李 莉 馬 升 張 京 徐維娜 徐建雄

(上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海市獸醫(yī)生物技術重點實驗室，上海 200240)

動物養(yǎng)殖過程中，受環(huán)境、營養(yǎng)、心理等因素影響，易發(fā)生腸道炎癥，腸道炎癥發(fā)生的同時往往伴隨肝臟疾病，因此，開發(fā)新型飼料添加劑緩解腸道和肝臟損傷具有重要意義。Uko等[1]觀察到腸道炎癥會誘發(fā)肝臟并發(fā)癥，并且大多數(shù)治療炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的藥物對腸道和肝臟有不良影響[2]。IBD是一種非特異性腸道炎癥疾病，以葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium salt，DSS)誘導的小鼠結腸炎是最常見的研究模型[3]，之前的研究大多集中于利用DSS潰瘍性結腸炎模型研究IBD。Kitajima等[4]發(fā)現(xiàn)利用DSS處理小鼠后，DSS會分布在肝臟枯否氏細胞、腸系膜淋巴結巨噬細胞和大腸固有層細胞，但目前未見關于DSS處理是否會對肝臟造成損傷的報道。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧自由基(ROS)參與調控結腸炎的發(fā)展[5]，抗氧化劑如維生素C、維生素E等具有清除自由基、緩解氧化應激和炎癥的作用[6-7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，微生物源性抗氧化劑(microbe-derived antioxidants，MA)可以緩解敵草快引起的小鼠肝臟和腸道氧化應激，提高空腸養(yǎng)分轉運能力[8]，緩解肝臟內質網應激[9]。因此，本試驗旨在探究DSS處理小鼠是否會發(fā)生肝臟損傷以及MA的緩解作用，為腸道炎癥疾病及其肝臟損傷的治療提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選擇48只6周齡C57BL/6J雄性小鼠，預飼養(yǎng)1周后，隨機分為4組，每組12只。對照組和DSS組每天每只小鼠灌胃0.020 mL/g BW的生理鹽水，低劑量MA組(LMA組)每天每只小鼠灌胃0.002 mL/g BW的MA，高劑量MA組(HMA組)每天每只小鼠灌胃0.003 mL/g BW的MA。對照組每天飲用雙蒸水；其余各組1～7 d飲用雙蒸水，8～14 d飲用含3% DSS的雙蒸水。試驗期14 d。小鼠飼養(yǎng)于25 cm×40 cm加不銹鋼蓋的塑料籠盒中，溫度控制在20～25 ℃，相對濕度為50%～60%，光照和黑暗各占12 h，自由飲水，自由采食。試驗期結束后1 d將小鼠脫頸處死，解剖后取出肝臟，去除結締組織，用預冷生理鹽水沖洗后裝入凍存管，在液氮中速凍之后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗材料

6周齡C57BL/6J雄性小鼠(18～22 g)購于常州卡文斯實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(蘇)2016-0010。小鼠基礎飼糧購于江蘇協(xié)同生物有限公司，其營養(yǎng)水平見表1。DSS購自美國MP Biomedicals公司；MA(商品名KB-120)由上海江翰生物科技有限公司提供，是以沙棘、刺梨果實為原料，經枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、酵母菌等益菌發(fā)酵，經提取、濃縮、滅活、凍干等固液復合發(fā)酵處理而成，含有微生素C、維生素E、異黃酮、谷胱甘肽(GSH，glutathione)、超氧化物歧化酶(SOD)和多種微量元素的金屬衍生物，MA可清除組織過量ROS，提高小鼠血清中免疫球蛋白A(IgA)含量，提高脾臟淋巴細胞轉化率，促進脾臟和胸腺發(fā)育。過氧化氫(H2O2)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、GSH含量和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)及總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)、谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)活性檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。Trizol購于美國Invitrogen公司。反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)和熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)購自日本TaKaRa公司。線粒體提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)購自北京雷根生物技術有限公司。

表1 基礎飼糧營養(yǎng)水平(飼喂基礎)

1.3 肝臟組織形態(tài)觀察

取新鮮肝臟組織轉移到4%的多聚甲醛中，通過脫水、石蠟包埋、蘇木精-伊紅(HE)染色并封片之后，光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.4 氧化應激指標及AST、ALT活性測定

取凍存的肝臟組織稱重后，按1∶9比例加入生理鹽水，冰上勻漿，4 000 r/min離心20 min，取上清液進行相關指標測定。依據(jù)試劑盒說明書測定H2O2、MDA、GSH含量T-AOC及T-SOD、GSH-Px、AST和ALT活性。

1.5 線粒體膜電位測定

取凍存的肝臟組織200 mg，加入預冷裂解緩沖液(lysis buffer)冰上勻漿，按照試劑盒步驟提取出線粒體。取100 μL純化的線粒體與900 μL JC-1染色工作液混合，取200 μL轉移到96孔板于熒光酶標儀下讀數(shù)，檢測JC-1單體激發(fā)光設置為490 nm，發(fā)射光設置為590 nm；檢測JC-1聚合體激發(fā)光設置為525 nm，發(fā)射光設置為590 nm，2次讀數(shù)比值為線粒體膜電位。取20 μL轉移至玻板于熒光顯微鏡下觀察，設置綠色熒光蛋白(GFP，標記綠色熒光)觀察JC-1單體，設置Cy5(標記紅色熒光)觀察JC-1聚合物。

1.6 實時熒光定量PCR

檢測肝臟組織相關基因[含pyrin結構域NOD樣受體家族蛋白3(NLRP3)、白細胞介素-18(IL-18)、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)、半胱天冬蛋白酶-1(Caspase-1)、白細胞介素-1β(IL-1β)、端粒酶逆轉錄酶(Tert)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細胞外調節(jié)蛋白激酶(PERK)、活化轉錄因子6(ATF6)、肌醇依賴性激酶1(IRE1)和葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)]表達：將肝臟組織在液氮中研磨后使用Trizol法提取RNA，并用Nanodrop測定RNA濃度，按照PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)說明書進行，首先去除基因組DNA，反應條件為42 ℃ 2 min，4 ℃ 30 s。將RNA逆轉錄為cDNA，反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 30 s。設計引物序列并委托Invitrogen公司合成。引物序列見表2。以cDNA為模板，根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)試劑盒進行實時熒光定量PCR反應，反應條件：預變性，95 ℃ 30 s；PCR反應，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s；熔解曲線，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，循環(huán)40次。實時熒光定量PCR結果以β-肌動蛋白(β-actin)作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算待測樣品的相對表達量。

表2 引物序列

1.7 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法統(tǒng)計組間差異，結果以均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 肝臟組織切片HE染色

如圖1所示，DSS組小鼠的肝小葉中央?yún)R管區(qū)炎性細胞浸潤，肝細胞發(fā)生脂肪變性；HMA組的DSS誘導結腸炎發(fā)生的肝臟病理變化明顯改善。這表明MA緩解了DSS引起的肝臟組織損傷。

圖1 對照組(A)、DSS組(B)、LMA組(C)和

2.2 肝臟組織氧化應激指標

如表3所示，與對照組相比，DSS組H2O2、MDA含量極顯著升高(P<0.01)，T-SOD、GSH-Px活性和GSH含量及T-AOC顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與DSS組相比，LMA組H2O2含量顯著降低(P<0.05)，T-AOC和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)；HMA組H2O2、MDA含量顯著降低(P<0.05)，T-SOD、GSH-Px活性和GSH含量及T-AOC顯著升高(P<0.05)。這表明DSS誘導肝臟組織發(fā)生氧化應激，MA清除肝臟組織過量ROS，提高肝臟組織抗氧化能力。

表3 肝臟組織氧化應激指標

2.3 肝臟AST和ALT活性

如圖2所示，與對照組相比，DSS組AST和ALT活性降低，但差異不顯著(P>0.05)。與DSS組相比，LMA組和HMA組AST和ALT活性沒有顯著差異(P>0.05)。這表明DSS未造成肝臟AST和ALT活性下降。

數(shù)據(jù)柱標*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，標#表示與DSS組相比差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.4 肝臟線粒體膜電位

如圖3所示，與對照組相比，DSS組綠色熒光強度明顯增強，且觀察不到紅色熒光；MA處理后綠色熒光強度明顯減弱，紅色熒光強度明顯增強。與對照組相比，DSS組線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)；與DSS組相比，LMA組和HMA組線粒體膜電位顯著升高(P<0.05)。這表明MA緩解DSS引起的肝臟線粒體膜電位下降。

A、B、C、D：GFP熒光圖；E、F、G、H：Cy5熒光圖。

2.5 GRP78、ATF6、IRE1、PERK、Tert mRNA表達

如圖4所示，與對照組相比，DSS組GRP78、ATF6、IRE1、PERK、TertmRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。與DSS組相比，LMA組IRE1、TertmRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，GRP78、ATF6、PERKmRNA相對表達量沒有顯著差異(P>0.05)；HMA組GRP78 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，IRE1 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，ATF6、PERKmRNA相對表達量沒有顯著差異(P>0.05)。這表明MA緩解DSS引起的肝臟內質網應激。

GRP78：葡萄糖調節(jié)蛋白78 glucose regulated protein 78；ATF6：活化轉錄因子6 activating transcription factor 6；IRE1：肌醇依賴性激酶1 inositol requiring enzyme 1；PERK：細胞外調節(jié)蛋白激酶 extracellular regulated protein kinases；Tert：端粒酶逆轉錄酶 telomerase reverse transcriptase。

2.6 TNF-α mRNA表達

如圖5所示，與對照組相比，DSS組TNF-α mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。與DSS組相比，LMA組和HMA組TNF-α mRNA相對表達量沒有顯著差異(P>0.05)。這表明DSS誘發(fā)肝臟發(fā)生炎癥，MA對DSS處理后肝臟TNF-α mRNA表達沒有顯著影響。

圖5 肝臟TNF-α mRNA表達

2.7 NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18和IL-1β mRNA表達

如圖6所示，與對照組相比，DSS組ASC、Caspase-1、IL-1βmRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，NLRP3、IL-18 mRNA相對表達量沒有顯著差異(P>0.05)。與DSS組相比，LMA組Caspase-1、IL-1βmRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，HMA組ASC、Caspase-1、IL-1βmRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。這表明NLRP3相關基因參與調控MA緩解DSS引起的肝臟炎癥。

NLRP3：Nod樣受體家族含pyrin結構域蛋白3 Nod-like receptor family pyrin domain-containing protein 3；ASC：凋亡相關斑點樣蛋白 apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD；Caspase-1：半胱天冬蛋白酶-1 cysteine aspartatespecific proteinase-1；IL-18：白細胞介素-18 interleukin-18；IL-1β：白細胞介素-1β interleukin-1β。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，DSS處理后小鼠肝臟H2O2和MDA含量極顯著升高，肝臟T-SOD、GSH-Px活性和GSH含量及T-AOC顯著或極顯著降低，表明肝臟產生過量自由基發(fā)生氧化應激，組織抗氧化能力下降。線粒體功能是細胞健康的重要指標，是評估線粒體功能的指標之一，線粒體膜電位越高，促進細胞能量轉換越強[10]，在各種凋亡信號的誘導下，線粒體會發(fā)生顯著的結構與功能性的變化，比如線粒體膜電位的丟失、電子傳遞鏈的變化以及細胞內氧化還原狀態(tài)的變化[11]。本試驗中，DSS處理后，肝臟線粒體膜電位顯著降低，表明肝臟細胞處于凋亡早期。氧化應激是導致肝功能異常變化的原因之一[12]，當肝細胞受損，會釋放AST、ALT進入血液循環(huán)[13]，AST主要存在于線粒體中，肝細胞壞死嚴重時，AST活性才會明顯變化，ALT絕大多數(shù)存在于細胞質中[14]。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，DSS處理后，肝臟AST和ALT活性雖然有下降趨勢但差異不顯著，仍說明肝臟有部分AST和ALT釋放。GPR78是發(fā)生內質網應激的標志性蛋白，當內質網處于應激狀態(tài)時，大量未折疊或錯誤折疊蛋白堆積于內質網腔中，GRP78與ATF-6和PERK感應蛋白解離，轉而與未折疊蛋白結合[15]，IRE1可被未折疊蛋白直接激活[16]，導致其相對表達量升高；Tert表達是檢測肝臟組織內端粒酶活性的重要指標，端粒酶活性及TertmRNA相對表達量與細胞壞死凋亡具有相關性[17]。在本試驗中，DSS處理后，GRP78、ATF6、IRE1、PERK、TertmRNA相對表達量顯著升高，肝臟組織出現(xiàn)炎性細胞浸潤和脂肪變性，炎性因子IL-1β和TNF-α mRNA表達量顯著上升，表明肝臟發(fā)生內質網應激并有早期凋亡、炎癥和組織損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，MA處理后，LMA組和HMA組肝臟H2O2含量顯著下降，HMA組肝臟MDA含量顯著下降，LMA組和HMA組肝臟T-AOC和GSH-Px活性顯著升高，HMA組肝臟T-SOD活性和GSH含量也顯著升高，這一結果與報道中花青素等抗氧化劑可以有效降低肝臟中H2O2和MDA含量的結果[18-19]一致。MA處理后，LMA組和HMA組肝臟線粒體膜電位顯著升高，表明MA能夠有效改善細胞凋亡。HMA處理后，HMA組肝臟GRP78 mRNA相對表達量顯著降低，LMA組和HMA組肝臟IRE1 mRNA相對表達量顯著升高，可能是在內質網應激時短期活化IRE1可剪切X盒結合蛋白-1(X-box binding protein 1，XBP-1)mRNA來促進細胞生存[20]，小鼠肝臟炎性細胞浸潤和脂肪變性有明顯改善；LMA組和HMA組肝臟IL-1βmRNA相對表達量顯著下降，表明MA可以緩解肝臟內質網應激、炎癥反應和組織損傷，出現(xiàn)一定的劑量依賴性。

本研究發(fā)現(xiàn)，DSS處理后，小鼠肝臟ASC、Caspase-1、IL-1βmRNA相對表達量顯著升高，表明NLRP3炎性小體參與了肝臟炎癥調控。MA處理后，LMA組和HMA組肝臟Caspase-1、IL-1βmRNA相對表達量顯著降低，HMA組肝臟ASCmRNA相對表達量顯著降低。有報道發(fā)現(xiàn)，NLRP3基因表達后小鼠IBD的病死率顯著提高[21]，當腸道屏障受損腸肝軸[22]會放大腸道與肝臟Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)之間的關聯(lián)信號[23]，導致肝臟損傷，白細胞介素受體相關激酶(interleukin receptor associated kinase，IRAK)會繞過引發(fā)過程，并將TLRs快速連接到NLRP3炎性小體使其被激活[24]，DSS在肝臟枯否氏細胞分布，DSS可以通過巨噬細胞上的TLRs誘導炎癥[25]，從而進一步促進肝病的發(fā)展。

4 結 論

綜上所述，DSS誘發(fā)了小鼠肝臟組織損傷、氧化應激、內質網應激、膜電位下降和炎癥反應，MA對此有明顯的緩解作用，其中高劑量MA的緩解作用更強，并且NLRP3炎性小體參與調控炎癥。