冀旭 孫芳云 趙勤 張曉英 李巖松

【摘 要】 目的：以櫟癭酸為例，研究藏藥有效成分與功能蛋白的相互作用與識別過程。方法：利用熒光發(fā)射光譜、同步熒光、紫外光譜等方法進(jìn)行研究。結(jié)果：結(jié)果顯示櫟癭酸引起了牛血清白蛋白BSA熒光靜態(tài)猝滅;獲得不同溫度下二者的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合過程中熱力學(xué)參數(shù);得知二者結(jié)合是以氫鍵和范德華力為主要作用力的自發(fā)、放熱過程;二者之間發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移，結(jié)合部位位于BSA分子Site Ⅱ位點(diǎn)，平均結(jié)合距離為4.134 nm;在識別過程中，BSA結(jié)構(gòu)及色氨酸所處微環(huán)境疏水性增加，色胺酸殘基流動性增強(qiáng)。結(jié)論：通過本方法可建立一套用于表征藏藥中有效成分與功能蛋白之間相互作用與識別過程的實(shí)驗(yàn)方法。

【關(guān)鍵詞】 藏藥;有效成分;功能蛋白;秦艽;櫟癭酸

【中圖分類號】R917 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2021）12-0054-07

Abstract：Objective Taking Roburic acid as an example，the interaction and recognition process between effective constituents of Tibetan medicine and functional proteins were studied in this paper. Methods Fluorescence emission spectroscopy，synchronous fluorescence，ultraviolet spectroscopy and other methods were used in this study. Result The result showed that，firstly，the binding procedures between Roburic acid and BSA were static quenching process caused by the formation of non-fluorescigenic complex; secondly，both binding constants and binding site numbers of Roburic acid and BSA at different temperatures were determined; thirdly，ΔG，ΔH and ΔS during the binding process can be obtained and all of these parameters were negative，which indicated the binding procedure between Roburic acid and BSA was spontaneous，exothermic reaction taking hydrogen bond and van der waals force as main force; fourthly，“Forster non-radiative energy transfer” was taken place between Roburic acid and BSA，and Roburic acid bound to the Site Ⅱ of BSA while the binding distances was 4.134nm; fifthly，during the recognition procedure，with the increasing concentration of Roburic acid，the hydrophobicity of both BSA structure and the microenvironment of tryptophan in BSA increased，and the tryptophan residues were no longer restricted.Conclusion This study can be used to establish a set of experimental methods to characterize the interaction and recognition process between traditional Tibetan medicine effective constituents and functional protein.

Keywords：Tibetan Medicine; Effective Constituent; Functional Protein; Gentianae macrophyllae Radix; Roburic Acid

在生物學(xué)中，分子間相互作用與識別是形成高度專一性識別、反應(yīng)及調(diào)控等過程的基礎(chǔ)，諸如底物與受體的結(jié)合識別、酶反應(yīng)及抗體-抗原的結(jié)合識別等。而在藥學(xué)，尤其是民族藥的開發(fā)研究領(lǐng)域，分子間相互作用也是一個重要的研究內(nèi)容，它在基于傳統(tǒng)藥物的新藥篩選開發(fā)、藥物藥效學(xué)及藥動學(xué)研究中均得到廣泛應(yīng)用。藏藥在我國有著悠久的應(yīng)用歷史、深厚的民眾基礎(chǔ)及豐富的藏民族文化內(nèi)涵。近年來，藏藥以其獨(dú)特的功效受到越來越多研究者的關(guān)注，對其的現(xiàn)代化研究與應(yīng)用也日益得到重視。而關(guān)于藏藥當(dāng)中有效成分與離子通道、膜蛋白等藥物受體、功能蛋白的相互作用與識別研究還未見報(bào)道。

秦艽為龍膽科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.，麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.，粗莖秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.或小秦艽Gentiana dahurica Fisch.的干燥根[1]，屬于常用藏藥[2-4]，藏文名為吉解嘎保、吉解那保等[5]。該藥物為藏族人民的繁衍生息做出了重要的貢獻(xiàn)，如《四部醫(yī)典》中記載：“吉解嘎保可治六腑熱和膽熱”;《如意寶樹》中記載：“吉解嘎?？芍寡?，炮制后外敷消腫、愈傷。吉解那?？上?，治四肢關(guān)節(jié)紅腫，喉蛾，咽喉嘶啞”;《晶珠本草》中記載：“吉解那可用于消腫、喉蛾、干黃水”等[5]。櫟癭酸為一種五環(huán)三萜類化合物，是2015版《中國藥典》中規(guī)定秦艽藥材的藥材鑒別成分[1]，其藥理臨床作用如抗炎也常見報(bào)道[6]。

本研究以藏藥秦艽為代表，選用秦艽中有效成分櫟癭酸，利用光譜學(xué)方法研究了櫟癭酸與以運(yùn)載蛋白牛血清白蛋白（BSA）為代表的功能蛋白之間的相互作用與識別過程，旨在進(jìn)一步理解傳統(tǒng)藏藥有效成分的作用機(jī)制。并以此為例，建立一套可用于表征其它藏藥有效成分與功能蛋白如受體、離子通道等之間相互作用與識別的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)而為傳統(tǒng)藏藥作用機(jī)制的現(xiàn)代化分析研究，以及基于傳統(tǒng)藏藥的藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論支撐。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 PerkinElmer LS55熒光光譜儀及PTP-1 Peltier system控溫控件，Perkin Elmer Lambda 25紫外-可見分光光度儀器光度計(jì)，Millipore Milli-Q超純水系統(tǒng)。

1.2 主要試劑 櫟癭酸（中國食品藥品檢定研究院，98%），用二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich，≥99.9%）配置成濃度為4.0×10-2 mol/L的儲備溶液。BSA（Amresco，>98%）用0.01mol/L的PBS配置成1×10-6 mol/L的儲備溶液。華法林（中國食品藥品檢定研究院，98%），布洛芬（大連美侖生物技術(shù)有限公司，>98%），實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 熒光猝滅實(shí)驗(yàn) 移取1×10-6 mol/L的BSA溶液 2 mL置于石英比色皿中并分別于288K、298K和308K實(shí)驗(yàn)溫度下測定樣品的熒光發(fā)射光譜。測定完成后，用微量注射器分別向其中注入不同體積的4.0×10-2 mol/L的櫟癭酸儲備液進(jìn)行混合，使得櫟癭酸終濃度分別為5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6 mol/L，混合完成后分別于相應(yīng)溫度下反應(yīng)至穩(wěn)定后再次測定其熒光發(fā)射光譜。相關(guān)儀器參數(shù)如下：激發(fā)波長278 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為3 nm，掃描速度1200 nm/min，掃描范圍300～400 nm。

2.2 結(jié)合位點(diǎn)競爭實(shí)驗(yàn) 移取1×10-6 mol/L的BSA 溶液2 mL置于石英比色皿中，分別注入華法林/布洛芬儲備液，使對應(yīng)藥品終濃度均分別為1×10-6 mol/L，在298 K溫度下進(jìn)行相互作用30 min。反應(yīng)完成后，用微量進(jìn)樣器分別向其中加入不同體積的櫟癭酸儲備液，使得櫟癭酸終濃度分別為5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6 mol/L，混合完成至反應(yīng)穩(wěn)定后再次測定其熒光發(fā)射光譜。相關(guān)儀器參數(shù)如2.1。

2.3 同步熒光 于298K下移取1×10-6 mol/L的BSA 溶液2 mL置于石英比色皿中，測定樣品同步熒光光譜。測定完成后，用微量注射器分別向其中加入不同體積的櫟癭酸儲備液進(jìn)行混合，使得櫟癭酸終濃度分別為5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6 mol/L，反應(yīng)穩(wěn)定后于298 K溫度下分別測定其同步熒光光譜。相關(guān)儀器參數(shù)如下：當(dāng)測定Δλ=60 nm的同步熒光光譜時，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為3 nm。當(dāng)測定Δλ=15 nm的同步熒光光譜時，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為8 nm。掃描速度均為1200 nm/min，掃描范圍220～320 nm。

2.4 Rees紅邊激發(fā)熒光位移的測定 分別在激發(fā)波長為266、272、278、284、290和296 nm下，測定1×10-6 mol/L的BSA溶液在298 K溫度下的熒光發(fā)射光譜，之后在BSA溶液中分別加入不同體積的櫟癭酸儲備液，使得櫟癭酸終濃度分別為0×10-6、5×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6 mol/L，并測定其在不同激發(fā)波長下對應(yīng)熒光發(fā)射光譜。相關(guān)儀器參數(shù)如下：激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為3 nm，掃描速度1200 nm/min，掃描范圍300～400 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 BSA與櫟癭酸結(jié)合過程的熒光發(fā)射光譜分析 圖1所示為BSA與櫟癭酸在298 K溫度下作用過程的熒光發(fā)射光譜，可以看出，伴隨著櫟癭酸濃度的上升，樣品體系發(fā)生了熒光猝滅現(xiàn)象，熒光強(qiáng)度由754.3下降至487.9，同時最大熒光發(fā)射峰位從341 nm輕微的藍(lán)移至335.5 nm。這一現(xiàn)象表明BSA與櫟癭酸之間發(fā)生了相互作用，熒光發(fā)射峰位輕微藍(lán)移表明蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了細(xì)微的改變，蛋白結(jié)構(gòu)的疏水性有了輕微的增加[7]。

3.7 BSA與櫟癭酸識別過程的構(gòu)象變化-同步熒光光譜光譜分析

圖5展示了BSA在與櫟癭酸結(jié)合過程中當(dāng)Δλ=60nm和Δλ=15nm的同步熒光光譜。從圖中可以看出，伴隨著加入的櫟癭酸濃度的增加，BSA在Δλ=60nm和Δλ=15nm時的同步熒光強(qiáng)度均發(fā)生了明顯改變，說明BSA分子中的酪氨酸、色氨酸殘基均參與了熒光猝滅過程，其中對色氨酸的猝滅效果更為明顯。同時我們注意到，伴隨著櫟癭酸濃度的增加，Δλ=15 nm時的同步熒光光譜的最大發(fā)射峰位并未發(fā)生明顯的改變，而當(dāng)Δλ=60 nm的同步熒光光譜則顯示出輕微藍(lán)移現(xiàn)象，說明在BSA與櫟癭酸的結(jié)合過程中，蛋白中酪氨酸殘基所處的微環(huán)境微環(huán)境沒有明顯的改變，而色氨酸殘基所處的微環(huán)境微環(huán)境疏水性略微增強(qiáng)。

3.8 BSA與櫟癭酸識別過程的構(gòu)象變化—紅邊激發(fā)位移（REES）分析 紅邊激發(fā)位移是指當(dāng)溶劑介質(zhì)存在緩慢舒張作用時，色氨酸中吲哚環(huán)與臨近偶極子的電子結(jié)合作用即可引起色氨酸電子躍遷能分配的一種現(xiàn)象，是一種監(jiān)測熒光發(fā)色基團(tuán)微環(huán)境改變的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)受到激發(fā)光照射時，若蛋白質(zhì)中色氨酸殘基所處微環(huán)境是流動的，則其在發(fā)射熒光之前就已經(jīng)出現(xiàn)了緩慢舒張作用，此時色氨酸殘基產(chǎn)生的熒光光譜的發(fā)射波長不發(fā)生變化。如果色氨酸殘基處在受限環(huán)境當(dāng)中，色氨酸中處于激發(fā)態(tài)的吲哚環(huán)將會產(chǎn)生緩慢舒張作用，并且激發(fā)波長不同，其發(fā)射波長也不同[18-19]。

在實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，在266 nm的激發(fā)波長下，BSA熒光發(fā)射光譜的最大發(fā)射波長位于346 nm，所以選取326（FL）和366（FR）這兩個等波長點(diǎn)進(jìn)行雙波長處理。由圖6可見，在相同激發(fā)波長下，BSA的FL/FR值伴隨著櫟癭酸濃度的增大而上升，說明伴隨著BSA與櫟癭酸反應(yīng)的進(jìn)行，熒光發(fā)射光譜發(fā)生藍(lán)移[18]，這也從另一方面驗(yàn)證“3.1”中得到的結(jié)果，即說明BSA結(jié)構(gòu)的疏水性伴隨著反應(yīng)的進(jìn)行而有所增加。

當(dāng)櫟癭酸濃度分別為0×10-6、5×10-6、15×10-6 mol/L時，隨著激發(fā)波長的逐漸增大，BSA的FL/FR值緩慢降低，產(chǎn)生了Rees現(xiàn)象，說明在上述情況下，BSA中色氨酸殘基的運(yùn)動受到限制。然而，隨著體系中櫟癭酸濃度的擴(kuò)大，當(dāng)櫟癭酸濃度分別為20×10-6、25×10-6mol/L時，BSA的FL/FR值不再隨著激發(fā)波長的增大而明顯降低，即不再產(chǎn)生Rees現(xiàn)象，說明伴隨著櫟癭酸濃度的升高，由于BSA構(gòu)象的改變，分子中色氨酸殘基處于了相對流動的微環(huán)境當(dāng)中。

4 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)一種全面表征傳統(tǒng)藏藥中有效成分與功能蛋白相互作用與識別過程的實(shí)驗(yàn)方法。本研究以藏藥秦艽中有效成分櫟癭酸以及運(yùn)載蛋白為例，在不同溫度下利用本方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：櫟癭酸與BSA二者之間發(fā)生的結(jié)合作用引起了BSA內(nèi)源熒光猝滅，造成的猝滅現(xiàn)象為形成了不發(fā)熒光絡(luò)合物的靜態(tài)猝滅過程。通過測量可獲得二者在不同溫度下結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及結(jié)合過程中相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)，并得知二者相互結(jié)合是以氫鍵和范德華力為主要作用力的自發(fā)、放熱反應(yīng)過程。同時，二者結(jié)合過程中發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移，且櫟癭酸結(jié)合于BSA分子中的Site Ⅱ位點(diǎn)，平均結(jié)合距離為4.134 nm。另外，在二者識別過程中，BSA結(jié)構(gòu)的疏水性有輕微的增加，而且伴隨著櫟癭酸濃度的增加，BSA中色氨酸所處微環(huán)境疏水性有了輕微增加，微環(huán)境流動性逐步增強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會. 中國藥典（一部）[M]. 北京： 化學(xué)工業(yè)出版社，2015：270.

[2] 高小敏，徐雅，劉杜霞，等. 藏藥麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴活性成分與作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究 [J]. 中草藥，2021，52 （1）： 186-195.

[3] 張景瑜，門連超，吳曉軍，等. 抗高原缺氧藏藥的研究進(jìn)展 [J]. 中國民族民間醫(yī)藥，2017，26 （22）： 42-45.

[4] 趙勤，王樂樂，魏立鵬，等. 麻花秦艽醇提物對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的影響 [J]. 中藥藥理與臨床，2015，31 （1）：145-147.

[5] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會. 中華本草藏藥卷[M]. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002： 57，312.

[6] CHEN Y，JI N，PAN S，et al. Roburic Acid Suppresses NO and IL-6 Production via Targeting NF-κB and MAPK Pathway in RAW264.7 Cells [J]. Inflammation，2017（40）： 1959-1966.

[7] BURSTEIN E A，VEDENKINA N S，IVKOVA M N. Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules [J]. Photochemistry and photobiology，1973，18 （4）： 263-279.

[8] WARE W R. Oxygen quenching of fluorescence in solution： an experimental study of the diffusion process [J]. The Journal of Physical Chemistry，1962，66 （3）： 455-458.

[9] LAKOWICZ J R，WEBER G. Quenching of fluorescence by oxygen. A probe for structural fluctuations in macromolecules [J]. Biochemistry，1973（12）： 4161-4170.

[10] FENG X Z，LIN Z，YANG L J，et al. Investigation of the interaction between acridine orange and bovine serum albumin [J]. Talanta，1998，47 （5）： 1223-1229.

[11] ROSS P D，SUBRAMANIAN S. Thermodynamic of protein association reactions： forces contributing to stability [J]. Biochemistry，1981（20）： 3096-3102.

[12] ABOU-ZIED O K，AL-SHIHI O I K. Characterization of subdomain IIA binding site of human serum albumin in its native，unfolded，and refolded states using small molecular probes [J]. Journal of the American Chemical Society，2008，130 （22）： 10793-10801.

[13] REMEDIOS C G D，MOENS P D J. Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy Is a Reliable "Ruler" for Measuring Structural Changes in Proteins Dispelling the Problem of the Unknown Orientation Factor [J]. Journal of structural biology，1995，115 （2）： 175-185.

[14] FORSTER T. Modern Quantum Chemistry，Vol. 3 [M]. New York： Academic Press，1996： 93.

[15] ZHAO X N，LIU Y，NIU L Y，et al. Spectroscopic studies on the interaction of bovine serum albumin with surfactants and apigenin [J]. Spectrochimica Acta Part A： Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2012（94）： 357-364.

[16] SUDLOW G，BIRKETT D J，WADE D N. The Characterization of Two Specific Drug Binding Sites on Human Serum Albumin [J]. Mol. Pharmacol，1975（11）： 824-832.

[17] YAN J，WANG Q，PAN Q，et al.. Assessment of the interaction between fraxinellone and bovine serum albumin by optical spectroscopy and molecular modeling methods [J]. Journal of Luminescence，2014（137）： 180-185.

[18] 張懷敬，何華，李杉杉，等. 不同代PAMAM樹狀大分子與牛血清白蛋白的相互作用研究 [J]. 化學(xué)學(xué)報(bào)，2010，68 （17）： 1741-1748.

[19] WANG Y，ZHANG H，CAO J，et al. Interaction of methotrexate with trypsin analyzed by spectroscopic and molecular modeling methods [J]. Journal of Molecular Structure，2013（1051）： 78-85.

（收稿日期：2021-02-26 編輯：程鵬飛）