羅曉平,王鵬龍,李軍燕,楊曉野*,耿萬(wàn)恒,馮新港，劉 威，李 超,劉 陽(yáng),王 瑞

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)(Haemonchuscontortus)屬毛圓科(Trichostrongylidae)血矛屬(Haemonchus)，是寄生于牛羊等反芻動(dòng)物體內(nèi)的重要胃腸道線蟲(chóng)之一，主要導(dǎo)致宿主貧血、水腫、衰弱及消化紊亂，對(duì)家畜造成嚴(yán)重危害，國(guó)內(nèi)已對(duì)其進(jìn)行了系列研究[1-6]。國(guó)家“973”計(jì)劃“牛羊重要寄生蟲(chóng)致病機(jī)制的分子基礎(chǔ)研發(fā)”及國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“嚴(yán)重危害畜禽的寄生蟲(chóng)病診斷、檢測(cè)與防控新技術(shù)”項(xiàng)目已將捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)列為重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容，且前期許多研究結(jié)果顯示，國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)絕大多數(shù)羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)都存在對(duì)常用驅(qū)蟲(chóng)藥物的耐藥性，包括伊維菌素(ivermectin，IVM)和阿苯達(dá)唑(albendazole)[7-12]。

目前，除IVM外，阿苯達(dá)唑是使用最多的一種廣譜驅(qū)蟲(chóng)藥，其屬于苯并咪唑氨基甲酸酯類藥物，由于其不僅可以驅(qū)除胃腸道線蟲(chóng)的成蟲(chóng)和第4期幼蟲(chóng)，還可以驅(qū)除絳蟲(chóng)及肺線蟲(chóng)的成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)，在高劑量下，對(duì)大于14周齡的肝片吸血蟲(chóng)也具有殺蟲(chóng)效果，且該藥還是一種潛在的治療賈第蟲(chóng)藥物[13-14]，因此，雖然使用起來(lái)較IVM繁瑣，但也深受農(nóng)牧民等養(yǎng)殖業(yè)主的青睞。該藥主要通過(guò)選擇性地與β-微管蛋白結(jié)合，打破微管與微管蛋白之間的平衡而發(fā)揮作用。在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)中，其耐藥性產(chǎn)生主要是由于Ⅰ型β微管蛋白基因上的3個(gè)SNP造成，包括：167(T/A)、198(A/C)和200(T/A)[15-17]。對(duì)于阿苯達(dá)唑耐藥性的檢測(cè)，世界獸醫(yī)促進(jìn)會(huì)推介使用糞便蟲(chóng)卵減少試驗(yàn)和蟲(chóng)卵孵化幼蟲(chóng)試驗(yàn)方法進(jìn)行分析[18]，同時(shí)，也有基于Ⅰ型β微管蛋白基因分子檢測(cè)的報(bào)道[19-20]。為此，本試驗(yàn)通過(guò)蟲(chóng)卵孵化幼蟲(chóng)試驗(yàn)和Ⅰ型β微管蛋白基因多態(tài)性分析方法，從表型和分子遺傳學(xué)層面，對(duì)IVM耐藥及敏感的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)國(guó)內(nèi)分離株進(jìn)行耐阿苯達(dá)唑檢測(cè)，以了解其雙重耐藥性問(wèn)題，并為國(guó)內(nèi)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)耐藥性研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蟲(chóng)株對(duì)IVM耐藥的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)國(guó)內(nèi)分離株(WSHc-001、WSHc-003、WSHc-138、CYHHc-136)及對(duì)IVM敏感的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)國(guó)內(nèi)分離株(YCHc-022)成蟲(chóng)樣本，于75%酒精固定，保存在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；感染不同捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)蟲(chóng)株的羊，用單獨(dú)籠具內(nèi)隔離飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地家畜寄生蟲(chóng)病學(xué)研究室動(dòng)物房。

1.2 主要試劑阿苯達(dá)唑原粉(歐洲標(biāo)準(zhǔn)品)，購(gòu)自壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；NCTC109培養(yǎng)基(gibco)，購(gòu)自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；DMSO(分析純)，購(gòu)自SIGMA-ALDRICH；DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker及2×PCR Mix,均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 阿苯達(dá)唑藥液配制參照參考文獻(xiàn)[18，21]藥液配制方法，準(zhǔn)確稱取阿苯達(dá)唑原粉8 mg溶于800 μL的DMSO中，得到阿苯達(dá)唑儲(chǔ)存液A，質(zhì)量濃度為10 g/L；然后，取100 μL阿苯達(dá)唑儲(chǔ)存液A，使用DMSO稀釋10倍得到阿苯達(dá)唑儲(chǔ)備液B，質(zhì)量濃度為1 g/L；再按照表1配制不同質(zhì)量濃度的阿苯達(dá)唑工作液C，備用。

表1 阿苯達(dá)唑工作液配制方法及培養(yǎng)液終質(zhì)量濃度

1.4 蟲(chóng)卵收集對(duì)羊進(jìn)行直腸采糞后，將新鮮糞便樣本置于50 mL離心管中，用0.5%甲醛溶液將離心管裝滿，并用力搖晃，以達(dá)到無(wú)氧的目的，隨后帶回實(shí)驗(yàn)室。將樣本置于研缽內(nèi)，棄掉液體，加適量飽和生理鹽水后將糞便樣本研碎，再加入10倍體積的飽和生理鹽水，混勻后經(jīng)40，100目篩網(wǎng)依次過(guò)濾，在濾液中加入1/5體積的飽和蔗糖濾液，混勻后倒于大平皿內(nèi)，補(bǔ)充飽和生理鹽水至液面略高于平皿口，上面覆蓋一張硬塑料膜。靜置15 min后，將硬塑料膜輕輕抬起，用去離子水將膜面上的蟲(chóng)卵沖入燒杯，3 000 r/min 離心漂洗3次后，對(duì)蟲(chóng)卵進(jìn)行鏡檢，確認(rèn)無(wú)大粒雜質(zhì)后對(duì)蟲(chóng)卵進(jìn)行計(jì)數(shù)，并將蟲(chóng)卵稀釋成400枚/mL左右的濃度。

1.5 培養(yǎng)體系配置及蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)使用24孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，每組設(shè)置8個(gè)藥物濃度及1個(gè)陰性對(duì)照組和1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組。每孔總體積為2 mL，其中蟲(chóng)卵懸浮液250 μL、不同質(zhì)量濃度阿苯達(dá)唑工作液10 μL、NCTC109培養(yǎng)基350 μL、去離子水1 390 μL。每個(gè)蟲(chóng)株設(shè)2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)3個(gè)平行。對(duì)孔內(nèi)蟲(chóng)卵進(jìn)行計(jì)數(shù)，置于27℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后再次對(duì)每孔內(nèi)未孵化的蟲(chóng)卵進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 蟲(chóng)卵孵化幼蟲(chóng)試驗(yàn)結(jié)果判定對(duì)每組計(jì)數(shù)結(jié)果使用GraphPad Prism 6.0軟件中的log(agonist)vs.response--Variable slope(four parameters)方法統(tǒng)計(jì)EC50值和R2。依據(jù)參考文獻(xiàn)[18，21]推薦的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)EC50≥0.1 mg/L時(shí)，則認(rèn)為備檢蟲(chóng)株存在耐藥性；而EC50<0.1 mg/L時(shí)，則認(rèn)為備檢蟲(chóng)株對(duì)藥物敏感。

1.7 不同蟲(chóng)株成蟲(chóng)基因組DNA提取將保存于75%酒精中的不同捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)成蟲(chóng)(雌、雄蟲(chóng)各25條)取出，用去離子水漂洗3～5次，置于PBS溶液中浸泡過(guò)夜，之后再次用去離子水漂洗2次，用于DNA提取。所有蟲(chóng)體基因組DNA提取過(guò)程均參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。DNA提取完成后，使用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定DNA濃度，質(zhì)量較好的DNA樣本用于后續(xù)研究。

1.8 Ⅰ型β微管蛋白基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序以鑒定合格的樣本DNA為模版，用引物[22]HcPy2PCR-F(5′-GACGCATTCACTTGGAGGA-G-3′)/HcPy2PCR-R(5′Biotin-CATAGGTTGGA TTGTGAGTT-3′)擴(kuò)增Ⅰ型β微管蛋白基因(385 bp)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后將產(chǎn)物直接測(cè)序(雙向)。PCR反應(yīng)體系25 μL：10 mmol/L 上、下游引物各1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，DNA模版2 μL，無(wú)菌無(wú)酶水8.5 μL；擴(kuò)增條件：94℃ 5 min；94℃ 40 s，53℃ 40 s，68℃ 40 s,40個(gè)循環(huán)；68℃ 7 min。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 序列分析與結(jié)果判定將所得序列使用Lasergene 7.0軟件進(jìn)行分析，人工校正，與基因庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)的Ⅰ型β微管蛋白基因序列比對(duì)，分析序列中第167、198、200位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，并統(tǒng)計(jì)不同捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)蟲(chóng)株Ⅰ型β微管蛋白基因的基因型及其頻率。依據(jù)參考文獻(xiàn)[23]報(bào)道的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定：若1個(gè)種群中，有超過(guò)10%的個(gè)體攜帶耐藥基因型(在1個(gè)位點(diǎn)存在純合耐藥基因型或在2個(gè)位點(diǎn)位點(diǎn)同時(shí)存在雜合子基因型)，則認(rèn)為這個(gè)種群存在耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 不同蟲(chóng)株蟲(chóng)卵孵化幼蟲(chóng)試驗(yàn)結(jié)果采用參考文獻(xiàn)[18]推薦的蟲(chóng)卵孵化幼蟲(chóng)試驗(yàn)，對(duì)不同分離株耐阿苯達(dá)唑特性進(jìn)行分析。結(jié)果如表2及圖1～5所示，所分離的對(duì)IVM耐藥捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)蟲(chóng)株同時(shí)對(duì)阿苯達(dá)唑耐藥，且所有耐藥蟲(chóng)株EC50較檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)0.1 mg/L要高出數(shù)倍，尤其是WSHc-001，其EC50值達(dá)到了1.4 mg/L。而所分離的對(duì)IVM敏感捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)蟲(chóng)株同時(shí)對(duì)阿苯達(dá)唑不耐藥，其EC50值僅為0.07 mg/L。

表2 阿苯達(dá)唑?qū)Σ煌蛛x株EC50統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖1 YCHc-022株蟲(chóng)卵孵化幼蟲(chóng)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)分離株Ⅰ型β微管蛋白基因PCR擴(kuò)增結(jié)果使用針對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)Ⅰ型β微管蛋白基因的特異性引物，對(duì)鑒定合格樣本進(jìn)行目的條帶擴(kuò)增，結(jié)果如圖6所示：所有檢測(cè)樣本在瓊脂糖凝膠上均出現(xiàn)了385 bp的目的條帶，表明基因擴(kuò)增成功，產(chǎn)物可進(jìn)行測(cè)序，用于特異性位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性分析。

圖2 WSHc-001株蟲(chóng)卵孵化幼蟲(chóng)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 圖3 WSHc-003株蟲(chóng)卵孵化幼蟲(chóng)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

圖4 WSHc-138株蟲(chóng)卵孵化幼蟲(chóng)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 圖5 CYHHc-136株蟲(chóng)卵孵化幼蟲(chóng)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

M.DL2000 DNA Marker；1～23.待檢樣品；C.陰性對(duì)照(滅菌蒸餾水)

2.3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)分離株Ⅰ型β微管蛋白基因特異性位點(diǎn)SNP分析結(jié)果對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)蟲(chóng)體Ⅰ型β微管蛋白基因中與阿苯達(dá)唑耐藥相關(guān)的第167、198、200位單核苷酸的多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示,所有蟲(chóng)株中，167位點(diǎn)僅存在純合敏感型(TTC)；198位點(diǎn)存在純合敏感型(GAA)、雜合耐藥型(GCA/GAA)及純合耐藥型(GCA)，狀況最為復(fù)雜；而在200位點(diǎn)，絕大部分僅存在純合敏感型(TTC)和雜合耐藥型(TTC/TAC)；純合耐藥型(TAC)在CYHHc-136蟲(chóng)株中大量存在，而在WSHc-138蟲(chóng)株的雌蟲(chóng)中少量存在，且在YCHc-022蟲(chóng)株中也出現(xiàn)1個(gè)。

2.3.1WSHc-001蟲(chóng)株 所有樣本在167位點(diǎn)均為純合敏感型(TTC)；在198位點(diǎn)，存在純合敏感型(GAA)、雜合耐藥型(GCA/GAA)及純合耐藥型(GCA)3種類型，且雌雄蟲(chóng)間各自占比有所不同，其中純合耐藥型占比達(dá)到52.4%，在雌雄蟲(chóng)中所占比例分別為60.9%和42.1%；而在200位點(diǎn)，未見(jiàn)純合耐藥型(TAC)(表3)，表明該蟲(chóng)株具有耐藥性。

表3 WSHc-001蟲(chóng)株Ⅰ型β微管蛋白基因167、198、200位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性

2.3.2WSHc-003蟲(chóng)株 所有樣本在167位點(diǎn)均為純合敏感型(TTC)。在198位點(diǎn)，存在純合敏感型(GAA)、雜合耐藥型(GCA/GAA)及純合耐藥型(GCA)3種類型；其中，純合耐藥型占比總體達(dá)到30%，在雌雄蟲(chóng)中所占比例分別為27.3%和33.3%。200位點(diǎn)，未見(jiàn)純合耐藥型(TAC)(表4)，表明該蟲(chóng)株具有耐藥性。

表4 WSHc-003蟲(chóng)株Ⅰ型β微管蛋白基因167、198、200位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性

2.3.3WSHc-138蟲(chóng)株 所有樣本在167位點(diǎn)均為純合敏感型(TTC)；在198位點(diǎn)，純合耐藥型(GCA)占比總體達(dá)到40.9%，在雌雄蟲(chóng)中所占比例分別為47.6%和34.8%；200位點(diǎn)，純合耐藥型(TAC)占比為4.8%，而雄蟲(chóng)中未見(jiàn)純合耐藥型(表5)，表明其具有耐藥性。

表5 WSHc-138蟲(chóng)株Ⅰ型β微管蛋白基因167、198、200位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性

2.3.4CYHHc-136蟲(chóng)株 所有樣本在167位點(diǎn)均為純合敏感型(TTC)；在198位點(diǎn)，純合耐藥型(GCA)總體占比為14.0%；200位點(diǎn)，純合耐藥型(TAC)總體占比達(dá)到14.0%(表6),表明該蟲(chóng)株具有耐藥性。

表6 CYHHc-136蟲(chóng)株Ⅰ型β微管蛋白基因167、198、200位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性

根據(jù)198位點(diǎn)純合耐藥型占比，雌蟲(chóng)耐藥而雄蟲(chóng)不耐藥；而根據(jù)200位點(diǎn)純合耐藥型分析，雌蟲(chóng)不耐藥而雄蟲(chóng)耐藥。兩者相結(jié)合后，雌雄蟲(chóng)則均耐藥。

2.3.5YCHc-022蟲(chóng)株 在198位點(diǎn)雄蟲(chóng)中有4.2%蟲(chóng)體出現(xiàn)純合耐藥型(GCA)，而雌蟲(chóng)中并未出現(xiàn)，總體而言，其純合耐藥型占比僅為2.17%，且200位點(diǎn)和167位點(diǎn)也均未見(jiàn)純合耐藥型，表明其對(duì)阿苯達(dá)唑敏感(表7)。但是，種群中出現(xiàn)了大量的單位點(diǎn)雜合耐藥型及個(gè)別的單位點(diǎn)純合耐藥型，故該蟲(chóng)株存在對(duì)阿苯達(dá)唑產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。

表7 YCHc-022蟲(chóng)株Ⅰ型β微管蛋白基因167、198及200位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性

2.4 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)分離株Ⅰ型β微管蛋白基因型及其頻率分析結(jié)果對(duì)所有捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)分離株測(cè)序峰圖進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型β微管蛋白基因序列中存在7種基因型，包括198位點(diǎn)純合敏感型(GAA)及200位點(diǎn)純合敏感型(TTC)、198位點(diǎn)純合敏感型(GAA)及22位點(diǎn)雜合耐藥型(TAC/TTC)、198位點(diǎn)純合敏感型(GAA)及200位點(diǎn)純合耐藥型(TAC)、198位點(diǎn)雜合耐藥型(GAA/GCA)及200位點(diǎn)純合敏感型、198位點(diǎn)雜合耐藥型(GAA/GCA)及200位點(diǎn)雜合耐藥型(TAC/TTC)、198位點(diǎn)純合耐藥型(GCA)及200位點(diǎn)雜合耐藥型(TAC/TTC)、198位點(diǎn)純合耐藥型(GCA)及200位點(diǎn)純合敏感型(TTC)(圖7～13)。對(duì)于不同分離株，除167位點(diǎn)所有檢測(cè)蟲(chóng)體均為純合敏感型(TTC)外，各分離株198位點(diǎn)和200位點(diǎn)所含基因型也有所不同。其2個(gè)位點(diǎn)同時(shí)存在雜合耐藥基因型(Het-198且Het-200)所含個(gè)體數(shù)及其頻率如表8所示，對(duì)伊維菌素耐藥捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)分離株(WSHc-001、WSHc-003、WSHc-138、CYHHc-136)而言，其種群內(nèi)基因頻率為15.9%～51.2%，表明各分離株對(duì)阿苯達(dá)唑也存在耐藥性。對(duì)雌雄蟲(chóng)分別分析顯示，在4個(gè)分離株中，WSHc-001和WSHc-138雌蟲(chóng)雙位點(diǎn)雜合耐藥型占比低于10%的臨界值；其余分離株不論雌雄，其雙位點(diǎn)雜合耐藥型頻率均在10%以上。對(duì)YCHc-022蟲(chóng)株而言，雖然群體雙位點(diǎn)雜合耐藥型頻率僅有8.7%，低于10%的臨界值，顯示蟲(chóng)株對(duì)阿苯達(dá)唑敏感，但其雌蟲(chóng)中雙位點(diǎn)雜合耐藥型占比卻達(dá)到了13.6%，顯示出雌蟲(chóng)對(duì)阿苯達(dá)唑的耐藥性，而雄蟲(chóng)中占比僅為4.2%。

圖7 198位點(diǎn)純合敏感型(GAA)及200位點(diǎn)純合敏感型(TTC)

圖8 198位點(diǎn)純合敏感型(GAA)及200位點(diǎn)雜合耐藥型(TAC/TTC)

圖9 198位點(diǎn)純合敏感型(GAA)及200位點(diǎn)純合耐藥型(TAC)

圖10 198位點(diǎn)雜合耐藥型(GAA/GCA)及200位點(diǎn)純合敏感型

圖11 198位點(diǎn)雜合耐藥型(GAA/GCA)及200位點(diǎn)雜合耐藥型(TAC/TTC)

圖12 198位點(diǎn)純合耐藥型(GCA)及200位點(diǎn)雜合耐藥型(TAC/TTC)

圖13 198位點(diǎn)純合耐藥型(GCA)及200位點(diǎn)純合敏感型(TTC)

表8 不同蟲(chóng)株Ⅰ型β微管蛋白基因2個(gè)位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)雜合耐藥型頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論

對(duì)于羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病而言，常用的驅(qū)蟲(chóng)藥物主要包括苯并咪唑類(阿苯達(dá)唑等)和大環(huán)內(nèi)脂類(IVM等)。據(jù)報(bào)道，國(guó)外不同地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)均對(duì)阿苯達(dá)唑產(chǎn)生了不同程度的耐藥性[24-25]。國(guó)內(nèi)，林琳等[26]對(duì)福建山羊感染的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)耐藥性檢測(cè)結(jié)果顯示，蟲(chóng)體對(duì)阿苯達(dá)唑具有一定的耐藥性；蔡葵蒸等[27]對(duì)寧夏地區(qū)16個(gè)羊場(chǎng)的調(diào)查結(jié)果顯示，25%養(yǎng)殖場(chǎng)中胃腸道線蟲(chóng)對(duì)阿苯達(dá)唑存在耐藥性；額葉勒德格等[9]對(duì)內(nèi)蒙古烏審旗綿羊胃腸道線蟲(chóng)耐藥性調(diào)查結(jié)果顯示，以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)和細(xì)頸線蟲(chóng)為主的胃腸道線蟲(chóng)對(duì)阿苯達(dá)唑產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性；本研究團(tuán)隊(duì)前期對(duì)內(nèi)蒙古呼倫貝爾新巴爾虎右旗某牧場(chǎng)放牧羊的驅(qū)蟲(chóng)試驗(yàn)也表明，以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)為主的胃腸道線蟲(chóng)對(duì)阿苯達(dá)唑存在耐藥性[7]。

本研究中，首先通過(guò)蟲(chóng)卵孵化幼蟲(chóng)試驗(yàn)，對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)耐IVM分離蟲(chóng)株的耐阿苯達(dá)唑特性進(jìn)行分析，不論按COLES等[18]推薦的檢測(cè)限量(EC50≥0.1 mg/L為耐藥，EC50<0.1 mg/L為敏感)，還是按參考文獻(xiàn)[8]給出的檢測(cè)限量(EC50≥0.08 mg/L 為耐藥，0.08 mg/L>EC50≥0.05 mg/L為疑似耐藥，EC50<0.05 mg/L為敏感)，均表明所分離到的4株耐IVM蟲(chóng)株同樣耐阿苯達(dá)唑(EC50介于0.25～1.4 mg/L)，而對(duì)IVM敏感的蟲(chóng)株對(duì)阿苯達(dá)唑敏感或疑似耐藥(EC50值為0.07 mg/L)。究其原因，在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)耐IVM分離株來(lái)源的羊群所處地區(qū)，農(nóng)牧民都有每年定期對(duì)羊只進(jìn)行全群驅(qū)蟲(chóng)的習(xí)慣，如春秋2次驅(qū)蟲(chóng)。更有甚者，1年中每個(gè)月都進(jìn)行1次驅(qū)蟲(chóng)，但所用藥物則相對(duì)單一，以IVM注射液和阿苯達(dá)唑片劑為主。而對(duì)IVM敏感捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)蟲(chóng)株分離地，則人們對(duì)驅(qū)蟲(chóng)不太重視，只有當(dāng)羊只消瘦且發(fā)育遲緩后，才進(jìn)行個(gè)體性驅(qū)蟲(chóng)，所使用的驅(qū)蟲(chóng)藥也是IVM注射液和阿苯達(dá)唑片劑，但并非全群用藥。所以1個(gè)蟲(chóng)株出現(xiàn)多重耐藥是可以理解的，敏感蟲(chóng)株EC50值大于絕對(duì)敏感蟲(chóng)株也是正常的。為此，基于包括捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)在內(nèi)的羊胃腸道線蟲(chóng)對(duì)常用驅(qū)蟲(chóng)藥耐藥性日益凸顯的問(wèn)題，應(yīng)加強(qiáng)新型驅(qū)蟲(chóng)策略的宣傳，如推廣檢測(cè)性驅(qū)蟲(chóng)模式，減少盲目用藥導(dǎo)致的寄生蟲(chóng)耐藥性的產(chǎn)生。同時(shí)，鑒于蟲(chóng)體對(duì)IVM與阿苯達(dá)唑耐藥性的嚴(yán)重性，在臨床實(shí)踐中，應(yīng)逐步減少上述兩類藥物的使用頻率，而更多選用其他驅(qū)蟲(chóng)藥。

對(duì)不同捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)分離株與阿苯達(dá)唑耐藥相關(guān)Ⅰ型β微管蛋白基因上特異性位點(diǎn)SNP進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所有蟲(chóng)株167位點(diǎn)均為純合敏感型(TTC)，這與張宗澤[11]對(duì)國(guó)內(nèi)不同地區(qū)羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的分析以及楊新等[20]對(duì)新疆某養(yǎng)殖場(chǎng)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的檢測(cè)結(jié)果一致。據(jù)BARRERE等[23]報(bào)道，若一個(gè)種群中，有超過(guò)10%的個(gè)體攜帶耐藥基因型(在167位點(diǎn)存在純合耐藥基因型或在200位點(diǎn)存在純合耐藥基因型，或在167位點(diǎn)和200位點(diǎn)同時(shí)存在雜合子基因型)，則認(rèn)為這個(gè)種群存在耐藥性。而張宗澤[11]在分析了國(guó)內(nèi)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)這3個(gè)SNP后，認(rèn)為國(guó)內(nèi)不同來(lái)源捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)167位點(diǎn)只有純合敏感型，故對(duì)于國(guó)內(nèi)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)而言，對(duì)阿苯達(dá)唑的耐藥評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)為：一個(gè)種群中，有超過(guò)10%的個(gè)體攜帶耐藥基因型(在198位點(diǎn)存在純合耐藥基因型或在200位點(diǎn)存在純合耐藥基因型，也或在198位點(diǎn)和200位點(diǎn)同時(shí)存在雜合子基因型)。據(jù)此分析，本研究中所有對(duì)IVM耐藥的分離株種群內(nèi)均超過(guò)10%的個(gè)體攜帶198位點(diǎn)純合耐藥基因型(為14%～52.4%)；同時(shí)，有超過(guò)10%的個(gè)體198位點(diǎn)和200位點(diǎn)同時(shí)存在雜合子基因型(15.9%～51.2%)。在對(duì)IVM敏感的分離株中，低于10%的個(gè)體攜帶198位點(diǎn)純合耐藥基因型(2.17%)，同時(shí)低于10%的個(gè)體198位點(diǎn)和200位點(diǎn)同時(shí)存在雜合子基因型(8.7%)，表明所有分離株通過(guò)蟲(chóng)卵孵化幼蟲(chóng)試驗(yàn)所得結(jié)果與分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果相一致。同時(shí)，分析上述3個(gè)耐藥性SNP突變?cè)诓煌x(chóng)株中所占百分比與蟲(chóng)卵孵化幼蟲(chóng)試所得EC50值的相關(guān)性，可以發(fā)現(xiàn)，在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)對(duì)阿苯達(dá)唑的耐藥性檢測(cè)限量中，蔡葵蒸[8]給出的標(biāo)準(zhǔn)中含有疑似耐藥指標(biāo)更為合理。當(dāng)然，對(duì)上述耐藥性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，所分離的對(duì)IVM耐藥的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)分離株同時(shí)也具有對(duì)阿苯達(dá)唑的耐藥性，即存在雙重耐藥性。而對(duì)IVM敏感的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)分離株則對(duì)阿苯達(dá)唑不耐藥，但也存在對(duì)阿苯達(dá)唑產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。