蘇 莉，竺婷婷，師紅鈴，郭愛珍,3，陳穎鈺,3*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070;3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家動(dòng)物結(jié)核病專業(yè)實(shí)驗(yàn)室(武漢)，湖北 武漢 430070)

結(jié)核病是全球重大傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)最新統(tǒng)計(jì)，2019年全球新發(fā)結(jié)核病患者約1 000萬，病死人數(shù)達(dá)到148萬，其造成的影響對(duì)國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展和公共衛(wèi)生危害重大[1]。

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)為結(jié)核病主要病原菌，當(dāng)MTB感染宿主后，宿主調(diào)動(dòng)一系列固有免疫和適應(yīng)性免疫來抵御細(xì)菌入侵，如巨噬細(xì)胞吞噬病原體，產(chǎn)生抗菌肽、活性氧和活性氮等抗菌分子，使胞內(nèi)形成一種酸性抗菌環(huán)境或通過TLR信號(hào)和相關(guān)炎性因子促進(jìn)炎癥應(yīng)答以達(dá)到清除細(xì)菌的目的[2-3]。而結(jié)核分枝桿菌在與宿主互作的過程中，也產(chǎn)生一系列免疫逃避機(jī)制，包括抑制代謝相關(guān)反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、自噬、炎性因子產(chǎn)生等各種細(xì)胞生命進(jìn)程來規(guī)避機(jī)體的免疫清除[4]。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體為對(duì)抗病原而主動(dòng)選擇的一種程序性死亡(programmed cell death，PCD)。當(dāng)宿主感染MTB后，巨噬細(xì)胞可以通過細(xì)胞凋亡破壞有利于細(xì)菌復(fù)制的胞內(nèi)環(huán)境，從而清除胞內(nèi)菌，且較之強(qiáng)毒株，弱毒株能更好的促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。miRNA是一類微小的非編碼RNA，可通過降解mRNA或抑制翻譯來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后蛋白編碼基因的表達(dá)。當(dāng)MTB感染宿主后，機(jī)體巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜發(fā)生顯著變化。MTB通過上調(diào)或下調(diào)靶向凋亡相關(guān)基因的miRNA，抑制凋亡蛋白的合成最終改變細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此，miRNA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是影響結(jié)核分枝桿菌在機(jī)體內(nèi)存活的重要機(jī)制?，F(xiàn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染宿主細(xì)胞過程中凋亡相關(guān)的miRNA進(jìn)行總結(jié)，以期為在RNA水平上了解結(jié)核分枝桿菌的感染機(jī)制和其作為結(jié)核病治療靶標(biāo)的能力提供參考。

1 miRNA概述

miRNA是長度約為22個(gè)核苷酸片段的非編碼RNA，最初于1993年由LEE等[6]在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)。目前，在人類基因中已鑒定出超過2 500種成熟的miRNA(miRBase.org)。miRNA的生物發(fā)生通常是在細(xì)胞核中開始，經(jīng)過RNA聚合酶、Dicer酶等加工后最終在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)成為成熟的miRNA，進(jìn)而被加載到由Ago2蛋白、Tar RNA結(jié)合蛋白(TRBP)以及KH型剪接調(diào)節(jié)蛋白(KSRP)等組成的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)中[7]。RISC中miRNA 5′端的6～8個(gè)核苷酸“種子區(qū)”與靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的3′-UTR中的互補(bǔ)序列結(jié)合，最終抑制靶基因翻譯或?qū)е缕浣到?，使相?yīng)蛋白質(zhì)合成受損。但是,近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA除了與mRNA的3′-UTR結(jié)合外，也可通過其他非經(jīng)典途徑參與基因的表達(dá)調(diào)控，如與mRNA的5′-UTR結(jié)合以促進(jìn)降解作用[8]。在miRNA與靶基因相互結(jié)合的過程中，多種mRNA可以被同一個(gè)miRNA靶向結(jié)合，并且?guī)讉€(gè)不同的miRNA也可以靶向同一mRNA，這種特性進(jìn)一步增強(qiáng)了miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控多樣性。

2 MTB感染中調(diào)控凋亡的miRNA

miRNA在細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的功能，通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因如Bcl-2、Bfm、caspase-3/7、FOXO3(叉頭樣蛋白O3，forkhead box protein O3)等表達(dá)，以不同的途徑對(duì)凋亡產(chǎn)生抑制或促進(jìn)作用。如在小鼠巨噬細(xì)胞和MTB互作過程中，MTB通過激活TLR-2/MyD88/NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)表達(dá)miR-27b，繼而靶向Bag2基因最終控制細(xì)胞凋亡[9]。或是過表達(dá)miR-20b-5p，可負(fù)調(diào)控Mcl-1基因，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制MTB的胞內(nèi)生存等[10]。結(jié)核病中凋亡相關(guān)的miRNA見表1。

表1 結(jié)核分枝桿菌感染過程中與凋亡相關(guān)的miRNA

2.1 抑制細(xì)胞凋亡的miRNA

2.1.1miR-155 miR-155是一個(gè)多功能的miRNA，如可靶向SCOS1使MAPK信號(hào)通路失活，抑制肝臟星狀細(xì)胞增殖[27]，或靶向FOXO3調(diào)節(jié)妊娠高血壓[28]，其在多個(gè)疾病研究領(lǐng)域中的調(diào)控作用得到了廣泛關(guān)注。FOXO3是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子，卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡依賴于FOXO3激活。研究發(fā)現(xiàn)，在BCG感染的THP-1細(xì)胞中，miR-155表達(dá)量上調(diào)并靶向FOXO3基因，抑制了細(xì)胞的凋亡，使細(xì)菌逃避機(jī)體免疫應(yīng)答[11]。此外，LI 等[12]證明在活動(dòng)性肺結(jié)核患者中下調(diào)表達(dá)的長非編碼RNA PCEDB1-AS1可直接靶向miR-155調(diào)控細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證明了miR-155對(duì)凋亡的抑制作用以及減弱細(xì)胞清除MTB的抗菌能力。

2.1.2miR-582-5p miR-582-5p 在癌癥疾病中有大量報(bào)道。最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-582-5p可通過靶向ROCK1降低丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，從而減輕對(duì)兒童的神經(jīng)毒性作用[29]。但當(dāng)前結(jié)核病中關(guān)于miR-582-5p調(diào)控細(xì)胞凋亡的研究不多。LIU等[13]發(fā)現(xiàn)，在活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞中miR-582-5p表達(dá)量上調(diào)。將miR-582-5p模擬物轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞后，凋亡率顯著低于對(duì)照組，表明miR-582-5p可以抑制單核細(xì)胞的凋亡。叉頭樣蛋白O1(forkhead box protein O1,FOXO1)受Akt信號(hào)通路控制，可通過調(diào)節(jié)Fas配體、Bim蛋白或TNF凋亡相關(guān)的配體參與細(xì)胞的凋亡。研究者進(jìn)一步對(duì)FOXO1的分析結(jié)果顯示，miR-582-5p可靶向FOXO1下調(diào)其表達(dá)最終抑制凋亡，使MTB得以在細(xì)胞內(nèi)生存。

2.1.3miR-21 miR-21在感染MTB的宿主細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)，對(duì)機(jī)體抵抗病原體的免疫應(yīng)答起著至關(guān)重要的作用。HACKETT等[30]發(fā)現(xiàn)，miR-21靶向PFK-M抑制IL-1β表達(dá)以及糖酵解代謝，進(jìn)而減弱宿主對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抵御。MPT64是結(jié)核分枝桿菌分泌的重要抗原蛋白之一，可劑量依賴性地抑制卡介苗純蛋白衍化物誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞凋亡，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)。此外，MPT64通過激活NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)表達(dá)miR-21。與經(jīng)典的miRNA抑制靶標(biāo)表達(dá)不同，miR-21通過靶向Bcl-2的3′-UTR促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)以抑制凋亡[14]。這一通路的發(fā)現(xiàn)有助于更好的理解結(jié)核分枝桿菌的免疫逃避機(jī)制。

2.1.4miR-223 研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于健康者，活動(dòng)性結(jié)核病患者外周血巨噬細(xì)胞的凋亡率降低，并且感染MTB H37Rv株的巨噬細(xì)胞中miR-223表達(dá)顯著增加，miR-223能夠通過靶向FOXO3負(fù)反饋調(diào)節(jié)進(jìn)而抑制凋亡，過表達(dá)FOXO3則顯著逆轉(zhuǎn)了miR-223對(duì)凋亡的抑制作用[15]。這一現(xiàn)象在小鼠的體內(nèi)試驗(yàn)中也得到了證實(shí)[16]。這些結(jié)果揭示，結(jié)核分枝桿菌通過調(diào)節(jié)miR-223進(jìn)而干預(yù)宿主巨噬細(xì)胞的凋亡，幫助其在體內(nèi)擴(kuò)散。

2.1.5miR-20a-5p/miR-125a ZHANG等[17]在活動(dòng)性肺結(jié)核患者的CD14+單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)14個(gè)下調(diào)的miRNA，通過抗結(jié)核治療后，miR-20a-5p的降低可以逆轉(zhuǎn)。進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)，JNK2是miR-20a-5p的新型靶標(biāo)，調(diào)節(jié)Bim蛋白表達(dá)觸發(fā)巨噬細(xì)胞凋亡，有效清除細(xì)胞內(nèi)的MTB。另有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞敲除miR-20a后，利用結(jié)核分枝桿菌H37Ra或H2O2進(jìn)行刺激，與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率顯著增加，說明miR-20a-5p對(duì)凋亡有抑制作用[31]。核體蛋白(Sp110)主要調(diào)節(jié)針對(duì)MTB感染宿主細(xì)胞的先天性免疫應(yīng)答，過表達(dá)該基因可增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡。在結(jié)核分枝桿菌H37Ra感染的情況下，Sp110影響多個(gè)miRNA的表達(dá)，其中miR-125a被顯著下調(diào)。此外，Sp110可通過下調(diào)miR-125a促進(jìn)Bmf的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞凋亡，更有效的清除胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌[18]。

2.1.6let-7b-5p/let-7e/miR-29a let-7b-5p在MTB感染的THP-1細(xì)胞中可上調(diào)表達(dá)。抑制let-7b-5p表達(dá)顯著提高THP-1細(xì)胞凋亡率[19]。FAS基因編碼的FAS受體是細(xì)胞重要的死亡受體，與配體結(jié)合后形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物，在細(xì)胞凋亡中起調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，let-7b-5p可靶向FAS基因使細(xì)胞凋亡能力減弱，增強(qiáng)MTB的胞內(nèi)存活。SHARBATI等[20]通過與未感染的對(duì)照組相比，證實(shí)鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium，MAV)感染的巨噬細(xì)胞中半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)活性顯著降低，而let-7e與miR-29a表達(dá)量增多。靶標(biāo)預(yù)測分析與熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)指出Caspase3和Caspase7分別為has-let-7e和miR-29a的靶標(biāo)。兩者分別通過靶向作用對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)產(chǎn)生干擾。

2.2 促進(jìn)細(xì)胞凋亡的miRNA

2.2.1miR-21 雖然有研究顯示miR-21可作為細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控因子，但miR-21也存在促進(jìn)凋亡的發(fā)生，這可能與不同的試驗(yàn)背景有關(guān)。WU等[21]比較了在正常和BCG疫苗接種的小鼠中miR-21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與未感染組相比，BCG感染小鼠的肺中miR-21表達(dá)呈時(shí)間劑量依賴性增加。miR-21模擬物可增強(qiáng)BCG誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞(DC)凋亡。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-21靶向Bcl-2促進(jìn)樹突細(xì)胞凋亡。此外，在MTB感染的THP-1和RAW264.7細(xì)胞模型中miR-21-5p表達(dá)量增加并通過靶向Bcl-2和TLR4基因，也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。以上結(jié)果揭示，miR-21作為一個(gè)雙向調(diào)控凋亡的重要RNA，在結(jié)核病臨床藥物靶點(diǎn)與標(biāo)志物的選擇上擁有巨大的潛力，但同時(shí)也說明其作用機(jī)制更為復(fù)雜，有待于進(jìn)一步深入挖掘。

2.2.2miR-125b miR-125b在多個(gè)癌癥發(fā)展中均參與調(diào)節(jié)，如靶向STAT3在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中充當(dāng)腫瘤抑制因子，或調(diào)控腎癌細(xì)胞的侵襲和凋亡，亦或是通過抑制PI3K/AKT通路靶向HK2調(diào)節(jié)膀胱癌。在兒童肺結(jié)核研究中發(fā)現(xiàn)，外周血單核細(xì)胞中miR-125b表達(dá)下調(diào)。過表達(dá)miR-125b，則其靶基因RAF1表達(dá)降低且巨噬細(xì)胞凋亡率顯著增加。RAF1是凋亡相關(guān)基因之一，通過激活MEK/ERK信號(hào)通路的方式抑制細(xì)胞的凋亡。據(jù)報(bào)道，抑制miR-125b時(shí)，RAF1表達(dá)升高，細(xì)胞活性降低[23]。這一結(jié)果表明，miR-125b有助于宿主對(duì)MTB的清除。

2.2.3miR-124-3p ZHOU等[24]發(fā)現(xiàn)，感染海洋分枝桿菌(Mycobacteriummarinum,MMA)的小膠質(zhì)細(xì)胞中miR-124-3p的表達(dá)顯著降低，過表達(dá)miR-124-3p，可上調(diào)Caspase-3或下調(diào)Bcl-2和Bcl-xl促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。Stat3亦是miR-124靶標(biāo)之一，研究發(fā)現(xiàn)其可通過Stat3相關(guān)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。這些為開發(fā)高效的抗結(jié)核性腦膜炎藥物奠定基礎(chǔ)。

2.2.4miR-155 miR-155在細(xì)胞凋亡調(diào)控中也具有兩面性。ESAT-6是結(jié)核分枝桿菌早期分泌的抗原蛋白，在ESAT-6處理后的巨噬細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)增加，且誘導(dǎo)miR-155表達(dá)，兩者皆呈時(shí)間依賴性。SOCS1是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(SOCS)家族抑制劑中重要成員之一。在巨噬細(xì)胞中激活TLR2/NF-κB通路后，ESAT-6通過靶向miR-155-SOCS1途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡[25]。另據(jù)報(bào)道，感染了BCG的小鼠巨噬細(xì)胞中miR-155上調(diào)表達(dá)，而促凋亡基因PUMA、NOXA、BID、BAK1和SMAC的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)且細(xì)胞色素c與Caspase-3蛋白表達(dá)量增多。過表達(dá)miR-155可使細(xì)胞凋亡呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)，表明miR-155促進(jìn)凋亡[26]。

miR-155是當(dāng)前MTB感染細(xì)胞后相關(guān)調(diào)控通路研究中較為全面的一個(gè)miRNA，由于不同感染模型能產(chǎn)生不同效應(yīng)，因此在調(diào)控細(xì)胞凋亡中也具有雙向作用。雖然尚未對(duì)其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)完全了解，但對(duì)于結(jié)核病的診斷治療及預(yù)后仍具有重要意義。

3 miRNA在結(jié)核病中的診斷與治療

在結(jié)核病防控過程中，隨著越來越多miRNA機(jī)制被了解，將其應(yīng)用到臨床的研究也日益增多。首先，miRNA作為潛在生物標(biāo)志物有效區(qū)分潛伏性結(jié)核患者、活動(dòng)性結(jié)核患者和健康者已被廣泛報(bào)道。在一項(xiàng)活動(dòng)性肺結(jié)核患者和健康供體的外周血樣本檢查研究中發(fā)現(xiàn)，miR-199b-5p和miR-582-5p表達(dá)明顯失調(diào)，進(jìn)一步通過ROC曲線評(píng)估診斷性能表明這些miRNA有望成為活動(dòng)性結(jié)核病診斷生物標(biāo)志物[32]。LATORRE等[33]提出了一種診斷結(jié)核病的新型全血miRNA標(biāo)志(hsa-miR-150，hsa-miR-21，hsa-miR-29c和hsa-miR-194)，且具有91.21%的敏感性(90.8%～91.62%)和87.95%的特異性(87.37%～88.52%)。對(duì)于兒童結(jié)核病，也有研究表明miRNA可作為其早期診斷的有效生物標(biāo)志物。其次，在疾病治療方面，對(duì)于異常表達(dá)的miRNA可利用其抑制物或模擬物恢復(fù)正常表達(dá)。這種新型的干預(yù)策略通過對(duì)單個(gè)基因或者整個(gè)細(xì)胞進(jìn)程產(chǎn)生影響從而達(dá)到治療疾病的目的。MOORE等[34]通過利用聚乳酸-乙醇酸納米粒子體內(nèi)遞送miR-223模擬物，抑制了巨噬細(xì)胞融合的形成，證明負(fù)載miR-223模擬物的納米顆粒為可作為巨噬細(xì)胞融合的治療抑制劑。此外，將外泌體樣納米囊泡攜帶miRNA-150傳遞至效應(yīng)T細(xì)胞，也可以抑制小鼠接觸敏感性[35]。因此，miRNA通過外源操作以增強(qiáng)宿主抵抗微生物感染的免疫力并提供潛在新型抗菌方法具有極大潛能。但是，關(guān)于miRNA最適合的傳遞途徑以及藥物安全性仍有待研究。

4 結(jié)束語

當(dāng)前結(jié)核病的診斷治療對(duì)全球公共衛(wèi)生依舊是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，需要更為高效精準(zhǔn)的治療方案。miRNA的差異表達(dá)作為診斷結(jié)核病的生物標(biāo)志物的潛力以及其靶向宿主基因調(diào)節(jié)宿主蛋白合成作為新型治療靶標(biāo)的研究日益增多，但依舊存在一定問題。有研究通過將結(jié)核病、結(jié)節(jié)病以及健康患者的全血進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組比較，結(jié)核病、結(jié)節(jié)病組的miRNA差異表達(dá)顯著，但是結(jié)核病、結(jié)節(jié)病2組內(nèi)的miRNA表達(dá)譜相似度高[36]。故而利用miRNA作為診斷的生物標(biāo)志物時(shí)要注意病理或病原相似的疾病。另一方面，許多miRNA共同對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制或促進(jìn)作用，能否將多個(gè)功能類似的miRNA聯(lián)合應(yīng)用，以及聯(lián)合應(yīng)用中共同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究目前較少。有些miRNA如miR-155或miR-21在凋亡調(diào)控中還具有兩面性，需結(jié)合實(shí)際，具體問題具體分析。因此，作為治療結(jié)核病的新興領(lǐng)域，未來miRNA的臨床應(yīng)用需要我們進(jìn)一步更深入的探索與研究。