方明霞 董藝超 成子安 范雨萱 陳昱圻 高建恩 郭昌龍 馬 旭*

1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院(100730)；2.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)具有組織修復(fù)和免疫調(diào)控的作用：在炎癥環(huán)境中能夠有效的抑制T、B淋巴細(xì)胞的增殖，增加Treg細(xì)胞的含量；在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，能夠分化成骨、軟骨、脂肪等多種細(xì)胞，目前被廣泛的應(yīng)用于組織損傷修復(fù)、自身免疫性疾病的治療[1]。P38 MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的主要信號(hào)通路之一，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、炎癥、壓力刺激、凋亡等多種病理生理過程，是促炎性細(xì)胞因子合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)途徑[2]。本研究利用P38 MAPK通路抑制劑SB202190抑制臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSC)的P38 MAPK通路，觀察該通路抑制對UC-MSC形態(tài)、表型以及分化能力的影響，進(jìn)一步評價(jià)P38 MAPK通路抑制的UC-MSC促進(jìn)糖尿病大鼠背部皮損修復(fù)的能力。

1 材料和方法

1.1 材料

第3代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞購自中盛溯源公司；SPF級(jí)7周齡ZDF雌性大鼠購自北京維通利華公司；DMEM-F12培養(yǎng)液、胎牛血清、雙抗、PBS、0.25% Trypsin購自美國Gibco公司，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化試劑盒購自Cyagen公司，小分子化合物SB202190購自MCE公司，流式檢測所用抗體CD14、CD19、CD31、CD73、CD105、CD44、CD90、CD34、CD45、CD146、HLA-DR購自Biolegend公司；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自康寧公司，血糖儀、血糖試紙(1835960)購自穩(wěn)捷公司；離心機(jī)購自湘儀公司，流式細(xì)胞儀采用BD Biosciences FACS Calibur。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1UC-MSC的復(fù)蘇培養(yǎng)與鑒定取第3代UC-MSC復(fù)蘇后，接種于含10%FBS+1%Anti-anti+DMEM /F12的培養(yǎng)瓶中于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2UC-MSC的小分子化合物處理UC-MSC在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第5代，0.25% Trypsin消化后接種于完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)至融合度達(dá)80%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組換用含8μM濃度小分子化合物SB202190的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)處理48h后，收集兩組細(xì)胞，流式檢測細(xì)胞表面CD14、CD19、CD31、CD73、CD105、CD44、CD90、CD34、CD45、CD146、HLA-DR的表達(dá)，同時(shí)進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.3多組學(xué)測序收集上述兩組細(xì)胞樣本送至北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序、小RNA測序。KEGG、GO富集分析各組學(xué)檢測結(jié)果，篩選實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1構(gòu)建糖尿病大鼠模型從北京維通利華公司購入7周齡ZDF雌性大鼠，常規(guī)飼料喂養(yǎng)1周后換用高脂飼料(上海雍利)喂養(yǎng)，室內(nèi)保持12h晝夜節(jié)律，溫度(25±2)℃，自由攝食、飲水，每周檢測大鼠血糖值、記錄體重變化，至空腹血糖值穩(wěn)定維持在11.1 mmol/L以上，以成功構(gòu)建糖尿病大鼠模型。

1.3.2創(chuàng)傷修復(fù)對建模成功的糖尿病大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組：PBS干預(yù)組、UC-MSC干預(yù)組、P38 MAPK通路抑制的UC-MSC干預(yù)組，于各組大鼠背部開創(chuàng)1.5cm×1.5cm的正方形傷口，分別于傷口四邊皮下定點(diǎn)注射200μl PBS、200μl PBS重懸的1×106UC-MSCs、200μl PBS重懸的1×106P38 MAPK通路抑制的UC-MSCs，隔天測量大鼠背部傷口面積，繪制傷口愈合曲線。

1.3.3免疫組化糖尿病大鼠背部傷口愈合率≥90%時(shí)取背部愈合組織，制備3μm厚的石蠟切片，分別用苯胺藍(lán)染液、天狼星紅染液對切片進(jìn)行馬松染色和天狼星紅染色，觀察各組大鼠背部愈合組織的膠原沉積情況。

2 結(jié)果

2.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞干性鑒定

顯微鏡下UC-MSC和P38 MAPK抑制-UC-MSC在生長過程中均呈現(xiàn)典型的MSC形態(tài)，即長梭形(圖1)(1077頁)，細(xì)胞倍增時(shí)間為36h，證明P38 MAPK抑制劑處理不會(huì)造成UC-MSC細(xì)胞形態(tài)以及擴(kuò)增周期的改變；成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中UC-MSC以及P38 MAPK抑制-UC-MSC在誘導(dǎo)分化的第21天經(jīng)油紅O染色于鏡下均可觀察到大量透亮且圓的脂滴(圖2)(1077頁)；流式細(xì)胞術(shù)檢測UC-MSC和P38 MAPK抑制-UC-MSC表面標(biāo)志物表達(dá)情況，陽性標(biāo)志物占比均>95%;陰性標(biāo)志物占比均<2%(表1)，符合國際細(xì)胞療法協(xié)會(huì)(ISCT)定義的MSC三陽五陰的標(biāo)準(zhǔn)，即≥95%的細(xì)胞表達(dá)CD105、CD73、CD90，且表達(dá)CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR的細(xì)胞≤2%。

表1 兩組細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測結(jié)果 (%)

2.2 多組學(xué)測序

通過KEGG功能注釋、GO富集分析P38 MAPK抑制-UC-MSC與UC-MSC的轉(zhuǎn)錄組測序、小RNA測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)P38 MAPK通路抑制的UC-MSC與未處理的UC-MSC存在大量差異表達(dá)的基因(圖3，4)(1077、1078頁)。隨著DUSP8、FST、ITGB8等基因表達(dá)的增強(qiáng)，與之對應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)通路TGF-β signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway等也發(fā)生上調(diào)。另外，生物信息學(xué)聯(lián)合分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)P38 MAPK通路抑制的UC-MSC中PAI-1的表達(dá)增強(qiáng)(圖5)(1078頁)，提示對應(yīng)的下游與表皮損傷愈合有關(guān)的VEGF signaling pathway發(fā)生上調(diào)。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

于糖尿病大鼠背部損傷部位進(jìn)行皮下干預(yù)，隔天測量大鼠背部傷口面積，在第3天經(jīng)計(jì)算得到到P38 MAPK抑制-UC-MSC干預(yù)組糖尿病大鼠背部損傷皮膚愈合率29.9%，高于UC-MSC干預(yù)組的15.9%以及PBS對照組2.4%(圖6)(1079頁)；至第15天可肉眼觀察到P38 MAPK抑制-UC-MSC干預(yù)組糖尿病大鼠背部皮損的愈合較另兩組好，經(jīng)測量皮損愈合率均已達(dá)90%，傷口愈合組織馬松染色及天狼星紅染色可觀察到P38 MAPK抑制-UC-MSC干預(yù)組傷口部位膠原形成情況較UC-MSC干預(yù)組以及PBS對照組好(圖6)(1079頁)，綜合各組大鼠背部傷口愈合情況、免疫組化結(jié)果以及愈合曲線(圖7)(1079頁)可知P38 MAPK通路抑制的UC-MSC促進(jìn)組織修復(fù)的效果得到增強(qiáng)。

3 討論

UC-MSC的組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)的功能對于多種疾病的治療及其研究都具有實(shí)際意義，同時(shí)UC-MSC易獲取的特點(diǎn)使其成為再生領(lǐng)域的首要候選細(xì)胞，已有研究顯示MSC可直接或間接促進(jìn)表皮傷口愈合，涉及到的機(jī)制：①直接分化和替換丟失的組織成分；②將宿主細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和祖細(xì)胞)募集到受傷部位調(diào)節(jié)局部修復(fù)反應(yīng)；③通過減弱免疫效應(yīng)細(xì)胞的增殖并改變其細(xì)胞因子譜的產(chǎn)生緩解過度炎癥反應(yīng)；④釋放免疫抑制和抗炎因子，如轉(zhuǎn)化生長因子TGF-1，IL-4，吲哚胺2，3-二加氧酶；⑤通過直接的細(xì)胞間接觸，分泌可溶性因子VEGF，F(xiàn)GF和IL-6促進(jìn)血管形成，以及釋放外泌體促進(jìn)慢性傷口愈合[3]。

P38 MAPK通過激活涉及各種細(xì)胞功能(如細(xì)胞凋亡，細(xì)胞生長和分化)的轉(zhuǎn)錄因子而發(fā)揮其生物學(xué)作用。P38 MAPK通路激活后，存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子就會(huì)被磷酸化和激活，目標(biāo)基因表達(dá)，從而導(dǎo)致生物學(xué)反應(yīng)的發(fā)生。這些轉(zhuǎn)錄因子主要包括ATF-1，ATF-2，GADD153，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子(MEF)2C，CREB，C / EBP同源蛋白(CHOP)，p53和NF-kB等[4-8]。p38 MAPK途徑可以有效調(diào)節(jié)人全血、肺泡巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子(如TNF-α，IL-1，IL-2，IL-6，IL-7和IL-8)的表達(dá)和活性[9]，另外，p38 MAPK途徑在免疫系統(tǒng)的細(xì)胞增殖和分化中也起到重要的調(diào)節(jié)作用，參與GM-CSF，CSF，EPO和CD40誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和分化[10-11]。

本研究發(fā)現(xiàn)抑制UC-MSC的P38 MAPK信號(hào)通路能夠增強(qiáng)UC-MSC中VEGF信號(hào)通路上游基因PAI-1的表達(dá)，提示VEGF信號(hào)通路的上調(diào)。VEGF信號(hào)通路是組織修復(fù)的重要通路之一，其過表達(dá)能夠有效的促進(jìn)傷口愈合，本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示VEGF信號(hào)通路上調(diào)可作為P38 MAPK通路抑制的UC-MSC促進(jìn)大鼠背部皮損愈合的推理原因之一，但是關(guān)于P38 MAPK通路抑制的UC-MSC促進(jìn)傷口愈合的確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究。