李亮亮，孫樂天，張 卓，衛(wèi)澤珍

（太原動物園，太原 030009）

大鯢（Andrias davidanus）俗稱娃娃魚，屬于兩棲綱脊索動物門有尾目隱鰓鯢科大鯢屬，是現(xiàn)存最大的兩棲動物，體長1 m左右，最長可達2 m，體重20～25 kg[1]，為國家重點Ⅱ級保護野生動物，世界自然保護聯(lián)盟（International union for conserva?tion of nature，ICUN）紅色名錄中為極危級（CR級），具有重要的研究價值。近年來由于環(huán)境等原因造成野生大鯢的數(shù)量急劇減少[2]。

大鯢虹彩病毒（Andrias davidianusiridovirus,ADIV）屬于蛙病毒屬（Ranavirus）成員，為雙股DNA病毒。感染該病毒后發(fā)病速度快、傳染性極強，幼鯢病發(fā)致死率可高達100%，成鯢死亡率亦在90%以上，在陜西[3-4]、貴州[5]報道發(fā)生過大鯢虹彩病毒感染，并且造成大鯢大量死亡，目前尚無有效的治療方法[6]。2017年9月—11月份，山西某地飼養(yǎng)的大鯢陸續(xù)有7只死亡，體表和四肢可見多處潰爛、充血及出血。解剖可見肝臟腫脹、脾臟上有針尖狀的白點，腸道上有彌漫性出血。經(jīng)實驗室檢測，診斷為嗜水氣單胞菌和大鯢虹彩病毒混合感染。通過有效的防治措施，大鯢病情得到有效控制?，F(xiàn)將診治過程報道如下。

1 病料的采集及相關(guān)耗材

1.1 病料的采集

病料采集于山西省某單位。大鯢死亡后立即采集病料，放于自封袋內(nèi)，置于-20℃冰箱中凍存。

1.2 主要試劑

常規(guī)藥敏紙片，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；DNA Marker、Ex Taq，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；基因組提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器

PCR儀，美國MJ公司產(chǎn)品；多用途電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品，DYY-12型凝膠成像分析系統(tǒng)，美國UVP公司產(chǎn)品。

1.4 引物的合成

根據(jù)虹彩病毒主要核衣殼蛋白（MCP）基因序列設(shè)物，引物序列為如下，F(xiàn)：5'-GACTTGGCCACT?TATGAC-3'，R：5'-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3'，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

2 實驗室檢測

2.1 細菌分離培養(yǎng)及染色鏡檢

無菌條件下采集肝臟組織，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和血平板培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)24 h，然后挑取單個菌落進行革蘭染色及鏡檢；另外，挑取單個菌落劃線進行純化培養(yǎng)。

在普通營養(yǎng)瓊脂平板上，菌落呈淡黃色、邊緣整齊、微凸、圓形。

經(jīng)革蘭氏染色后，在鏡下觀察，可見菌落為革蘭氏陰性，形狀呈短桿狀，略呈弧狀，兩端鈍圓，單個分散排列。

2.2 藥敏試驗

采用紙片擴散法進行藥敏試驗，藥敏結(jié)果以抑菌圈直徑（mm）作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。選擇10種常規(guī)藥敏紙片法測定抗菌素對分離菌株的抗藥譜，接種分離菌株，然后將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。

分離菌株對10種藥物的敏感性試驗結(jié)果見表1。由表1可知，該菌株對頭孢曲松鈉、恩諾沙星敏感，對阿米卡星和復(fù)方新諾明中度敏感，對青霉素、慶大霉素、氟苯尼考、卡那霉素、氨芐西林和阿莫西林具有耐藥性。

表1 藥敏試驗結(jié)果

2.3 細菌生化試驗

挑取普通營養(yǎng)瓊脂平板上可疑的菌落，再接種到普通營養(yǎng)瓊脂平板上，置于培養(yǎng)箱中37℃，培養(yǎng)24 h后，挑取2個菌落到2 mL 0.9%的生理鹽水中，制成McFarland（麥?zhǔn)媳葷岱ǎ?.5濁度的菌懸液，再用滅菌管接種到生化發(fā)酵管內(nèi)，石蠟封口。于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，24 h后進行判定。

生化試驗結(jié)果見表2。由表2可知，分離的細菌能夠使葡萄糖產(chǎn)氣，發(fā)酵甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、水楊苷，不能發(fā)酵乳糖和肌醇，水解七葉苷，吲哚試驗為陽性，V-P試驗為陽性，鳥氨酸脫羧為陰性。與第8版《伯杰氏細菌鑒定手冊》對照，符合的嗜水氣單胞菌生化鑒定特征。

表2 生化鑒定結(jié)果

2.4 PCR檢測

稱取病死大鯢的肝臟組織1 g，利用基因組DNA提取試劑盒提取DNA。預(yù)期擴增片段大小為510 bp。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，包括10 μmol·L-1的上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，Mix 8 μL，去離子水10 μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

從患病大鯢肝臟組織提取的基因組中均擴增出約510 bp的DNA片段，見圖1，與預(yù)期結(jié)果一致。將擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司測序，將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列和GenBank中虹彩病毒的主要核衣殼蛋白編碼基因有高度同源性，核苷酸相似性達98%，確定患病大鯢感染虹彩病毒。

圖1 PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

3 診斷

根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、解剖結(jié)果和實驗室檢測，確斷患病大鯢為嗜水氣單胞菌和大鯢虹彩病毒混合感染。

4 防治措施

用聚維酮碘對飼養(yǎng)環(huán)境和用具進行徹底的消毒?；疾〈篥F進行單獨隔離飼養(yǎng)，肌肉注射頭孢曲松鈉進行治療。

對未發(fā)現(xiàn)癥狀的大鯢進行預(yù)防：首先使用1‰高錳酸鉀或2%聚維酮碘浸泡30 min，然后再加入黃芪多糖、維生素C、頭孢曲松鈉、電解多維進行浸泡。對投喂的泥鰍用2%聚維酮碘浸泡30 min，沖洗干凈后再投喂。經(jīng)過上述方法預(yù)防后，病情達到有效的控制。

5 討論

嗜水氣單胞菌廣泛存在于自然界的水域中[7]，是一種條件性致病菌，引起魚類及其他水產(chǎn)動物發(fā)病的一種重要的致病菌[8-11]。當(dāng)環(huán)境溫度過高時，容易使水體內(nèi)營養(yǎng)成分過剩，造成水體污染，嗜水氣單胞菌會大量的繁殖，由于環(huán)境的惡化造成，動物機體抵抗力下降，從而造成嗜水氣單胞菌入侵機體引發(fā)動物感染[12]。同時當(dāng)飼養(yǎng)密度過大、養(yǎng)殖水體循環(huán)緩慢，從而為嗜水氣單胞菌的增殖和感染提供了有利條件。

已經(jīng)有多名研究者相繼報道了大鯢感染蛙虹彩病毒和（或）嗜水氣單胞菌[3-4]，對大鯢的養(yǎng)殖場造成很大的危害。大鯢虹彩病毒感染后死亡率達90%以上，并且還沒商品化的疫苗可以使用[6]。因此在日常生活中加強飼養(yǎng)管理，做好餌料的消毒和新引入大鯢的隔離檢疫工作。

同時需要建立大鯢疾病的快速診斷技術(shù)，來指導(dǎo)臨床上的疾病治療。在本例病例上，細菌的鑒定采用了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定和生化試驗相結(jié)合的方法，同時進行藥敏試驗來為臨床治療工作提供指導(dǎo)。使用了PCR技術(shù)對大鯢虹彩病毒進行了檢測，該方法操作簡單、成本低廉，敏感性高，結(jié)果準(zhǔn)確，容易推廣。鑒于該病的傳染性強、死亡率高，可以對新引入的大鯢，利用PCR技術(shù)進行檢測，虹彩病毒確定為陰性后方可混養(yǎng)。