顧艾鑫 張 童 王天虎 吳 澤 單安山 李建平

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030)

原花青素是一種富含酚羥基的多酚，廣泛存在于各種谷物、豆類(lèi)種子和蔬菜水果的核、皮或種籽中，對(duì)提高血脂、調(diào)節(jié)脂類(lèi)代謝、抗氧化等有明顯的促進(jìn)作用[1-2]，在植物飼料添加劑開(kāi)發(fā)方面具有廣闊的前景。葡萄籽原花青素提取物(grape seed procyanidin extract, GSPE)主要由(+)兒茶素和(-)表兒茶素的二聚體或三聚體組成，因其原花青素含量較高而成為原花青素的主要來(lái)源[3-4]。原花青素具有改善畜禽肉品質(zhì)的潛在作用[5]。張楠等[6]發(fā)現(xiàn)在玉米-豆粕型飼糧中添加GSPE可顯著降低育成豬背最長(zhǎng)肌內(nèi)的肌苷酸含量，提高豬肉鮮味。楊文軍等[7]報(bào)道，飼糧中添加40 mg/kg體重的GSPE可有效提高羔羊屠宰性能，改善羊肉品質(zhì)。李德鵬等[8]觀察到GSPE能通過(guò)抑制脂質(zhì)合成，減少綿羊前脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積。Pascual-Serrano等[9]發(fā)現(xiàn)服用GSPE的肥胖大鼠白色脂肪組織(WAT)中脂肪細(xì)胞變小，高血脂癥也有所緩解。畜禽體脂沉積是影響畜禽產(chǎn)品品質(zhì)的因素之一，伴隨著人們對(duì)飲食健康的逐漸重視，肉類(lèi)制品中的脂肪含量也隨之成為消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)[10]。目前的研究表明，GSPE可以顯著抑制動(dòng)物的脂肪沉積并改善脂質(zhì)代謝。盡管GSPE對(duì)畜禽肉品質(zhì)的影響已有初步研究，但關(guān)于其在脂肪沉積和脂質(zhì)代謝機(jī)制方面的研究尚不完善。脂質(zhì)代謝系統(tǒng)可以通過(guò)無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族3a(Wnt3a)/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)途徑來(lái)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)代謝基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控脂質(zhì)代謝和脂肪沉積[11]。因此，本研究以肥胖模型大鼠為研究對(duì)象，探討GSPE能否降低肥胖鼠體脂沉積、脂肪肝、緩解高血脂并探究Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路是否在其中發(fā)揮作用，為通過(guò)營(yíng)養(yǎng)手段調(diào)控畜產(chǎn)品質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雌性SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；基礎(chǔ)飼糧(大小鼠生長(zhǎng)繁殖飼料Q/CYKAF 002—2018)和高脂飼糧由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供；GSPE由天津尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司提供，原花青素含量≥95%；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)和染料法熒光定量試劑盒(RR420B)由大連TaKaRa公司提供；Wnt3a酶聯(lián)免疫試劑盒和β-catenin酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0010S)購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

微量移液器[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司/中國(guó)艾本德]；多功能酶標(biāo)儀(澳大利亞Tecen Austria GmbH)；7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI)；高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Sigma)；手持式組織勻漿機(jī)(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)等。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 試驗(yàn)飼糧

基礎(chǔ)飼糧組成參見(jiàn)商品飼糧說(shuō)明；高脂飼糧組成為15.00%豬油、12.00%全脂乳粉、13.00%蛋黃粉、1.00%膽固醇和59.00%基礎(chǔ)飼糧?；A(chǔ)飼糧及高脂飼糧營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧及高脂飼糧營(yíng)養(yǎng)水平

1.3.2 大鼠分組及樣品采集

52只5～7周齡(體重170～220 g)雌性SD大鼠被單籠飼養(yǎng)在環(huán)境溫度為(21±4) ℃、室內(nèi)濕度為(60±5)%、通風(fēng)良好、持續(xù)12 h明/12 h暗循環(huán)照明周期的動(dòng)物房中，試驗(yàn)期間大鼠隨意攝入食物和水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分成2組：對(duì)照組(n=22)和高脂組(n=30)，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧和高脂飼糧，每周記錄采食量并稱(chēng)量體重1次。飼養(yǎng)8周后，從對(duì)照組中選出20只體重相近的大鼠隨機(jī)分成2組(n=10)，分別為Ⅰ組和Ⅱ組；同時(shí)，淘汰高脂組中增重較低的肥胖抵抗型大鼠，以體重大于正常組的平均體重±1.96倍標(biāo)準(zhǔn)差為建模成功標(biāo)準(zhǔn)，將體重符合建模要求的20只肥胖敏感型大鼠隨機(jī)分為2組(n=10)，分別為Ⅲ組和Ⅳ組。用生理鹽水溶解GSPE，Ⅰ組和Ⅲ組大鼠用生理鹽水灌胃，Ⅱ組和Ⅳ組大鼠均按500 mg/kg體重劑量用GSPE溶液灌胃。GSPE干預(yù)5周，每周日記錄大鼠采食量及體重1次，試驗(yàn)期間大鼠均被單籠飼養(yǎng)。在處死大鼠前，禁食12 h，處死當(dāng)日稱(chēng)量大鼠終體重及采食量后，用無(wú)水乙醚麻醉大鼠并進(jìn)行眼球取血，2 400 r/min離心1 min后分離血清，保存于-80 ℃冰箱。迅速剖取WAT、肝臟、脾臟、腎臟、腿肌稱(chēng)量后保存于液氮中，后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 臟器重量

試驗(yàn)結(jié)束后，將剖取的WAT、肝臟、脾臟、腎臟、腿肌用生理鹽水沖洗干凈，電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)重。

1.4.2 血清生化指標(biāo)

使用南京建城生物工程研究所的試劑盒測(cè)定血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及葡萄糖(Glu)含量。

1.4.3 WAT中Wnt3a和β-catenin含量

使用無(wú)水乙醇將大鼠WAT在4 ℃低溫勻漿后離心取上清液，使用BCA試劑盒檢測(cè)上清液蛋白濃度，根據(jù)吸光度(OD)值使用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)WAT中Wnt3a和β-catenin含量。

1.4.4 WAT中脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)量

用TRIZOL試劑分離WAT中的總RNA，對(duì)RNA樣品進(jìn)行提純，并在-80 ℃冷凍直至進(jìn)行分析。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用Prime Script RT試劑盒，在去除基因組污染后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄5 μL總RNA合成cDNA。靶基因的引物序列根據(jù)已發(fā)表的GenBank設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成(表2)。本研究中，β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)被用來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化目的基因的表達(dá)。瞬時(shí)離心樣品，并在實(shí)時(shí)熒光定量PCR設(shè)備上以匹配的程序進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s。所有PCR反應(yīng)每個(gè)樣品均進(jìn)行3個(gè)平行，并且通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPARγ)和脂肪酸合成酶(FAS)基因相對(duì)表達(dá)量。

表2 脂肪沉積相關(guān)基因引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 9.2軟件處理數(shù)據(jù)，試驗(yàn)前期建造大鼠肥胖模型時(shí)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較；試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素方差分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，當(dāng)P<0.05時(shí)為差異顯著，當(dāng)0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂飼糧誘導(dǎo)肥胖大鼠模型的建立

由表3可知，經(jīng)過(guò)8周的飼喂，高脂組造模后體重顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，肥胖大鼠模型建立成功。

表3 建模階段大鼠的體重變化

2.2 GSPE對(duì)肥胖大鼠臟器重量的影響

由表4可知，高脂飼糧顯著增加大鼠肝臟重量(P<0.05)，對(duì)WAT重量具有增加的趨勢(shì)(0.050.05)。此外，GSPE對(duì)肝臟重量有顯著的降低作用(P<0.05)，對(duì)脾臟、腎臟及WAT重量無(wú)顯著影響(P>0.05)。高脂飼糧與GSPE對(duì)肝臟重量的影響存在顯著交互作用(P<0.05)，對(duì)WAT重量的影響存在交互作用趨勢(shì)(0.050.05)。對(duì)肝臟和WAT重量進(jìn)一步單因素方差分析，與Ⅰ組相比，Ⅲ組的肝臟及WAT重量顯著升高(P<0.05)，Ⅳ組肝臟重量顯著增加(P<0.05)，Ⅱ組肝臟及WAT重量無(wú)顯著差異(P>0.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組的肝臟及WAT重量顯著降低(P<0.05)。

表4 GSPE對(duì)肥胖大鼠臟器重量的影響

2.3 GSPE對(duì)肥胖大鼠血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，高脂飼糧顯著降低血清HDL-C含量(P<0.05)，顯著增加血清LDL-C含量(P<0.05)，并對(duì)血清Glu含量有增加的趨勢(shì)(0.050.05)。高脂飼糧與GSPE對(duì)血清HDL-C及LDL-C含量的影響存在顯著交互作用(P<0.05)，對(duì)血清Glu含量的影響不存在顯著交互作用(P>0.05)。對(duì)血清HDL-C和LDL-C含量進(jìn)一步單因素方差分析，與Ⅰ組相比，Ⅲ組、Ⅳ組的血清HDL-C含量顯著降低(P<0.05)，Ⅱ組無(wú)顯著差異(P>0.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組顯著升高(P<0.05)。與Ⅰ組相比，Ⅲ組、Ⅳ組的血清LDL-C含量顯著升高(P<0.05)，Ⅱ組無(wú)顯著差異(P>0.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組顯著降低(P<0.05)。

表5 GSPE對(duì)肥胖大鼠血清生化指標(biāo)的影響

2.4 GSPE對(duì)肥胖大鼠WAT中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由表6可知，高脂飼糧顯著上調(diào)WAT中PPARγ基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，對(duì)FAS基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。此外，GSPE顯著下調(diào)WAT中PPARγ基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，對(duì)FAS基因相對(duì)表達(dá)量有下調(diào)趨勢(shì)(0.050.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組顯著降低(P<0.05)。

表6 GSPE對(duì)肥胖大鼠WAT中脂代謝基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.5 GSPE對(duì)肥胖大鼠WAT中Wnt3a和β-catenin含量的影響

由表7可知，高脂飼糧對(duì)WAT中Wnt3a及β-catenin含量均無(wú)顯著影響(P>0.05),而GSPE顯著降低WAT中Wnt3a及β-catenin含量(P<0.05)。此外，高脂飼糧與GSPE對(duì)WAT中Wnt3a及β-catenin含量的影響均存在顯著交互作用(P<0.05)。對(duì)Wnt3a及β-catenin含量進(jìn)一步單因素方差分析，與Ⅰ組相比，Ⅲ組WAT中Wnt3a含量顯著升高(P<0.05)，Ⅱ組、Ⅳ組無(wú)顯著差異(P>0.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組顯著降低(P<0.05)。與Ⅰ組相比，Ⅲ組WAT中β-catenin含量顯著升高(P<0.05)，Ⅳ組顯著降低(P<0.05)，Ⅱ組無(wú)顯著差異(P>0.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組顯著降低(P<0.05)。

表7 GSPE對(duì)大鼠WAT中Wnt3a和β-catenin含量的影響

3 討 論

3.1 GSPE對(duì)肥胖大鼠脂質(zhì)代謝的影響

畜禽肉品質(zhì)與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[12]，因此對(duì)于脂質(zhì)代謝及脂肪沉積方面的研究至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道，飲食中攝入過(guò)量的脂肪酸和膽固醇會(huì)影響血液膽固醇代謝，表現(xiàn)為血清中LDL-C含量異常升高及HDL-C含量降低[13]。而研究表明GSPE干預(yù)會(huì)促進(jìn)體內(nèi)的降膽固醇作用[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，GSPE可顯著下調(diào)肥胖模型大鼠血清中的LDL-C含量并使HDL-C含量升高。據(jù)報(bào)道，脂肪沉積與血清中LDL-C含量升高有關(guān)[15]。本試驗(yàn)中，采用GSPE干預(yù)可以顯著緩解高脂飼糧所致大鼠WAT重量的升高，這與前人研究結(jié)果[16]一致。本試驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，GSPE可顯著降低肥胖大鼠的肝臟重量并對(duì)其他器官重量無(wú)顯著影響。這表明GSPE可抑制脂肪沉積，降低肥胖大鼠患高血脂及脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)性。PPARγ途徑是調(diào)控脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積的重要途徑之一[17]。PPARγ是許多脂肪合成基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它通過(guò)激活脂肪形成程序并將脂肪酸存儲(chǔ)在脂滴中，從而在脂肪細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，脂質(zhì)累積的過(guò)程中往往伴隨著PPARγ基因過(guò)度表達(dá)[18-19]。FAS是一種多功能脂肪合成關(guān)鍵靶基因，通過(guò)抑制FAS基因表達(dá)可抑制脂肪酸的從頭合成[20]。此外，F(xiàn)AS還可以通過(guò)提高PPARγ轉(zhuǎn)錄活性來(lái)參與脂肪合成[21]。研究表明，PPARγ特異性缺失可能影響脂肪在肝臟組織中的形成機(jī)制，降低FAS基因表達(dá)水平，減少肝臟脂肪沉積[22]。Lu等[23]還在體內(nèi)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GSPE可有效地抑制飼喂高脂飼糧的草魚(yú)肝臟內(nèi)PPARγ的mRNA表達(dá)量。本試驗(yàn)中觀察到GSPE干預(yù)后的肥胖大鼠WAT重量減少以及WAT中脂肪酸合成基因FAS和PPARγ的基因相對(duì)表達(dá)量下調(diào)。以上結(jié)果表明，GSPE可以通過(guò)下調(diào)WAT內(nèi)脂肪合成基因表達(dá)至正常水平來(lái)降低體內(nèi)WAT含量，與本試驗(yàn)中GSPE降低WAT含量的結(jié)果一致。

3.2 GSPE對(duì)肥胖大鼠WAT中Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路的影響

脂質(zhì)積累過(guò)多是引起脂肪細(xì)胞功能障礙的主要原因之一[24]。Wnt3a是重要的分泌蛋白，已被證實(shí)在細(xì)胞發(fā)育增殖、脂質(zhì)代謝等生理過(guò)程中有重要作用[25]。作為Wnt3a途徑中的主要細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)子，β-catenin由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核是Wnt3a信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵步驟[26]。Wnt3a可與其受體低密度脂蛋白(LDL)受體相關(guān)蛋白(LRP)5/6及卷曲蛋白(Fz)相結(jié)合，使β-catenin穩(wěn)定，啟動(dòng)Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路[27]。研究表明，Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路參與肥胖的合成，抑制Wnt3a的表達(dá)，阻斷Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞凋亡[26,28]。有報(bào)道稱(chēng)，植物多酚可通過(guò)抑制Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖分化[29]。Joven等[30]發(fā)現(xiàn)植物多酚可以調(diào)節(jié)肝臟中miRNA-103的表達(dá)量，而miRNA-103具有通過(guò)靶向抑制Wnt3a的表達(dá)來(lái)緩解脂肪沉積的功能[26]，因此植物多酚對(duì)脂肪形成的抑制作用可能與Wnt有關(guān)[31]。在本研究中，GSPE下調(diào)了WAT中Wnt3a及β-catenin的含量，這意味著GSPE可能通過(guò)抑制Wnt3a與LRP的結(jié)合，進(jìn)而抑制Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路而破壞大鼠脂肪細(xì)胞的增殖分化。由此可見(jiàn)，GSPE可能通過(guò)抑制Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路來(lái)抑制大鼠脂肪細(xì)胞的增殖和分化。

4 結(jié) 論

GSPE能夠緩解肥胖大鼠脂肪肝、高血脂，抑制肥胖大鼠脂肪沉積，并對(duì)其他器官重量無(wú)顯著影響。Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路可能參與了GSPE對(duì)肥胖大鼠脂肪形成的抑制作用。