王嫻，張艷秋，申嫻，尹立紅，浦躍樸，梁戈玉

1.東南大學(xué) a.公共衛(wèi)生學(xué)院 b.環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210000

2.江蘇省泰州市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境職業(yè)衛(wèi)生科，江蘇 泰州 225300

肺癌是中國新發(fā)病例和死亡人數(shù)最多的癌癥［1］。2020年，中國肺癌新發(fā)病例數(shù)為815 563，占新發(fā)癌癥數(shù)的17.9%；因肺癌死亡714 699人，占癌癥總死亡人數(shù)的23.8%［2］。除遺傳因素外，吸煙、汽車尾氣、霧霾等環(huán)境因素是肺癌的主要危險(xiǎn)因素［3］。肺癌最主要的病理學(xué)亞型為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），占比超過80%［4］。大多數(shù)NSCLC 患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為癌癥末期，難以治愈［5］。此外，許多NSCLC患者會(huì)在手術(shù)后復(fù)發(fā)［6］，這些癌癥末期和復(fù)發(fā)患者的生存率很低［5］。因此，世界衛(wèi)生組織呼吁進(jìn)一步探索NSCLC 的發(fā)病機(jī)制，在NSCLC 的診斷和治療中應(yīng)重視分子生物標(biāo)志物，以便早期篩查，監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展，提供治療靶標(biāo)，改善患者預(yù)后。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一類不編碼蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)性RNA，其異常表達(dá)與多種疾病有關(guān)，包括惡性腫瘤［7］。研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs參與了NSCLC 的發(fā)生發(fā)展，如BRCA1 相鄰基因2 通過調(diào)控Notch1 信號(hào)通路抑制NSCLC 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程［8］，過渡前相關(guān)RNA 可促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［9］，叉頭蛋白F1 毗連非編碼發(fā)育調(diào)控RNA 通過與miR-761 結(jié)合并調(diào)節(jié)尿金屬蛋白酶2 表達(dá)來抑制NSCLC 的發(fā)展［10］。目前人細(xì)胞中鑒定出的lncRNA 超過50 000 種，大多數(shù)lncRNA 的表達(dá)、作用和機(jī)制尚不明確，迫切需要進(jìn)一步研究。

本課題組前期應(yīng)用芯片篩選NSCLC 相關(guān)lncRNAs，發(fā)現(xiàn)腦和生殖器官表達(dá)蛋白反義RNA 1（brain and reproductive organ-expressed protein antisense RNA 1，BRE-AS1）在NSCLC 中表達(dá)下調(diào)［11］。BRE-AS1是長度為1 659 bp的非編碼RNA，位于2p23.2染色體［12］。腦和生殖器官表達(dá)蛋白（brain and reproductive organ-expressed protein，BRE）是存在各種組織中穩(wěn)定細(xì)胞蛋白，主要功能為DNA 損傷修復(fù)和抗細(xì)胞凋亡［13］。BRE-AS1可調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能。例如，BRE-AS1可通過與miR-145-5p 相互作用調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡［14］；過表達(dá)BRE-AS1可以通過抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 的磷酸化抑制膀胱癌細(xì)胞增殖［15］，但BRE-AS1在NSCLC中的功能尚未明確。因此，本研究從多角度檢測(cè)BRE-AS1在NSCLC中的表達(dá)，并探索BRE-AS1的診斷能力、生物學(xué)功能以及調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步了解NSCLC 發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本次研究收集91 例原發(fā)性NSCLC 患者（無放療或化療史）的腫瘤組織及其配對(duì)癌旁組織樣本，患者來自江蘇省南京市胸科醫(yī)院。采集后立即置于RNA保存液中，4℃過夜后-20℃保存?zhèn)溆茫瑫r(shí)記錄所有患者臨床信息。人支氣管樣上皮細(xì)胞（16HBE）、人肺泡上皮細(xì)胞（HpAEpiC）、NSCLC 細(xì)胞（A549 和NCI-H1395）均來自環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，均采用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究已通過東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（編號(hào)：2014ZDSYLL031.0），并獲得患者簽署的知情同意書。

1.2 試劑與儀器

RNA保存液（Tiandz，中國），TRIzol試劑（Invitrogen，加拿大），RIPA裂解液（漢恒，中國），特異引物（捷瑞，中國），胎牛血清（四季青，中國），SYBR Green試劑盒（Promega，美國），雙抗（國藥集團(tuán)，中國），培養(yǎng)基（四季青，中國），A214 試劑盒（GenStar，中國），KGA512周期檢測(cè)試劑盒（凱基，中國），CCK8試劑（Beyotime，中國），異丙醇（國藥集團(tuán)，中國），KGA107 凋亡檢測(cè)試劑盒（凱基，中國），BRE-AS1過表達(dá)慢病毒及相應(yīng)的陰性對(duì)照慢病毒（漢恒，中國），嘌呤霉素（白鯊易，中國）；NanoDrop 2000 光譜儀、酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific，美國），StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR（Applied Biosystems，加拿大）等。

1.3 方法

本研究首先檢測(cè)了BRE-AS1在NSCLC 組織樣本和不同肺癌細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)分析了BRE-AS1在癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)，和組織及細(xì)胞的表達(dá)相互印證，并評(píng)估了BRE-AS1的診斷能力及與NSCLC 臨床特征之間的關(guān)系；其次通過慢病毒轉(zhuǎn)染在肺癌A549 細(xì)胞中過表達(dá)BRE-AS1，檢測(cè)BRE-AS1對(duì)細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響；最后通過功能富集分析BRE-AS1的下游通路，并通過Western blotting法檢測(cè)BRE-AS1對(duì)下游磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響。

1.3.1 NSCLC 組織和細(xì)胞中BRE-AS1 表達(dá)的檢測(cè)及分析應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)組織或細(xì)胞中BRE-AS1的表達(dá)。首先用TRIzol 試劑從組織或細(xì)胞中提取總RNA，并用NanoDrop 2000光譜儀測(cè)量純度和濃度。再用A214 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過StepOnePlus 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)檢測(cè)目標(biāo)mRNA 表達(dá)。PCR 反應(yīng)組分包括1 μL cDNA、5 μL SYBR Qpcr Mix、0.1 μL 特異引物和3.8 μL 無酶水。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 1 min；變性95℃ 15 s，退火60℃30 s，延伸72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。特異引物序列見表1。BRE-AS1表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算，用差異表達(dá)倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）表示BRE-AS1在各組織中的差異表達(dá)情況，F(xiàn)C=-1/2-ΔΔCt。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線及其曲線下面積評(píng)價(jià)BRE-AS1的診斷能力。應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析不同臨床特征（性別、年齡、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期、病理類型）的NSCLC 患者的BRE-AS1表達(dá)水平有無差異。

表1 lncRNA BRE-AS1 和內(nèi)參基因GAPDH 的引物序列Table 1 Primer sequences of lncRNA BRE-AS1 and GAPDH

1.3.2 TCGA 數(shù)據(jù)庫中BRE-AS1 表達(dá)分析從TCGA 數(shù)據(jù)庫（更新于2020年10月）下載1 016 例NSCLC 患者腫瘤組織與110 例正常肺組織測(cè)序數(shù)據(jù)。應(yīng)用TCGA RNASeqV2 系統(tǒng)提取NSCLC 組織與正常肺組織中l(wèi)ncRNABRE-AS1表達(dá)數(shù)據(jù)。采用受者工作特征曲線及其曲線下面積評(píng)價(jià)BRE-AS1診斷能力。

1.3.3 構(gòu)建BRE-AS1 過表達(dá)A549 肺癌細(xì)胞模型通過慢病毒轉(zhuǎn)染，過表達(dá)A549 細(xì)胞中的BRE-AS1，并設(shè)置三個(gè)實(shí)驗(yàn)組：LV-BRE-AS1組、陰性組和空白組。將BRE-AS1過表達(dá)慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒用感染增強(qiáng)液稀釋至1×108TU·mL-1，感染融合度50%左右的A549細(xì)胞，72 h 后用含2 μg·mL-1嘌呤霉素的培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)兩周后得到LV-BRE-AS1組和陰性組，正常培養(yǎng)細(xì)胞為空白組。最后利用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率。

1.3.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)使用CCK8 法檢測(cè)過表達(dá)BRE-AS1對(duì)A549 細(xì)胞增殖能力的影響。將LV-BRE-AS1組和陰性組細(xì)胞種于96 孔板（每孔3 000 個(gè)細(xì)胞）中正常培養(yǎng)12、24、36、48 h 后，每孔中加入10 μL CCK8試劑，在37℃下反應(yīng)2 h 后，在酶標(biāo)儀中于450 nm 波長處測(cè)量光密度值。

1.3.5 細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)使用KGA512 周期檢測(cè)試劑盒評(píng)估過表達(dá)BRE-AS1對(duì)A549 細(xì)胞周期的影響。各實(shí)驗(yàn)組收集1×106個(gè)細(xì)胞，逐步加入0.5 mL乙醇，混勻后4℃過夜。在洗凈的細(xì)胞沉淀中加入0.1 mL的RNaseA，置于37℃水浴鍋中30 min，加0.4 mL RNaseA PI 混勻后4℃避光反應(yīng)30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)488 nm處與DNA結(jié)合的PI紅色熒光強(qiáng)度。

使用KGA107凋亡檢測(cè)試劑盒評(píng)估過表達(dá)BRE-AS1對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響。A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染96 h 后，各實(shí)驗(yàn)組收集1×106個(gè)細(xì)胞，洗凈的細(xì)胞沉淀中加入0.1 mL結(jié)合緩沖液、0.005 mL Annexin V-APC 和0.01 mL 7-ADD 混勻后避光放置15 min，加0.38 mL 結(jié)合緩沖液后，1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3.6 富集分析和蛋白分析通過差異分析TCGA和課題組前期三對(duì)NSCLC 及癌旁組織芯片測(cè)序的數(shù)據(jù)［11］獲得NSCLC 相關(guān)差異mRNA，并取交集。然后，通過R 語言cluster profiler 包進(jìn)行功能富集分析，包括基因本體論（Gene Ontology，GO）富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），分析尋找受lncRNABRE-AS1影響的信號(hào)通路。

應(yīng)用Western blotting法檢測(cè)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的變化。收集細(xì)胞并用RIPA裂解液提取總蛋白后，電泳分離蛋白條帶后轉(zhuǎn)膜，封閉后置于4℃孵育一抗（兔抗人IgG-HRP）過夜。一抗孵育后洗滌，加入二抗（山羊抗兔IgG-HRP）室溫孵育1 h。蛋白表達(dá)由ECL 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)測(cè)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件和Excel 2016 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用t檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)和單因素方差分析各組之間的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BRE-AS1 在NSCLC中表達(dá)

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，BRE-AS1在NSCLC 組織中表達(dá)下調(diào)（FC=-13.15，P＜0.05，圖1A）。TCGA 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，與正常組織相比，BRE-AS1在NSCLC 組織中表達(dá)也下調(diào)（FC=-4.85，P＜0.05，圖1B）。此外，細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，與16HBE 和HpAEpiC 細(xì)胞相比，A549 細(xì)胞中BRE-AS1表達(dá)下調(diào)（FC=-4.87，P＜0.05，圖1C），而NCI-H1395 中BRE-AS1表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，圖1C）。

圖1 BRE-AS1 在NSCLC組織（A、B）及細(xì)胞（C）中的表達(dá)水平Figure 1 Expression levels of BRE-AS1 in NSCLC tissues (A and B)and cells (C)

2.2 BRE-AS1 對(duì)NSCLC的診斷能力

結(jié)果如圖2所示，肺癌患者組織BRE-AS1診斷的ROC 曲線下面積為0.916，95%CI為0.872～0.960，靈敏度為85.6%，特異度為85.7%（圖2A）；TCGA 數(shù)據(jù)庫中BRE-AS1診斷的ROC 曲線下面積為0.853，95%CI為0.809～0.897，靈敏度為84.5%，特異度為66.1%（圖2B），提示BRE-AS1對(duì)NSCLC 具有較高的診斷能力。

圖2 BRE-AS1 診斷NSCLC的ROC曲線Figure 2 ROC curve of BRE-AS1 in predicating NSCLC

2.3 不同臨床特征的NSCLC患者的BRE-AS1 表達(dá)差異

不同性別和病理類型的NSCLC 患者的BRE-AS1表達(dá)水平存在差異（P＜0.05），男性患者低于女性，肺鱗狀細(xì)胞癌患者低于肺腺癌患者（表2）。不同年齡和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期的NSCLC 病人的BRE-AS1表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P≥0.05）。

表2 不同臨床特征的NSCLC 患者的BRE-AS1 表達(dá)差異分析Table 2 Expressions of BRE-AS1 in NSCLC patients with different clinical characteristics

2.4 過表達(dá)BRE-AS1 抑制A549細(xì)胞增殖

以A549 細(xì)胞作為研究對(duì)象，并利用慢病毒構(gòu)建BRE-AS1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（圖3A-C）。圖3D 結(jié)果表明，與陰性組相比，LV-BRE-AS1組的光密度值在24、36、48 h 降低（P＜0.01），提示過表達(dá)BRE-AS1可抑制A549細(xì)胞的增殖。

圖3 BRE-AS1 過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建（A、B、C）及BRE-AS1 對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響（D）Figure 3 Building stable BRE-AS1 over-expressed cells (A,B,and C)and effect of BRE-AS1 over-expression on A549 cell viability (D)

2.5 過表達(dá)BRE-AS1 影響A549細(xì)胞周期與凋亡

細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性組相比，LVBRE-AS1組中S 期比例降低，G2/M 期中比例升高（P＜0.01），提示過表達(dá)BRE-AS1可阻滯A549 細(xì)胞周期于G2/M 期（圖4A）。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，與陰性組相比，LV-BRE-AS1組的晚期凋亡和總凋亡比例增加（P＜0.05），提示BRE-AS1過表達(dá)可誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡（圖4B）。

圖4 BRE-AS1 過表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞周期（A）和細(xì)胞凋亡（B）的影響Figure 4 Effect of BRE-AS1 over-expression on cell cycle (A) and cell apoptosis (B) in A549 cells

2.6 過表達(dá)BRE-AS1 對(duì)PI3K-AKT-mTOR 信號(hào)通路的影響

功能富集分析發(fā)現(xiàn)，NSCLC 相關(guān)差異mRNA 主要富集于133 種基因功能條目以及22 種信號(hào)通路（圖5A、5B，P＜0.05），其中PI3K-AKT信號(hào)通路基因富集數(shù)量最多，因此，推測(cè)BRE-AS1可能通過PI3K-AKT 信號(hào)通路介導(dǎo)NSCLC 生物功能。Western blotting 分析結(jié)果表明，與陰性組相比，LV-BRE-AS1組中AKT3、p-AKT3、mTOR、p-mTOR 表達(dá)降低，PTEN 表達(dá)增高（圖5C、5D），且p-AKT3/AKT3 及p-mTOR/mTOR 也降低（圖5E、5F，P＜0.05），提示過表達(dá)BRE-AS1可抑制PI3K-AKTmTOR 信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

圖5 非小細(xì)胞肺癌中BRE-AS1 相關(guān)的GO（A）和KEGG（B）富集分析及蛋白印跡分析結(jié)果（C-F）Figure 5 BRE-AS1 related GO (A) and KEGG (B) enrichment analysis results in NSCLC and Western blotting results (C-F)

3 討論

近年來，NSCLC 新發(fā)和死亡病例逐年增多，疾病負(fù)擔(dān)嚴(yán)重。由于缺乏有效篩查手段，早期NSCLC 難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)，晚期及復(fù)發(fā)NSCLC 難以治愈［16］，因此NSCLC 生存率很低［17］，迫切需要進(jìn)一步探索NSCLC 的發(fā)病機(jī)制，為尋找更加有效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)［18］。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷成熟［19］，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)。lncRNA是轉(zhuǎn)錄長度超過200 nt 但缺乏蛋白質(zhì)編碼能力的RNA 分子，研究表明其具有調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的能力［20］。例如被轉(zhuǎn)化生長因子β 激活的長鏈非編碼RNA 在肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌和肺癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，并且可以通過結(jié)合miRNA 誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來促進(jìn)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展［21］；lncRNA 肺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1 在肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤中高表達(dá)，可通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、侵襲和遷移［22］。這些研究提示lncRNA 也可能在NSCLC 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

課題組前期對(duì)原發(fā)性NSCLC 組織lncRNA 芯片檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，BRE-AS1在癌組織中表達(dá)下調(diào)［11］。為進(jìn)一步探討B(tài)RE-AS1在NSCLC中的作用，本研究首先檢測(cè)了NSCLC患者組織、TCGA數(shù)據(jù)庫、NSCLC細(xì)胞中BRE-AS1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BRE-AS1在NSCLC 組織及細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，BRE-AS1對(duì)NSCLC具有較高的診斷價(jià)值，且男性患者BRE-AS1的表達(dá)水平明顯低于女性，肺鱗狀細(xì)胞癌患者明顯低于肺腺癌患者，提示BRE-AS1和男性肺鱗狀細(xì)胞癌患者的發(fā)病關(guān)系更加密切。既往研究發(fā)現(xiàn)了一些與NSCLC 相關(guān)的重要lncRNA，如被轉(zhuǎn)化因子β 激活的長鏈非編碼RNA、lncRNA 肺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1 和煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶反義RNA1 等在NSCLC中表達(dá)上調(diào)［21-23］，轉(zhuǎn)錄超保守區(qū)454 等在NSCLC 中表達(dá)下調(diào)［24］。關(guān)于BRE-AS1的報(bào)道較少，Zhang 等［12］通過GEO 數(shù)據(jù)庫分析同樣發(fā)現(xiàn)BRE-AS1在NSCLC 中表達(dá)下調(diào)，與本研究結(jié)果相互印證。

通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示BRE-AS1在NSCLC 中的功能，結(jié)果顯示過表達(dá)BRE-AS1可抑制NSCLC 細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。既往研究顯示不同lncRNAs 對(duì)NSCLC 細(xì)胞功能的影響不同，如過表達(dá)過渡前相關(guān)RNA 可促進(jìn)A549 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［9］，敲低lncRNA X 染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄物可抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［25］，而過表達(dá)轉(zhuǎn)錄超保守區(qū)454 則會(huì)抑制A549 細(xì)胞遷移和侵襲［24］。既往報(bào)道與本研究均顯示BRE-AS1對(duì)腫瘤（膀胱癌、前列腺癌、肺癌）細(xì)胞功能的影響主要體現(xiàn)在抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面［12，14-15］，提示BRE-AS1在NSCLC中具有抑癌作用。

lncRNA在腫瘤中存在多種調(diào)控機(jī)制，如轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路、蛋白質(zhì)修飾以及RNA-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物形成等，其中通過信號(hào)通路來調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展是最普遍的方式之一［26］。Peng等［20］報(bào)道lncRNAs可通過影響Notch、PI3K-AKT-mTOR、核因子κB等多種信號(hào)通路來調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展。為探討B(tài)RE-AS1調(diào)控NSCLC 細(xì)胞功能的潛在分子機(jī)制，本研究首先通過富集分析發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT 可能是BRE-AS1的重要下游通路。目前已知PI3K-AKT通路的激活可以促進(jìn)多種癌癥包括肺癌的發(fā)生［27］，其中關(guān)鍵分子AKT活化后可進(jìn)一步磷酸化mTOR 來介導(dǎo)細(xì)胞增殖、周期和糖代謝［28］，故常常將PI3K-AKT信號(hào)通路與mTOR 信號(hào)通路放一起研究。mTOR 主要調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、能量代謝及細(xì)胞骨架重建［29］，另一關(guān)鍵蛋白PTEN 活化后主要抑制細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［30］。本研究通過Western blotting實(shí)驗(yàn)對(duì)上述關(guān)鍵蛋白及其磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BRE-AS1可能通過抑制PI3K-AKTmTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路來發(fā)揮抑癌作用。

目前關(guān)于BRE-AS1在NSCLC 中作用的報(bào)道較少。本研究利用RT-qPCR 技術(shù)以及TCGA 數(shù)據(jù)庫分析，從多方面檢測(cè)BRE-AS1的表達(dá)并相互驗(yàn)證，結(jié)果準(zhǔn)確可信。本研究仍然存在一定的局限性，僅采用過表達(dá)BRE-AS1進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。因此，未來將結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明BRE-AS1在NSCLC 發(fā)生發(fā)展中的作用。

綜上所述，本研究首先檢測(cè)分析了BRE-AS1在NSCLC 組織樣本、TCGA 數(shù)據(jù)庫和不同肺癌細(xì)胞中的表達(dá)，并評(píng)估了BRE-AS1的診斷能力，發(fā)現(xiàn)BRE-AS1在NSCLC 中低表達(dá)且具有較高的診斷能力；其次通過慢病毒轉(zhuǎn)染在A549 中過表達(dá)BRE-AS1，檢測(cè)BRE-AS1對(duì)細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響；最后通過功能富集和Western blotting 檢測(cè)分析BRE-AS1對(duì)下游PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)BRE-AS1可能通過抑制PI3K-AKT-mTOR 信號(hào)通路來抑制NSCLC細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期，研究為進(jìn)一步了解NSCLC 發(fā)病機(jī)制及篩選新的候選生物標(biāo)志提供依據(jù)。