張佩琪,周鵬飛，葉正欽，劉進(jìn)輝，王宜平，紀(jì)春曉

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙410000)

雞馬立克病(Marek's disease,MD)一直都是影響家禽健康的主要疾病,該疾病的嚴(yán)重程度不同，范圍從慢性周圍神經(jīng)病變(以脫髓鞘和癱瘓為特征)到急性癌癥，其中存在多個(gè)內(nèi)臟淋巴瘤，是世界范圍內(nèi)家禽經(jīng)濟(jì)上最廣泛的重要疾病之一[1]。20世紀(jì)60年代后期以來，規(guī)?；募仪萆a(chǎn)系統(tǒng)依賴于疫苗來控制疾病，但隨著馬立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)毒力持續(xù)進(jìn)化并出現(xiàn)更具毒力的致病型，使現(xiàn)有的疫苗保護(hù)力不足[2-3]。MDV感染雞后會形成快速發(fā)病的淋巴瘤，導(dǎo)致雞群病死率顯著上升[4]，所以在研發(fā)MDV新型疫苗的基礎(chǔ)上，尋找有效的抗淋巴瘤藥物也是降低養(yǎng)殖場經(jīng)濟(jì)損失和提高綜合防控能力的途徑。MDCC-MSB-1 細(xì)胞作為 MDV 誘導(dǎo)產(chǎn)生的淋巴瘤細(xì)胞系，當(dāng)接種到易感雞中時(shí)還可以誘導(dǎo)腫瘤，是廣泛應(yīng)用的抗 MD 腫瘤藥物研究模型[5]。

大蒜(Alliumsativum)中的烯丙基硫化合物具有預(yù)防和/或控制癌癥的生物效應(yīng)，其中二烯丙基二硫化物(DADS)占大蒜油中脂溶性硫化物總量的40%～60%，具有更穩(wěn)定的理化性質(zhì)，且與水溶性烯丙基硫化物相比，脂溶性硫化物是一種更有效的抗腫瘤細(xì)胞增殖劑[6]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，DADS通過Bax觸發(fā)的線粒體途徑在人癌細(xì)胞中引起胱天蛋白酶依賴性細(xì)胞凋亡[7]，LU等[8]也發(fā)現(xiàn)DADS可以激活線粒體途徑誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡。此外，據(jù)報(bào)道，DADS通過mTOR途徑誘導(dǎo)K562和NB4髓樣白血病細(xì)胞系的凋亡和自噬，F(xiàn)as/FasL途徑的激活可能在DADS誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡中起重要作用[9-10]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、培養(yǎng)基及主要試劑MDCC-MSB-1細(xì)胞株購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。DADS購自Alfa Aesar(純度為80%)。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素、CCK-8溶液、吖啶橙、JC-1染色試劑盒(恩樾生物科技有限公司)。Aneexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物有限公司)。HRP標(biāo)記山羊抗兔，Anti-P53 antibody(Servicebio)。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Q-PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.2 MDCC-MSB-1細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%雙抗(100 U/mL青霉素和鏈霉素)和2 mmol/LL-谷氨酰胺的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，1 000 r/min離心5 min得到細(xì)胞沉淀。

1.3 藥物準(zhǔn)備與處理DADS和Tween-80以1∶2的比例配制成母液，母液的濃度為18 230 μmol/L，用0.9%無菌生理鹽水稀釋后-20℃保存?zhèn)溆谩ADS作用于對數(shù)生長期的MDCC-MSB-1細(xì)胞，使藥物終濃度為0,50,100,150 μmol/L，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

1.4 AO染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為6×105個(gè)/孔，接種于12孔板，DADS處理24 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至 106個(gè)/mL，取適量的細(xì)胞懸液，加入吖啶橙(acridine orange stain,AO)，使AO終質(zhì)量濃度為 8.5～17.0 mg/L，輕輕混勻，室溫避光染色15～20 min，滴加于載玻片上并加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡率DADS處理MDCC-MSB-1細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，2 000 r/min離心5 min，500 μL 預(yù)冷的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入13 μL Annexin V-FITC混勻后加入13 μL PI再次混勻，室溫避光反應(yīng)15 min。2 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.6 JC-1染色法檢測線粒體膜電位的變化取對數(shù)生長期的MDCC-MSB-1細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/mL，接種于6孔板，設(shè)置陰性對照和陽性對照。陰性對照：收集細(xì)胞后直接重懸于JC-1染色緩沖液。陽性對照：用10 μmol/L CCCP處理細(xì)胞20 min后，離心收集細(xì)胞后加入JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻并在37℃孵育20 min，染色完成后4℃ 600×g離心4 min，收集細(xì)胞用JC-1染色緩沖液洗滌2次，最后重懸于JC-1染色緩沖液。

1.7 Western blot檢測P53蛋白表達(dá)用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，總蛋白經(jīng)變性、電泳、轉(zhuǎn)膜后，將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下?lián)u床上用5%脫脂牛奶(0.5% TBST配制)封閉1 h。按比例稀釋一抗(P53兔抗)，4℃孵育過夜，二抗(山羊抗兔)用TBST稀釋3 000倍，室溫下孵育1 h。ECL顯影試劑溶液與膜充分反應(yīng)1～2 min后開始曝光。將曝光膠片進(jìn)行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.8 Caspase-3和Caspase-9活性檢測用反應(yīng)緩沖液梯度稀釋10 mmol/LpNA標(biāo)準(zhǔn)品，測定405 nm吸光度D值，以D值為橫軸，對應(yīng)的pNA濃度為縱軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)活性測定說明書設(shè)置反應(yīng)體系，Caspase-3特異水解的多肽底物為DEVD-pNA，Caspase-9特異水解的多肽底物為IETD-pNA。蓋緊96孔板并用封口膜密封，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，觀察肉眼可見顏色變黃時(shí)的D405值為0.2，此時(shí)可上酶標(biāo)儀檢測，根據(jù)公式計(jì)算Caspase活性增加的百分比。Caspase活性增加的百分比= 樣品試驗(yàn)組/對照組×100%。

1.9 Q-PCR檢測Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達(dá)水平根據(jù)GenBank中雞β-actin(L08165)、Caspase-3(NM20475.1)和Caspase-9(AY057940.1)的基因序列，應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，引物由擎科生物有限公司合成。用TRIzol法提取總RNA，根據(jù)說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL：1 μL cDNA，內(nèi)參上、下引物各1 μL，10 μL 2×taq mix，剩下的用ddH2O補(bǔ)足。Q-PCR擴(kuò)增條件：94℃ 30 s;94℃ 5 s，60℃ 30s，共30個(gè)循環(huán)。

表1 Caspase-3、Caspase-9以及內(nèi)參引物序列

2 結(jié)果

2.1 DADS誘導(dǎo)MDCC-MSB-1細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)觀察AO染色觀察DADS作用MDCC-MSB-1細(xì)胞24 h后細(xì)胞的凋亡形態(tài)變化(圖1)。空白組細(xì)胞質(zhì)均染呈綠色，胞漿豐富，細(xì)胞界限清晰，隨著DADS濃度的升高，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)碎片增多，呈顆粒狀。

A.0 μmol/L;B.50 μmol/L;C.100 μmol/L;D.150 μmol/L

2.2 DADS誘導(dǎo)MDCC-MSB-1細(xì)胞凋亡加劇DADS作用MDCC-MSB-1細(xì)胞24 h后對細(xì)胞凋亡的影響見圖2。隨著DADS濃度的升高，(annexin V-FITC)+/PI+區(qū)域和(annexin V-FITC)+/PI-區(qū)域的熒光信號越來越強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性增多。

A.0 μmol/L;B.50 μmol/L;C.100 μmol/L;D.150 μmol/L。A～D.流式細(xì)胞圖;E.柱狀圖。*示P<0.05, **示P<0.01。下同

2.3 DADS誘導(dǎo)MDCC-MSB-1細(xì)胞線粒體膜電位下降JC-1通過正常細(xì)胞(0 μmol/L)的線粒體膜極性進(jìn)入線粒體內(nèi)，并因濃度升高而形成發(fā)射紅色熒光的多聚體，主要集中在P2象限，隨著DADS濃度的升高，線粒體跨膜電位去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，濃度降低，逆轉(zhuǎn)為發(fā)射綠色熒光的單體形式，從紅色向綠色進(jìn)發(fā)(P2轉(zhuǎn)向P4象限)(圖3)。

A.0 μmol/L;B.50 μmol/L;C.100 μmol/L;D.150 μmol/L

2.4 DADS誘導(dǎo)MDCC-MSB-1細(xì)胞P53凋亡蛋白表達(dá)增多P53是重要的腫瘤抑制基因，參與細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。DADS在作用MDCC-MSB-1細(xì)胞24 h 后可誘導(dǎo)P53蛋白表達(dá)水平的增多(圖4)。

A.印跡圖；B.柱狀圖

2.5 DADS誘導(dǎo)細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9活性增強(qiáng)DADS作用MDCC-MSB-1細(xì)胞24 h后Caspase-3和Caspase-9的活性百分比呈極顯著性增高(P<0.01)(圖5)，Caspase-9上調(diào)幅度更大，可能是因?yàn)榧せ頒aspase-9的上游調(diào)控因子更為廣泛，除線粒體凋亡途徑外可能還受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等通路的影響。

圖5 DADS作用MDCC-MSB-1細(xì)胞24 h后Caspase-9、Caspase-3蛋白活性增加百分比變化

2.6 DADS上調(diào)細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9 mRNA 表達(dá)水平所有3種濃度的DADS均誘導(dǎo)MDCC-MSB-1細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9 mRNA的相對表達(dá)增加，且Caspase-9 mRNA相對表達(dá)量的變化呈劑量依賴性(圖6)。

圖6 DADS誘導(dǎo)MDCC-MSB-1細(xì)胞Caspase-9(左)和Caspase-3(右)mRNA的相對表達(dá)量的變化

3 討論

MDV在長期的潛伏階段躲避了免疫系統(tǒng)的攻擊，入侵淋巴細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞，引發(fā)免疫抑制和繼發(fā)性感染，導(dǎo)致雞群較高的發(fā)病率和病死率[11-12]。DADS作為廣泛的腫瘤抑制劑，對MD的治療還少見報(bào)道。我們前期的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DADS可以誘導(dǎo)MDCC-MSB-1細(xì)胞活力的降低，并引起細(xì)胞周期阻滯(未發(fā)表結(jié)果)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)DADS具有抑制MDV在雞體內(nèi)的復(fù)制作用[13]，說明DADS可能是抗馬立克病的候選藥物，有繼續(xù)研究的價(jià)值。

細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)清除腫瘤細(xì)胞，遏制腫瘤形成和發(fā)展的重要機(jī)制。線粒體通過氧化磷酸化提供細(xì)胞所需的能量，細(xì)胞對線粒體的依賴也成為細(xì)胞的致命弱點(diǎn)，稱為細(xì)胞凋亡重要生物過程的主要調(diào)節(jié)點(diǎn)[14]，且線粒體在 MDV 誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和隨后的淋巴瘤形成(如雞的 MD 發(fā)育)中不可或缺[15]。p53 是重要的腫瘤抑制基因，能調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，有研究發(fā)現(xiàn) MDV 編碼的主要致瘤因子 meq 蛋白通過與宿主細(xì)胞中 p53 和 p21 蛋白相互作用來影響致瘤過程[16]，Meq 的外源表達(dá)能抑制 p53 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性和細(xì)胞凋亡[17]，所以增強(qiáng) p53 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力顯得尤其重要。在凋亡細(xì)胞中，被激活的 p53 會快速移位到線粒體外膜并與膜上的 Bcl2 家族成員結(jié)合，增加膜的通透性，使線粒體內(nèi)的促凋亡蛋白(細(xì)胞色素 c)釋放進(jìn)入胞漿，激活 Caspase 家族啟動序列性酶解死亡程序?qū)е?DNA 降解[18]。本試驗(yàn)在DADS 處理的 MDCC-MSB-1 細(xì)胞中也檢測到 p53 蛋白的表達(dá)增多，線粒體膜電位的喪失，以及 Caspase-9 和 Caspase-3 基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白活性的上調(diào)。因此，推測 DADS 通過 p53 介導(dǎo)的線粒體內(nèi)源性凋亡途徑來促進(jìn) MDCC-MSB-1 細(xì)胞的凋亡，但是否同時(shí)存在別的凋亡通路還需進(jìn)一步證實(shí)。