郝廣志,初廣新,劉佳明,梁國標(biāo)

(解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科,沈陽 110016;*通訊作者,E-mail:liangguobiao2011@163.com)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是腦底或腦表淺部位顱內(nèi)血管破裂引起的出血性中風(fēng),是一種常見的出血性腦卒中疾病,具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。其中由腦內(nèi)動脈瘤破裂導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔動脈出血約占85%,即使挽救了患者的生命,幸存者也常伴有神經(jīng)功能損傷和認(rèn)知功能障礙,嚴(yán)重地影響了患者的生存質(zhì)量[2]。研究表明SAH后會引起早期腦損傷(early brain injury,EBI),包括顱內(nèi)壓升高、腦血流和腦灌注壓降低、血腦屏障(BBB)損傷、腦水腫、急性腦血管痙攣和神經(jīng)元凋亡,是導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血患者不良預(yù)后的重要因素[3-5]。研究表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后會出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡的情況[6]。李霞等[7]研究發(fā)現(xiàn)SAH后神經(jīng)元的凋亡與JNK/c-Jun/caspase-3信號通路密切相關(guān),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程。提示減輕細(xì)胞凋亡可作為減輕SAH后EBI的新靶點(diǎn)。

Bcl-2/Bax凋亡信號通路作為一種調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和存活的信號通路,與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[8,9]。潘峰等[10]發(fā)現(xiàn),在缺血性腦卒中模型大鼠中,Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低,Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高,誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,造成神經(jīng)功能障礙。在SAH后,Bcl-2在腦皮質(zhì)部位的表達(dá)呈時間依賴性下降[11]。caspase-3和Bax在下丘腦部位表達(dá)量顯著上升,而Bcl-2呈現(xiàn)下降趨勢[12]。但是Bcl-2在蛛網(wǎng)膜下腔出血中誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的探究。

微小RNA(miRNA, microRNA)由19-24個核苷酸組成,能結(jié)合到目標(biāo)mRNA上,進(jìn)而抑制mRNA的翻譯及功能,促進(jìn)相應(yīng)mRNA降解。miRNA還可靶向結(jié)合到基因啟動子特定區(qū)域并誘導(dǎo)基因表達(dá)[13]。研究表明SAH后存在多種miRNAs異常表達(dá)的現(xiàn)象[14],miR-448在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常,如肝癌[15]、非小細(xì)胞肺癌[16]等。本課題組前期研究中通過基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)miR-448在SAH時表達(dá)上調(diào)。本研究旨在探討miR-448對蛛網(wǎng)膜下腔出血的作用及機(jī)制,為蛛網(wǎng)膜下腔出血的治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞RAOEC(上海晶抗生物工程有限公司),lipo2000轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體(美國invitrogen公司),FBS、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司),Trizol(美國life technologies公司),氯仿、DEPC(DNase/RNase-free)水、異丙醇(北京鼎國生物技術(shù)有限公司),報(bào)告基因試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),NP40裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR試劑盒(北京天根生化科技有限公司),抗體:Bcl-2,GAPDH和羊抗兔IgG(北京博奧森公司)。

1.2 模型建立

本研究中使用的所有方案均經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物管理和使用委員會批準(zhǔn)。選取體質(zhì)量在160-180 g之間的成年雄性SD大鼠,購自北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心,許可證號:SCXL(遼)2014-0002。采用血管內(nèi)穿刺法[17]構(gòu)建SAH動物模型,戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后,暴露出頸內(nèi)動脈、頸外動脈和左頸總動脈,結(jié)扎左頸外動脈并切開,留下一個3 mm的動脈截塊,通過大腦中動脈分支將尼龍縫合線插入左側(cè),縫合線進(jìn)一步向前推進(jìn)約3-5 mm,以刺穿動脈,持續(xù)10 s后有明顯的血流流出即成功建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型;假手術(shù)大鼠(sham)采用相同的治療程序,但不刺破血管,血流也無明顯變化。36只大鼠隨機(jī)分為兩組:模型組(n=18)和假手術(shù)組(n=18)。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時PCR(real-time PCR)檢測miR-448在SAH腦組織中的表達(dá)

在CFX96 TouthTM實(shí)時PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Lab,Inc.,Hercules,California,U.S.A.)上使用SYBR檢測試劑盒進(jìn)行實(shí)時PCR,使用1 μl模板、0.4 μl正向引物、10 μl 2×mix預(yù)混劑(含SYBR和ROX)、0.4 μl反向引物、2 μl cDNA和6.2 μl ddH2O,最終體積為20 μl(均來自天根生物科技)。將每次反應(yīng)的總體積20 μl轉(zhuǎn)移到96孔板上,在95 ℃下培養(yǎng)15 min,隨后在94 ℃下5個循環(huán)25 s,65 ℃下培養(yǎng)30 s,72 ℃下培養(yǎng)34 s,然后在94 ℃下45個循環(huán)20 s,60 ℃下培養(yǎng)34 s。所有樣品一式三份。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.4 Bcl-2在SAH腦組織中的表達(dá)

1.4.1 免疫熒光法檢測細(xì)胞凋亡情況 造模7 d后,在sham組和SAH組隨機(jī)各取4只大鼠,處死,取腦組織,制作石蠟切片。脫蠟至水后,用50 μl的TUNEL反應(yīng)緩沖液處理15 μm厚的腦切片,并在37 ℃的黑暗和潮濕的環(huán)境中培養(yǎng)1 h,然后在4 ℃的溫度下用Bcl-2抗體(1 ∶2 000,北京博奧森公司)培養(yǎng)過夜。切片用PBS洗滌5次,每次10 min,在室溫下用二抗(Alexafluor488和Alexafluor594,1 ∶200)孵育2 h。然后用PBS再次洗滌切片5次,每次10 min,然后用DAPI染色5 min,再洗滌3次后,用熒光顯微鏡觀察切片。

1.4.2 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting)檢測組織中Bcl-2表達(dá)情況 采用NP40裂解液將組織勻漿吹散,于冰上靜置5 min,12 000 r/min,4 ℃離心10 min,然后計(jì)算樣本蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行電泳(80-130 V)、轉(zhuǎn)印(100 V,1 h);將脫脂奶粉于室溫封閉1 h;加入1 ∶1 000稀釋的抗體Bcl-2和GAPDH,4 ℃孵育過夜,TBST室溫洗3次。二抗37 ℃,45 min;ECL發(fā)光。

1.5 miR-448過表達(dá)或低表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞RAOEC分為:control組、miR-448+AS組和miR-448組,分別轉(zhuǎn)染無意義小鏈、miR-448+反義鏈miR-448、miR-448。將RAOEC細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h,之后更換為無血清培養(yǎng)基,采用lipo2000脂質(zhì)體試劑(購置于廣州銳博生物科技有限公司),分別向RAOEC轉(zhuǎn)染無意義小鏈、miR-448+反義鏈miR-448、miR-448獲得。

1.6 miR-448對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

分別轉(zhuǎn)染無意義小鏈、miR-448+反義鏈miR-448、miR-448的大鼠主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞RAOEC,采用Annexin Ⅴ-PI染色,培養(yǎng)24 h后進(jìn)行消化、離心,收集下層的細(xì)胞沉淀,重新制成單細(xì)胞懸液。在每管細(xì)胞中分別加入500 μl的Binding Buffer重懸細(xì)胞,再依次加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI。輕輕混勻,室溫下避光孵育15 min,進(jìn)行流式檢測。

1.7 miR-448對下游靶基因Bcl-2活性和表達(dá)的影響

1.7.1 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 為了檢測miR-448對Bcl-2靶向作用,首先用Bcl-2上、下游特異性引物擴(kuò)增Bcl-2的3′UTR序列。將pMIR-REPORT-Luciferase載體進(jìn)行SpeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切。利用連接酶將Bcl-2的3′UTR序列與pMIR-REPORT-Luciferase載體連接,命名為pMIR-LUC-Bcl-2。其次當(dāng)RAOEC細(xì)胞處于對數(shù)生長期時,接種于96孔板,達(dá)到70%融合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將已合成的pMIR-LUC-Bcl-2和pRL-TK分別轉(zhuǎn)染到control組、miR-448+AS組、miR-448組血管內(nèi)皮細(xì)胞中。24 h后,PBS洗滌2次,裂解緩沖液裂解細(xì)胞,加入LAR Ⅱ,檢測螢火蟲熒光素酶活性,隨后立即加入海腎熒光素酶底物Stop & Glo Reagent,立即用酶標(biāo)儀測定海腎熒光。

1.7.2 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting)檢測細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)情況 Western blotting檢測方法同1.4.2,在control組、miR-448+AS組、miR-448組血管內(nèi)皮細(xì)胞系中,檢測Bcl-2的蛋白表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-448在SAH腦組織中的表達(dá)

RT-PCR檢測大鼠腦組織中miR-448 mRNA的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在SAH組腦組織中miR-448 mRNA的表達(dá)量顯著高于假手術(shù)sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。

與sham組比較,*P<0.05圖1 miR-448在SAH腦組織中的表達(dá)Figure 1 The expression of miR-448 in SAH brain tissue

2.2 miR-448對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

與control組和細(xì)胞miR-448低表達(dá)的miR-448+AS組相比,miR-448過表達(dá)的miR-448組細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)上升趨勢(見圖2)。

2.3 Bcl-2在SAH腦組織中的表達(dá)

TUNEL染色觀察Bcl-2的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在SAH組腦組織中Bcl-2表達(dá)顯著低于sham組(見圖3)。

Western blotting檢測Bcl-2的蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在SAH組腦組織中Bcl-2的蛋白表達(dá)水平顯著低于sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

與control組和miR-448+AS組比較,*P<0.05圖2 miR-448對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 The effect of miR-448 on apoptosis of vascular endothelial cells

綠色:TUNEL,紅色:Bcl-2,藍(lán)色:DAPI圖3 Bcl-2 在SAH腦組織中的表達(dá)Figure 3 The expression of Bcl-2 in SAH brain tissue

與sham組比較,*P<0.05圖4 Bcl-2在SAH腦組織中蛋白表達(dá)Figure 4 The protein expression of Bcl-2 in SAH brain tissue

2.4 miR-448對下游靶基因Bcl-2活性和表達(dá)的影響

miRDB軟件分析發(fā)現(xiàn),miR-448與Bcl-2的3′UTR區(qū)域具有結(jié)合位點(diǎn)(見圖5)。與control組相比,miR-448組血管內(nèi)皮細(xì)胞中Bcl-2活性顯著降低;與miR-448組相比,miR-448+AS組血管內(nèi)皮細(xì)胞中Bcl-2活性顯著提高(見圖6)。

圖5 A miR-448對Bcl-2的靶向作用Figure 5 The targeting effect of miR-448 on Bcl-2

在過表達(dá)或低表達(dá)miR-448的血管內(nèi)皮細(xì)胞系中檢測Bcl-2的蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)miR-448可抑制Bcl-2的表達(dá)(見圖7)。

與control組比較,#P<0.05;與miR-448組比較,*P<0.05圖6 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-448對Bcl-2的活性影響Figure 6 The effect of miR-448 on the activity of Bcl-2 in vascular endothelial cells

與control組比較,#P<0.05;與miR-448組比較,*P<0.05圖7 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-448對Bcl-2的表達(dá)影響Figure 7 The effect of miR-448 on the expression of Bcl-2 in vascular endothelial cells

3 討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血是神經(jīng)外科常見的腦血管疾病之一,病死率較高,幸存患者由于早期腦損傷和遲發(fā)性腦缺血常常伴有神經(jīng)功能損傷,是患者SAH不良預(yù)后主要原因。在臨床實(shí)踐中,對于患者早期腦損傷的干預(yù)能夠有效地減少遲發(fā)性神經(jīng)損傷的發(fā)生,有效提高患者的生存質(zhì)量[18]。在對SAH后EBI發(fā)生機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元凋亡是導(dǎo)致EBI中神經(jīng)功能障礙的主要因素[19]。Bcl-2是抗凋亡分子,可通過改變細(xì)胞膜的通透性抑制相關(guān)促凋亡蛋白的釋放和表達(dá),如細(xì)胞色素C等,阻礙細(xì)胞凋亡一系列的級聯(lián)反應(yīng),其表達(dá)降低與腫瘤細(xì)胞的凋亡率呈正相關(guān)[20]。直腸癌相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),miR-1915能夠靶向與Bcl-2結(jié)合,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[21]。本研究發(fā)現(xiàn)在SAH腦組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著低于sham組,提示SAH后存在神經(jīng)細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象,且Bcl-2蛋白參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程。

近些年,研究發(fā)現(xiàn)非編碼RNA的生物學(xué)功能在腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,包括miRNA、IncRNA、circRNA等[22]。miRNA是一類單鏈非編碼小分子RNA,能夠定向與靶基因mRNA結(jié)合,抑制其蛋白的翻譯過程,是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子,其次有研究表明在人腦組織發(fā)生損傷后,腦miRNA表達(dá)量會發(fā)生顯著變化[23]。研究表明其在創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,如細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元可塑性等[24]。本課題組前期在SAH組和sham組腦組織中通過芯片篩選得到差異表達(dá)的miR-448。本研究通過RT-PCR得到相似結(jié)論,提示miR-448在SAH后腦組織損傷中發(fā)揮重要作用。同時miR-448已被證實(shí)參與調(diào)控多種疾病發(fā)生發(fā)展,在肺腺癌中OIP5-AS1靶向作用miR-448/Bcl-2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,miR-448-3p通過調(diào)節(jié)klf5的表達(dá)抑制顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生發(fā)展[25,26]。為了進(jìn)一步探究miR-448在SAH后網(wǎng)膜下腔出血發(fā)生發(fā)展作用機(jī)制,首先分別構(gòu)建過表達(dá)和低表達(dá)miR-448的血管內(nèi)皮細(xì)胞,結(jié)果顯示miR-448組細(xì)胞凋亡水平顯著高于miR-448+AS組,提示miR-448可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。其次,通過miRDB軟件分析,miR-448能夠特異性地結(jié)合到Bcl-2的3′UTR區(qū)域,熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果提示miR-448可顯著調(diào)節(jié)Bcl-2活性,且在miR-448組細(xì)胞系中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著低于低miR-448+AS組,提示miR-448可抑制Bcl-2的表達(dá)。

綜上所述,miR-448通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)參與蛛網(wǎng)膜下腔出血EBI過程,為加深對SAH后EBI相關(guān)病理機(jī)制的認(rèn)識,為臨床治療蛛網(wǎng)膜下腔出血患者腦損傷,減低患者的病死率和傷殘率提供理論數(shù)據(jù)。接下來本課題將探究參與miR-448/Bcl-2過程的信號通路及其他因子,旨在闡明miR-448在蛛網(wǎng)膜下腔出血中的生物學(xué)作用。