rohita）、大口鱸（Micropterus salmoides）、鯉（Cyprinidae）和羅非魚（Oreochromis niloticus）等魚類選育工作中[11]。準(zhǔn)噶爾雅羅魚PIT標(biāo)記最佳位置為背鰭下側(cè)肌肉內(nèi)，橫向進針深度10～15 mm。黃松林等[12]研究表明，PIT標(biāo)記也有局限性，某些體型過小的物種或者亞成體并不具備植入PIT標(biāo)簽的條件。因此，本研究選擇體長13.6 mm以上的1+齡及以上魚種進行標(biāo)記，保持率可達99.7%。PIT標(biāo)記是體內(nèi)注射標(biāo)記，穩(wěn)定性較好，保留率較高，這與郝雅賓等[13]研究結(jié)果相似，但有的個體掃描未有結(jié)果，且解剖未發(fā)現(xiàn)PIT標(biāo)記，可能是注入結(jié)束后，拔出注射器時將其順帶而出的原因造成的。準(zhǔn)噶爾雅羅魚在進行PIT標(biāo)記時，要將100 mg·L-1較高濃度的高錳酸鉀溶液涂抹創(chuàng)傷消毒，以減少損傷處病原體感染，待損傷組織快速結(jié)痂以后再進行放流。

3.2 色素注射標(biāo)記

色素注射標(biāo)記（VIE）是用注射器在水生動物的透明或半透明的外表皮注入可識別的熒光膠體，形成可識別的外部標(biāo)志熒光。本試驗中，用注射器將魚類標(biāo)志專用的綠色、藍色熒光色素注射到準(zhǔn)噶爾雅羅魚上額、眼眶后緣和鰓蓋膜下緣，標(biāo)記長度為 5.4～14.6 mm，可利用紫外燈照射方法來鑒定魚苗是否具有熒光標(biāo)記;標(biāo)記用的綠色和藍色染料按說明書進行配制，染料與凝固劑按10∶1的比例混合均勻[14]，在經(jīng)過150 d的暫養(yǎng)留存后，準(zhǔn)噶爾雅羅魚色素注射標(biāo)記的標(biāo)記物會出現(xiàn)部分損失或全部丟失的情況，鰓蓋膜下緣色素帶損失率為10.8%，上額與眼眶后緣留存較好，色素帶損失率為1.3%和2.7%。Simon等[15]采用VIE標(biāo)記小鰻鱺（Anguilla anguilla） 的32 d標(biāo)記保持率為100%，但512 d的標(biāo)記保持率66%，說明VIE較適宜于短期標(biāo)記，標(biāo)記物保持率可能與其標(biāo)記物濃度配比、標(biāo)記物凝結(jié)時間和標(biāo)記位置等相關(guān)。

3.3 CWT線碼標(biāo)記

CWT線碼標(biāo)記是一種廣泛使用的標(biāo)記方法，主要利用標(biāo)記槍將金屬線碼切割下來，植入魚體上額的皮下組織或背部肌肉內(nèi)，回捕魚類后，手持金屬探測器找準(zhǔn)部位檢測線碼并取出，在顯微鏡下將其讀取編碼，以編碼對應(yīng)指定的放流年限和批次。CWT線碼標(biāo)記對標(biāo)記對象的生長、存活以及行為影響較小，非常適于標(biāo)記個體很小的魚類，0.5 mm長的標(biāo)能成功用于體質(zhì)量僅0.25 g的細鱗大馬哈魚（Oncorhynchus tshawytscha），標(biāo)志保持率一般較高[16]。標(biāo)記保持率是衡量放流標(biāo)記是否適宜魚苗標(biāo)記的重要指標(biāo)之一[17]，準(zhǔn)噶爾雅羅魚150 d后的保持率同樣達到99.5%，死亡率為0，且易于辨識。CWT 標(biāo)記小鰻鱺512 d的標(biāo)記保持率為99%，CWT適合長期標(biāo)記。在為期91 d的拉薩裸裂尻魚（Schizopygopsis younghusbandi）標(biāo)志篩選試驗中，CWT標(biāo)記未對拉薩裸鯉尻魚幼魚的生長和存活造成顯著性影響，同時標(biāo)記的保持率也都保持在99%以上[18]，說明CWT標(biāo)記是適合的標(biāo)記方式。

3.4 熒光（ARS）浸染標(biāo)記

熒光藥物（茜素紅S）浸泡法，是一種操作簡單、對魚體傷害小的標(biāo)記方法，但過高濃度引起致死率高[19]。歐陽斌和常劍波[20]在熒光物質(zhì)浸泡標(biāo)記稀有鯽鮈（Gobiocypris rarus）仔、稚魚的研究中發(fā)現(xiàn)茜素絡(luò)合物在濃度為30～150 mg·L-1（浸泡 24 h）時稀有鯽鮈幼魚成活率大多達到100%，在濃度為200 mg·L-1時，死亡率為100%;張濤等[19]在保證存活率的基礎(chǔ)上，扁吻魚選用179～400 mg·L-1做標(biāo)記。通過本試驗初步認(rèn)為，濃度160～180 mg·L-1對準(zhǔn)噶爾雅羅魚未造成明顯損傷，標(biāo)記效果較好。ARS可在黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）鈣化組織上形成清晰、肉眼可見的紫色或紫紅色的標(biāo)記，此研究結(jié)果與劉巖等[21]、王臣等[22]研究的結(jié)果向一致。為掌握準(zhǔn)噶爾雅羅魚對茜素紅S的毒性反應(yīng)，需要進一步開展急性毒性試驗。

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