蘭春燕 李海南 王 磊 戴利軍 邵佳芬 高華方,* 馬 旭

1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所(北京，100081)；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院；3. 廣東三九腦科醫(yī)院

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤[1]，約占顱內(nèi)惡性腫瘤的80%，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，患者病情發(fā)展隱匿，即使經(jīng)過最積極的治療，中位生存期僅為15個月[2]。研究表明，不同性別的患者驅(qū)動GBM發(fā)展的過程及對治療反應(yīng)方面存在差異，且年齡也是GBM預(yù)后的重要評判指標(biāo)[3]。Ohgaki等[4]對751例不同年齡組GBM患者的研究發(fā)現(xiàn)，年齡<50歲GBM患者的生存期為8.8個月；而年齡≥50歲組GBM患者的生存期為4.1個月，即年齡≥50歲的晚發(fā)GBM患者的預(yù)后比中青年患者差[5]。多項研究致力于從基因?qū)用嫣綄つz質(zhì)瘤的新的治療靶點[6-7]，但由于蛋白是細(xì)胞生物學(xué)功能的直接執(zhí)行者，因此蛋白組學(xué)是分析GBM相關(guān)疾病的強(qiáng)有力的工具[8]。本研究采用蛋白組學(xué)技術(shù)對不同年齡段女性GBM患者的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析，尋找與年齡相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，并通過生物信息學(xué)分析為不同年齡段GBM女性患者的靶向診療提供思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

納入廣東省三九腦科醫(yī)院2018-2020年收治的18例GBM女性患者為研究對象，患者中位年齡49歲(20～71歲)。其中年齡<50歲10例；≥50歲8例。本研究獲得廣東三九腦科醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，患者或家屬均知情同意并簽署知情同意書。本研究符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 樣本制備與數(shù)據(jù)采集

所有組織樣本均通過手術(shù)或活檢的方式取自GBM患者腦部腫瘤病變區(qū)域。18例GBM活檢組織均從-80℃冰箱取出，進(jìn)行樣本預(yù)處理。蛋白提取后，采用Bradford蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測定，并通過凝膠電泳實驗對條帶清晰度等的判斷進(jìn)行蛋白質(zhì)檢。取120μg蛋白樣品經(jīng)胰蛋白酶酶解，采用18C除鹽柱進(jìn)行除鹽后，進(jìn)入質(zhì)譜儀內(nèi)上機(jī)檢測。采用數(shù)據(jù)依賴采集(DDA)的方式進(jìn)行真實譜圖庫的構(gòu)建。使用配有Nanospray FlexTM(ESI)離子源的Q ExactiveTMHF-X 質(zhì)譜儀進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集，設(shè)定離子噴霧電壓為2.5kV，離子傳輸管溫度為320℃，質(zhì)譜全掃描范圍為m/z 350-1500，使用高能碰撞解離(HCD)方法碎裂進(jìn)行二級質(zhì)譜檢測。下機(jī)后的文件直接導(dǎo)入到Proteome Discoverer 2.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫的檢索及蛋白的定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用Excel軟件篩選在所有GBM樣本中均表達(dá)的蛋白。在R(版本3.6.1)語言環(huán)境下，R Studio利用limma軟件包進(jìn)行兩組不同年齡段GBM組織內(nèi)差異蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)的處理，應(yīng)用P<0.05及差異倍數(shù)(FC)>2的指標(biāo)進(jìn)行差異蛋白的篩選。使用ggplot2軟件包進(jìn)行兩組間差異蛋白的可視化，將Log2(FC)作為橫軸，-Log10(P)為縱軸進(jìn)行火山圖的繪制。使用微生信在線網(wǎng)站進(jìn)行成比例韋恩圖的繪制。采用Kobas軟件對蛋白進(jìn)行功能注釋，使用metascape軟件進(jìn)行差異蛋白的基因本體(GO)細(xì)胞組成(CC)的富集分析，并進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(KEGG)功能富集分析。采用STRING軟件進(jìn)行99種差異顯著蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，并將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape v.3.7.2軟件進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果的可視化。

2 結(jié)果

2.1 差異蛋白組學(xué)分析

使用uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白的注釋，可信度在99%以上的譜肽(PSMs)為可信PSMs，將至少含有1個特異性肽段的蛋白定義為可信蛋白，本研究只保留可信的譜肽和蛋白，并進(jìn)行錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)驗證，去除FDR>1%的肽段和蛋白。通過上述過濾標(biāo)準(zhǔn)，在18例女性GBM患者中共鑒定到4617種蛋白，其中3530種蛋白在所有GBM組織中均表達(dá)。僅在年齡≥50歲的女性GBM患者中表達(dá)的蛋白數(shù)目為813種，而僅在年齡<50歲的女性GBM患者中表達(dá)的蛋白數(shù)目為274種。篩選得到≥50歲組GBM中上調(diào)表達(dá)蛋白共計71種，下調(diào)蛋白共計28種(圖1)(1079頁)。將數(shù)據(jù)歸一化后進(jìn)行聚類熱圖的繪制，能夠可視化差異表達(dá)蛋白在每例患者病變組織內(nèi)的上下調(diào)情況(圖2)(1080頁)。

2.2 差異表達(dá)蛋白功能富集分析

通過對差異蛋白進(jìn)行GO細(xì)胞定位富集分析，發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要定位在細(xì)胞外囊泡及肌動蛋白骨架及脂膜筏(圖3A)(1080頁)。通過KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要參與的信號通路是細(xì)胞凋亡和肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)(圖3B)(1080頁)，且參與上述信號通路的差異蛋白在高齡女性GBM患者中表達(dá)量均明顯上調(diào)(P<0.05，F(xiàn)C>2)。

2.3 差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

對99種差異蛋白進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。以連接度大小作為關(guān)鍵蛋白的評價指標(biāo)，本研究結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研情況及數(shù)據(jù)分析結(jié)果，篩選了3個連接度最大的蛋白作為關(guān)鍵蛋白(圖4)(1080頁)。3個關(guān)鍵蛋白及其對應(yīng)的編碼基因分別是α1-酸性糖蛋白(ORM1)、膜聯(lián)蛋白(ANXA2)、α1-酸性糖蛋白2(ORM2)。

3 討論

GBM作為惡性程度最高的腦部腫瘤，主要見于成年人。人類對GBM疾病的病情進(jìn)展及結(jié)局在性別和年齡上的差異已經(jīng)成為共識，但目前尚無針對不同年齡段抑或是不同性別GBM患者的靶向針對性治療，從分子角度探尋蛋白靶點對GBM患者的精準(zhǔn)靶向治療尤為必要。

蛋白組學(xué)技術(shù)可以進(jìn)行高通量的蛋白篩選和發(fā)現(xiàn)，通過差異蛋白組學(xué)研究，有利于發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要蛋白分子，進(jìn)而解析疾病發(fā)病機(jī)制，促進(jìn)對疾病的精準(zhǔn)診療。本研究采用DIA蛋白組學(xué)技術(shù)，數(shù)據(jù)采集的時候?qū)⒄麄€掃描窗口劃分為若干個窗口，再對每個窗口的離子進(jìn)行二次碎裂，可以采集所有的離子信息[9]。相比于傳統(tǒng)的DDA技術(shù)，該技術(shù)對蛋白的覆蓋度更高，在18例GBM女性患者病變組織的DIA蛋白組學(xué)研究共鑒定了4617種蛋白。因此將<50歲組和≥50歲組女性患者腫瘤組織的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能富集分析和相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，可能會揭示女性GBM患者不同的預(yù)后原因。

α1-酸性糖蛋白是一種急性期反應(yīng)蛋白，主要由肝臟分泌的蛋白質(zhì)，有證據(jù)表明該蛋白也可在淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中合成[10-11]。已經(jīng)有大量的研究報道該蛋白在患者體內(nèi)的含量與多種腫瘤如肝癌、胰腺導(dǎo)管腺癌等疾病的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[12-13]。相關(guān)研究表明，相比存活期較長的GBM患者，α1-AG在預(yù)后差、生存期短的患者體內(nèi)的含量更高，這可能是與α1-AG含量增加所導(dǎo)致的免疫功能受損密切相關(guān)[14]。這將為GBM的惡性進(jìn)展提供機(jī)制的見解。

膜聯(lián)蛋白是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，是一種高豐度蛋白，在各種腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)。研究表明該蛋白與炎癥、腫瘤密切相關(guān)[15-16]。相關(guān)研究報道膜聯(lián)蛋白與膠質(zhì)瘤的增殖相關(guān)[17]，是調(diào)節(jié)血管生成和惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲的因素，并且膠質(zhì)瘤級別與該蛋白陽性率呈正相關(guān)[18]。該蛋白可能通過STAT3-cyclin D1信號通路調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[19]。由此推斷，該蛋白的高表達(dá)可能作為高齡GBM患者預(yù)后差的潛在蛋白標(biāo)記。

綜上所述，本研究對兩個年齡段女性GBM的差異蛋白組學(xué)進(jìn)行分析，不僅發(fā)現(xiàn)了差異蛋白的細(xì)胞定位及可能參與的信號通路，為了解高齡GBM患者預(yù)后，更為不理想的發(fā)病機(jī)制提供一定的思路；而且還挖掘了3個調(diào)節(jié)GBM惡性增殖的潛在蛋白靶點，這將為不同年齡階段GBM患者的精準(zhǔn)治療有所幫助。不過這一初級結(jié)論還需后續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗證的同時，納入分子生物學(xué)實驗，進(jìn)一步探究本文挖掘的3個關(guān)鍵蛋白對GBM惡性增殖的調(diào)控作用以及潛在的分子機(jī)制。