余應(yīng)梅，施 璇，王汝慧，李君惠1,，歐陽經(jīng)鑫1,，劉三鳳，黎觀紅1,*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省動(dòng)物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，江西 南昌 330045)

現(xiàn)代肉雞養(yǎng)殖中肉雞采食玉米-豆粕型飼糧難以滿足其對(duì)高能量的需求，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中常加入油脂以提高飼糧能量水平。油脂作為一種高能飼料原料，可為家禽提供必需脂肪酸和易被機(jī)體吸收利用的能量，提高肉雞的增重率、料重比和飼料能量沉積[1]。特別是在高溫和寒冷季節(jié)添加油脂能降低肉雞的應(yīng)激反應(yīng)，提高生產(chǎn)性能。因此，油脂在肉雞飼料上的應(yīng)用越來越普遍。然而，高油脂飼料在加工、貯存、運(yùn)輸和飼喂過程中易發(fā)生氧化酸敗，酸敗的氧化產(chǎn)物如醛、酮、酮酸等會(huì)破壞畜禽的正常生理功能，甚至導(dǎo)致畜產(chǎn)品安全問題[2]。研究表明，家禽飼糧中添加氧化大豆油導(dǎo)致家禽生產(chǎn)性能和抗氧化性能降低，并降低雞肉品質(zhì)[3]。目前，通常用過氧化值(POV)、酸價(jià)(AV)和丙二醛(MDA)含量這3個(gè)指標(biāo)判斷油脂氧化后的一級(jí)產(chǎn)物和二級(jí)產(chǎn)物的含量，并且以此評(píng)價(jià)油脂的氧化酸敗程度。油脂氧化后產(chǎn)生的過氧化產(chǎn)物能與蛋白質(zhì)產(chǎn)生交聯(lián)作用并引起細(xì)胞損傷[4]。

葛根是我國歷史悠久的藥食同源植物，含有淀粉、氨基酸、微量元素以及多酚、多糖和黃酮類化合物等生物活性成分，主要以黃酮類為主，其中葛根素(puerarin)是主要的黃酮類生物活性成分[5]。葛根素化學(xué)名為8-β-D-葡萄吡喃糖-4',7-二羥基異黃酮，分子式為C21H20O9，結(jié)構(gòu)與雌二醇相似，具有部分雌激素樣作用[6]。研究表明，葛根素具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用[7-10]。目前，葛根素的研究主要集中于醫(yī)學(xué)和保健食品方面，在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用研究鮮見報(bào)道[11-12]。為此，基于氧化油脂對(duì)動(dòng)物的危害作用及葛根素的多重生物學(xué)功能，本試驗(yàn)旨在探討新鮮大豆油和氧化大豆油飼糧中添加葛根素對(duì)黃羽肉雞生長性能、抗氧化能力和免疫功能的影響，以期為葛根素在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 氧化大豆油的制備參考文獻(xiàn)[13]的方法制備氧化大豆油。新鮮大豆油為市售精煉一級(jí)食用大豆油。新鮮大豆油在沸水浴中連續(xù)加熱10 h，并且持續(xù)通入空氣，分別在加熱后4，7，9，10 h測定大豆油的過氧化值(POV)和丙二醛(MDA)的含量。當(dāng)POV ≥90 meq/kg時(shí)，氧化大豆油制備結(jié)束。油脂POV的測定方法參考GB/T 5538-2005，MDA含量的測定方法參考GB 5009.181-2016。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用2×2因子設(shè)計(jì)，因子包括大豆油和葛根素。大豆油按其品質(zhì)分為新鮮大豆油(POV=1.53 meq/kg，MDA=0.18 mg/kg)和氧化大豆油(POV=(95±2)meq/kg，MDA=26.41 mg/kg)。飼糧中葛根素添加量為0和750 mg/kg 2個(gè)水平，本試驗(yàn)所用的葛根素購自楊凌慈緣生物科技有限公司，純度為98.31%，批次號(hào)為CY190320。選取1日齡健康雌性三黃雞肉雞360只，隨機(jī)分成4個(gè)處理組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只。試驗(yàn)期為56 d。4個(gè)處理組分別為新鮮大豆油飼糧組、新鮮大豆油+葛根素(750 mg/kg)飼糧組、氧化大豆油飼糧組和氧化大豆油+葛根素(750 mg/kg)飼糧組。1～28日齡油脂添加量為2%，29～56日齡油脂添加量為3%。

1.3 試驗(yàn)飼糧與飼養(yǎng)管理本試驗(yàn)采用的基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型飼糧，根據(jù)我國NT/T 33-2004《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》推薦的營養(yǎng)水平，按1～28，29～56日齡2個(gè)階段進(jìn)行配制。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)雞采用3層籠籠養(yǎng)。試驗(yàn)前對(duì)雞舍進(jìn)行充分沖洗和嚴(yán)格消毒，入雛前24 h將雞舍升溫至32～35℃，此后溫度每周降低2～3℃，直至保持在22～24℃為止。采用連續(xù)光照、自然通風(fēng)。試驗(yàn)期舍內(nèi)光照、濕度和溫度根據(jù)常規(guī)飼養(yǎng)管理要求進(jìn)行控制，雞只按正常免疫程序進(jìn)行免疫。整個(gè)試驗(yàn)期雞自由采食和飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平 %

1.4 樣品采集與處理在28，56日齡時(shí)，黃羽肉雞提前禁食12 h，期間自由飲水，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1只雞，翅靜脈采血10 mL，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1生長性能 試驗(yàn)的 1，28，56 d晨飼前空腹測體質(zhì)量，記錄每天的耗料量，以重復(fù)為單位計(jì)算耗料量，并計(jì)算各組平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.5.2血清抗氧化指標(biāo) 采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、硫氧還蛋白還原酶(TrxR)活性、總抗氧化能力(T-AOC)、還原型谷胱甘肽(GSH)、蛋白質(zhì)羰基(PC)和MDA含量，檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.3血清皮質(zhì)酮、細(xì)胞因子和免疫球蛋白含量的測定 采用上海酶聯(lián)生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，ELISA法測定血清皮質(zhì)酮(CORT)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-10、IL-12、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、免疫球蛋白A(IgA)、IgG和IgM含量。檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 2013對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用 SPSS 17.0軟件中的Two-way ANOVA過程進(jìn)行雙因素方差分析，用 Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，以P<0.050為差異顯著，0.05

2 結(jié)果

2.1 葛根素對(duì)飼喂氧化大豆油黃羽肉雞生長性能的影響由表2可知，氧化大豆油和葛根素對(duì)1～28日齡黃羽肉雞生產(chǎn)性能無顯著影響(P>0.050)，且對(duì)各階段的平均日增重?zé)o顯著影響(P>0.050)。飼糧中添加葛根素顯著提高了29～56日齡和1～56日齡黃羽肉雞的平均日采食量(P<0.050)。與新鮮大豆油相比，飼喂氧化大豆油顯著提高29～56日齡黃羽肉雞料重比(P<0.050)，并有提高1～56日齡料重比的趨勢(P=0.074)。氧化大豆油和葛根素對(duì)試驗(yàn)各階段黃羽肉雞的生產(chǎn)性能不存在顯著的互作效應(yīng)(P>0.050)。

表2 氧化大豆油和葛根素對(duì)肉雞生長性能的影響

2.2 葛根素對(duì)飼喂氧化大豆油黃羽肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響由表3可知，28日齡血清MDA和SOD含量等指標(biāo)均不受主效應(yīng)和互作效應(yīng)的影響(P>0.050)，而28日齡血清TrxR及56日齡血清SOD活性則受油脂類型的影響。與飼喂新鮮大豆油相比，飼喂氧化大豆油顯著降低28日齡黃羽肉雞血清TrxR及56日齡血清SOD活性(P<0.050)，并有降低28日齡(P=0.067)和56日齡(P=0.059)肉雞血清GSH含量以及56日齡血清T-AOC(P=0.081)的趨勢。飼糧中添加葛根素顯著降低飼喂氧化大豆油黃羽肉雞28日齡和56日齡血清PC含量(P<0.050)。氧化大豆油和葛根素在56日齡黃羽肉雞血清MDA含量存在交互作用(P<0.050)，在56日齡，與新鮮大豆油不添加葛根素組相比，氧化大豆油不添加葛根素組肉雞血清MDA含量有升高的趨勢(P=0.055)，而飼糧中添加葛根素有降低飼喂氧化大豆油黃羽肉雞血清MDA含量的趨勢(P=0.073)。

表3 氧化大豆油和葛根素對(duì)肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 葛根素對(duì)飼喂氧化大豆油黃羽肉雞血清皮質(zhì)酮、細(xì)胞因子和免疫球蛋白含量的影響由表4可知，28日齡和56日齡血清IL-6和TNF-α等含量均不受主效應(yīng)和互作效應(yīng)的影響(P>0.050)，而28日齡血清IL-12及56日齡血清CORT和IL-10含量則受油脂類型的影響。與飼喂新鮮大豆油相比，飼喂氧化大豆油顯著降低28日齡血清IL-12及升高56日齡CORT和IL-10含量(P<0.050)，并有提高28日齡黃羽肉雞血清 CORT(P=0.062)和IL-1β含量(P=0.087)的趨勢。而28日齡血清IgA和56日齡血清IL-10、IgA和IgG含量則受葛根素添加量的影響，飼糧中添加葛根素顯著提高28日齡肉雞血清IgA以及56日齡血清IL-10、IgA和IgG含量(P<0.050)。氧化大豆油和葛根素對(duì)56日齡肉雞血清CORT含量存在顯著的交互作用(P<0.050)，飼喂氧化大豆油顯著提高56日齡黃羽肉雞血清 CORT的含量(P<0.050)，而飼糧中添加葛根素顯著降低飼喂氧化大豆油黃羽肉雞血清CORT含量(P<0.050)。

表4 氧化大豆油和葛根素對(duì)肉雞血清皮質(zhì)酮、細(xì)胞因子和免疫球蛋白含量的影響

3 討論

攝入含過氧化物的氧化油脂可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[14]，氧化應(yīng)激導(dǎo)致畜禽處于亞健康狀態(tài)，影響其生長和生產(chǎn)[15]。據(jù)報(bào)道，使用高過氧化物值的油脂或具有毒性作用的二次脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可降低肉雞生長性能[13，16-17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，除顯著提高了29～56日齡黃羽肉雞的料重比外，對(duì)其他生產(chǎn)性能指標(biāo)均無顯著影響，這與A?IKG?Z等[18]、BAYRAKTAR等[19]和KELLER等[20]試驗(yàn)結(jié)果相似。氧化油脂對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響不一致的原因可能與氧化大豆油氧化程度有關(guān)。本試驗(yàn)飼喂的氧化大豆油的過氧化值為(95±2)meq/kg，其過氧化值低于大多數(shù)其他研究，屬于輕度氧化油脂。趙劍等[21]發(fā)現(xiàn)，飼喂輕度氧化油脂對(duì)肉雞生長性能無顯著影響。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，葛根素對(duì)黃羽肉雞各階段的平均日增重以及1～28和1～56日齡料重比無顯著影響(P>0.050)，但飼糧中添加葛根素顯著提高了29～56日齡和1～56日齡黃羽肉雞的平均日采食量(P<0.050)，這與劉博等[12]的研究結(jié)果相似。ZHOU等[22]和左瑞華等[23]報(bào)道，飼糧中添加黃酮類化合物可顯著提高肉雞日增重和采食量并顯著降低料重比，提高肉雞生長性能。然而，也有研究表明，添加高劑量黃酮類化合物可能對(duì)生長性能有抑制作用[24]。這些差異可能是由于不同的飼糧、家禽的品種、生長階段或不同的添加劑量所造成的[25]。

T-SOD和GSH-Px是機(jī)體中廣泛存在的重要的自由基清除酶，能清除超氧化物和脂質(zhì)過氧化氫，減少有機(jī)過氧化氫對(duì)機(jī)體的損害[26]。KELLER等[20]認(rèn)為，喂食氧化油的大鼠紅細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性有降低的趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂氧化大豆油顯著降低28日齡黃羽肉雞血清TrxR及56日齡血清SOD活性，并有降低28日齡和56日齡肉雞血清GSH含量以及56日齡血清T-AOC的趨勢。硫氧TrxR、硫氧還蛋白(Trx)和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)組成的硫氧還蛋白系統(tǒng)是維持生物體氧化還原平衡和基于氧化還原信號(hào)通路調(diào)節(jié)的關(guān)鍵抗氧化系統(tǒng)[27]。還原性谷胱甘肽(GSH)是另一種存在于所有生物組織中的非酶抗氧化劑，且作為一種輔酶，有助于ROS的解毒[28]。本試驗(yàn)TrxR、SOD、T-AOC和GSH水平的降低，表明飼喂氧化大豆油增加肉雞體內(nèi)ROS生成，使氧化-抗氧化失衡，造成氧化應(yīng)激。黃酮類化合物作為一種重要的外源抗氧化劑，其對(duì)機(jī)體的有益作用已引起廣泛關(guān)注[29]。ZHOU等[22]研究發(fā)現(xiàn)，肉雞血清中SOD、GSH-Px和CAT活性隨著黃芩素類黃酮添加水平的提高而升高，且飼糧添加黃芩素顯著降低血清中MDA的含量。LI等[30]研究表明，飼糧添加葛根素可提高仔豬腸黏膜SOD、GSH-Px和T-AOC的活性。PC是由活性氧氧化氨基酸分子中的自由氨基或亞氨基生成的氨和羰基衍生物，其含量可作為評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)氧化程度的指標(biāo)[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加葛根素顯著降低飼喂氧化大豆油黃羽肉雞28日齡和56日齡血清蛋白質(zhì)羰基(PC)含量，且在56日齡時(shí)飼糧中添加葛根素有降低飼喂氧化大豆油黃羽肉雞血清MDA含量的趨勢，表明飼糧中添加葛根素可部分緩解氧化大豆油對(duì)黃羽肉雞抗氧化性能的不利影響。

氧化酸敗油脂引起畜禽氧化應(yīng)激，降低機(jī)體的免疫功能[32]。氧化應(yīng)激是動(dòng)物體內(nèi)存在的過氧化物和自由基等活性氧(ROS)和活性氮(RNS)超過了其抗氧化緩沖能力造成的[33]。而ROS可作為細(xì)胞內(nèi)的信使，通過激活NF-κB信號(hào)通路來誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)和分泌[34]，這些細(xì)胞因子被釋放到血液中并通過血液在整個(gè)身體內(nèi)循環(huán)，伴隨促炎和抗炎反應(yīng)。異黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，包括抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗血栓、抗高血壓等作用[35]。葛根素是從中藥葛根中分離的具有多重生物學(xué)活性的異黃酮類衍生物。研究表明，葛根素具有顯著的抗炎作用[36-37]。本研究表明，飼喂氧化大豆油提高肉雞血清炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-12水平，而飼糧中添加葛根素顯著提高氧化大豆油組黃羽肉雞血清抗炎細(xì)胞因子IL-10的含量，表明葛根素可以通過增加血清中抗炎細(xì)胞因子水平來抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而降低免疫應(yīng)激所造成的炎癥損傷。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加氧化大豆油顯著提高56日齡黃羽肉雞血清CORT含量，而飼糧中添加葛根素顯著降低飼喂氧化大豆油黃羽肉雞血清CORT含量。皮質(zhì)酮(CORT)的增加是判斷畜禽是否產(chǎn)生應(yīng)激的最直接指標(biāo)[38]，CORT的增加說明飼喂氧化大豆油的肉雞處于應(yīng)激狀態(tài)，CORT含量的降低說明葛根素可以緩解其應(yīng)激。IgA、IgG和IgM是介導(dǎo)體液免疫的3種主要免疫球蛋白，用于衡量機(jī)體的免疫功能，機(jī)體含量越高則免疫功能越強(qiáng)[39]。飼糧中添加葛根素顯著提高28日齡肉雞血清IgA以及56日齡血清IgA和IgG含量，表明飼糧中添加750 mg/kg的葛根素可提高肉雞的免疫功能。

飼喂氧化大豆油會(huì)增加黃羽肉雞血清皮質(zhì)酮含量并降低血清抗氧化性能而引起氧化應(yīng)激。飼糧中添加葛根素(750 mg/kg)可提高黃羽肉雞免疫功能，部分緩解氧化大豆油對(duì)黃羽肉雞抗氧化性能的不利影響。