□ 宋海珍 魏萬彩 馬 慶 祁疊鳴 石紅霞 蘭州中檢科測試技術(shù)有限公司

沙門氏菌為革蘭氏陰性桿菌，屬于腸桿菌科，無莢膜和芽孢。其在自然界有廣泛的宿主，主要在動物及人體腸道生長繁殖[1]。近年來，因食品污染沙門氏菌而發(fā)生的食源性疾病或食品安全事件屢見不鮮[2]，已引起社會的廣泛關(guān)注，因此，在食品微生物檢測中，沙門氏菌的檢驗必須加以高度重視。

能力驗證能否通過是評價實(shí)驗室檢驗水平的重要依據(jù)，因此蘭州中檢科測試技術(shù)有限公司微生物檢測部參加外部能力驗證或?qū)嶒炇议g比對以驗證實(shí)驗室能力，保證實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，以提高檢測機(jī)構(gòu)競 爭力[3]。

1 材料與方法

1.1 樣品

實(shí)驗室共收到中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心組織的檢測能力驗證計劃的2份乳粉樣品，樣品編號分別是20-J 793和20-K 562，每份樣品均為白色凍干塊狀，西林瓶真空包裝。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

緩沖蛋白胨水BPW；四硫磺酸鈉煌綠增菌液；亞硒酸鹽胱氨酸增菌液；亞硫酸鉍瓊脂；沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基；營養(yǎng)瓊脂；沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；沙門氏菌屬診斷血清，寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；沙門氏菌陽性菌株鼠傷寒沙門氏菌（CICC 21484）中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.3 儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司；恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司；生物安全柜，Nuaire；胃氏均質(zhì)儀；BagMixer，interscience；電子天平，江蘇常熟市雙杰測試儀器廠；一次性無菌培養(yǎng)皿；無菌稱樣袋；黃口試劑瓶；錐形瓶；試管；移液管等。

1.4 方法

參照能力驗證作業(yè)指導(dǎo)書和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4-2016）[4]進(jìn)行實(shí)驗。所有步驟均為無菌操作。

1.4.1 樣品前處理

從冰箱中取出樣品放進(jìn)生物安全柜，待其溫度恢復(fù)室溫后將樣品的西林瓶打開。樣品需要用60 mL稀釋液再水化。具體操作步驟為：樣品開啟后，立即加入5 mL緩沖蛋白胨水（BPW）進(jìn)行再水化，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，再用余下的稀釋液清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液放入上述無菌瓶中，此溶液是待測樣品原液，等同于60 mL的乳品樣品。

1.4.2 預(yù)增菌

吸取待測樣品原液25 mL于無菌均質(zhì)袋內(nèi)，再稱取225 mL緩沖蛋白胨水，用胃氏均質(zhì)器拍打2 min。將編號2份增菌液、陽性對照和空白對照放置于電熱培養(yǎng)箱，36 ℃培養(yǎng)18 h。

1.4.3 增菌

輕輕晃勻預(yù)增菌培養(yǎng)物，各移取1 mL，分別轉(zhuǎn)種于10 mLTTB 和 10 mLSC，前者于42 ℃恒溫水浴鍋培養(yǎng)24 h，后者于36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.4.4 分離

用10 μL一次性接種環(huán)取增菌液，分別劃線于BS瓊脂平板和沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板進(jìn)行分離，于36 ℃分別培養(yǎng)48 h（BS瓊脂平板）和24 h （沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）。

1.4.5 生化鑒定實(shí)驗

從2個樣品的選擇性培養(yǎng)基平板上分別挑取典型菌落3個，接種TSI，先在斜面劃線，再進(jìn)行底層穿刺，同時直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36 ℃培養(yǎng)24 h。將營養(yǎng)瓊脂平板上純化后的菌落用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙海褂蒙b定試劑盒進(jìn)行鑒定。

1.4.6 血清學(xué)鑒定

1.4.6.1 檢查培養(yǎng)物有無自凝性

取一片潔凈的載玻片，先在上面滴加一滴生理鹽水，再刮取待測菌混勻，30～60 s后在黑色背景下晃動載玻片并觀察反應(yīng)，如果出現(xiàn)菌體凝集成塊或肉眼可見的顆粒，即認(rèn)為有自凝性，反之無自凝性。對未出現(xiàn)自凝性的細(xì)菌培養(yǎng)物按照下面方法進(jìn)行血清學(xué)鑒定。

1.4.6.2 多價菌體抗原O鑒定

在玻片上劃出2個約1 cm×2 cm 的區(qū)域，挑取1環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個區(qū)域下部加1滴多價菌體O抗血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將2個區(qū)域內(nèi)的菌苔研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1 min，并對著黑暗背景進(jìn)行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反應(yīng)。

1.4.6.3 多價鞭毛抗原H鑒定

操作同1.4.6.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性分離結(jié)果

觀察各個平板上生長的菌落,菌落特征見表1。從表1的描述可推斷2份樣品均可能檢出沙門氏菌。

表1 選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征

2.2 生化鑒定結(jié)果

將2份樣品在BS瓊脂平板和沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板的所有菌落形態(tài)在營養(yǎng)瓊脂平板上純化，然后使用生化鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定,生化項目包括三糖鐵、賴氨酸脫羧酶、氰化鉀、靛基質(zhì)、尿素、甘露醇、山梨醇、ONPG，結(jié)果均與沙門氏菌屬生化特性一致，詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 不同菌落形態(tài)的生化反應(yīng)結(jié)果

2.3 血清分型結(jié)果

按照GB 4789.4-2016對2個樣品進(jìn)行血清學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)A～F多價O血清、H多價2、H多價4均凝集，故進(jìn)一步開展血清分型，結(jié)果見 表3。

表3 血清分型結(jié)果

3 結(jié)論

此次實(shí)驗中選擇性瓊脂培養(yǎng)基直接采用了BS瓊脂平板和沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板，后者相比木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂和HE瓊脂，對沙門氏菌屬有更高的特異性，可以排除大腸菌群及其他雜菌的干擾。

多價鞭毛抗原（H）鑒定時，直接從培養(yǎng)基上刮取待測菌混勻于診斷血清中，凝集效果不好。參照國家標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)可能是因為H抗原發(fā)育不良的緣故，經(jīng)過多次試驗，將菌株接種在0.6%半固體瓊脂平板的中央，待菌落蔓延生長時,在其邊緣部分刮取待測菌混勻于診斷血清中，幾分鐘后就出現(xiàn)了細(xì)菌凝集成塊或肉眼可見的顆粒，凝集效果有了明顯提高，后期再做血清學(xué)鑒定時可采用此方法。

能力驗證是檢驗實(shí)驗室人員是否具備檢測某個項目的技術(shù)能力，是提高實(shí)驗室整體檢測水平的重要途徑[5]。本實(shí)驗室此次能力驗證結(jié)果與考核方一致，結(jié)果為滿意。