崔鎮(zhèn)海，金美英，李宗洋，谷 天，錢海峰，陶 悅，李馳坤，尹宏兵*，趙文海

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第三臨床醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是因股骨頭缺少血液供應(yīng)，繼而導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變，股骨頭塌陷，引起髖關(guān)節(jié)疼痛和活動(dòng)受限[1]。雖然在臨床上應(yīng)用中藥治療股骨頭壞死已經(jīng)得到了一定的成效，但其機(jī)理尚未明確。為了深入研究ONFH的病因及防治方法，故需要可行、簡(jiǎn)單、成功率較高的ONFH的動(dòng)物模型。以往國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者選擇四足類動(dòng)物(如大鼠、兔、犬、豬、羊)來(lái)建模，其中大鼠模型獲取方便、重復(fù)性高，且通過(guò)使用激素來(lái)建立激素性股骨頭壞死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH)動(dòng)物模型相對(duì)可控，故此次選擇了SD大鼠。由于大鼠股骨頭直徑小，并盡可能模擬人類的站立行走，加大股骨頭負(fù)重，故建立直立+單純激素的模型，繼而通過(guò)影像學(xué)、生化血清實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)綜合評(píng)價(jià)出股骨頭壞死的病情變化，為早期股骨頭缺血性壞死的治療提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50只雄性SD大鼠(SPF級(jí))，體質(zhì)量100～130 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司(許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001)。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，5只/籠，正常喂食水，自然光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)。后期作為試驗(yàn)補(bǔ)充再次購(gòu)進(jìn)SD大鼠10只(SPF級(jí))，體質(zhì)量350～400 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司(許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001)。剛購(gòu)進(jìn)動(dòng)物作為空白對(duì)照組，正常飼養(yǎng)。試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處置符合2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1.2 藥物及主要試劑注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(注冊(cè)證號(hào)：HC20160039，規(guī)格：40 mg×10瓶，產(chǎn)品批號(hào)：1E8170)，南光化學(xué)制藥股份有限公司產(chǎn)品。戊巴比妥鈉溶液、生理鹽水、蒸餾水、動(dòng)物飼料、墊料、飼養(yǎng)籠、操作臺(tái)、試劑盒，均由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。蘇木精、伊紅、中性樹(shù)脂封固劑等輔助試劑由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供。

1.3 主要儀器TDL-5M醫(yī)用離心機(jī)由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。CT使用X射線計(jì)算機(jī)斷層攝影設(shè)備(TOSHIBA)，型號(hào)：ActivionTSX-031A，最多輸出功率(120 kV 300 mA;135 kV 260 mA)由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.4 動(dòng)物分組及造模按照體質(zhì)量隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組：空白組12只，激素組16只，激素+直立組16只，直立組16只。試驗(yàn)于2019年7月10日-2019年12月21日在長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心完成，采用激素+直立誘導(dǎo)大鼠激素性股骨頭壞死模型。

激素組和激素+直立組、直立組動(dòng)物按體質(zhì)量用3%戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg)腹腔注射麻醉后，將其雙前肢剪毛和清潔后，用碘伏消毒大鼠上肢皮膚，取前臂近端1/3處橫向切開(kāi)皮膚，剝離筋膜和肌肉，暴露三角肌下血管神經(jīng)束，并用絲線結(jié)扎，在結(jié)扎處遠(yuǎn)端用咬骨鉗咬斷肱骨，再用剪刀剪斷皮膚、肌肉、血管和神經(jīng)，使上肢截?cái)唷Ｔ賹⒓∪?、筋膜、皮膚逐層縫合，最后再縫合處涂青霉素防止感染。使大鼠逐步抬高飲食。

正常飼養(yǎng)2個(gè)月后，臀肌注射激素藥物40 mg/kg，每日1次，連續(xù)6 d。激素組注射激素時(shí)間、劑量同模型組。直立組、正常組同時(shí)間注射同劑量生理鹽水。

1.5 標(biāo)本制作造模后正常飼養(yǎng)3個(gè)月后，分批麻醉(20%烏拉坦溶液，0.5 mL/100g)，拍CT片。腹主動(dòng)脈取血，加0.1%肝素抗凝，取1 mL全血用血流變儀測(cè)定其全血黏度。3 000 r/min離心15 min，取1 mL血漿，測(cè)定其血漿黏度；血漿剩余部分于-20℃凍存?zhèn)溆?；取大鼠雙側(cè)股骨頭、肝臟，放置于10%甲醛溶液中固定，備用。后期利用乙醇脫水，常規(guī)石蠟切片(片厚3～5 μm)，包埋，依次做好標(biāo)記。脫蠟和水化后常規(guī)蘇木精伊紅染色，光鏡下觀察。

1.6 測(cè)定指標(biāo)

1.6.1一般觀察 造模后即開(kāi)始觀察動(dòng)物精神、毛發(fā)、飲食、二便、體質(zhì)量及活動(dòng)狀況。

1.6.2死亡現(xiàn)象觀察 記錄動(dòng)物死亡時(shí)間，并分析死因，統(tǒng)計(jì)各組的最終死亡數(shù)量。

1.6.3血清生化及血液流變學(xué)檢查 造模后取血，以測(cè)定血清生化(高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHO))及血液流變學(xué)(全血3.0，30.0，100.0，180.0)數(shù)值。

1.6.4病理組織學(xué)檢查 光鏡下觀察組織學(xué)切片，肝組織細(xì)胞的變化以及骨細(xì)胞壞死病理改變以空骨陷窩率體現(xiàn)，即在100倍放大率下，任選5個(gè)視野，經(jīng)ipp6.0圖像分析軟件計(jì)算單位視野骨小梁面積百分比和空骨陷窩所占百分比。

1.6.5CT觀察 分別于用藥后8，16周，分批取雙髖蛙式位固定于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臺(tái)上，進(jìn)行CT檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 一般形態(tài)觀察結(jié)果4組動(dòng)物股骨頭仍保持圓形，但激素組和激素+直立組動(dòng)物的股骨頭色澤灰暗，局部充血明顯，骨質(zhì)松脆，易于鑿開(kāi)，軟骨面光滑，軟骨未見(jiàn)明顯塌陷，切面肉眼觀察未見(jiàn)明確的壞死灶。

2.2 血清生化及血液流變學(xué)(試驗(yàn)對(duì)血脂各項(xiàng)指標(biāo)的影響)

2.2.1血清生化指標(biāo)的變化 結(jié)果見(jiàn)表1。HDL分析結(jié)果顯示，直立組與直立+激素組的標(biāo)準(zhǔn)差相比較小，說(shuō)明相同造模條件下，予以直立或增加直立方法誘導(dǎo)建立模型的方法的穩(wěn)定性更好；激素組P<0.01，具有顯著性差異，說(shuō)明激素可以引起HDL的增高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；直立+激素組的標(biāo)準(zhǔn)差相比較大，說(shuō)明相同造模條件下，予以聯(lián)合方法誘導(dǎo)建立模型的方法的穩(wěn)定性欠佳，空白組數(shù)值分別與其余3組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LDL分析結(jié)果顯示，4組標(biāo)準(zhǔn)差中直立+激素組的數(shù)值相比較大，說(shuō)明相同造模條件下，予以聯(lián)合方法誘導(dǎo)建立模型的方法的穩(wěn)定性欠佳；試驗(yàn)組與空白組相比較，P值均>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CHO分析結(jié)果所示，直立組與直立+激素組的均值較高，說(shuō)明通過(guò)誘導(dǎo)直立狀態(tài)對(duì)CHO的影響較大，直立+激素組的標(biāo)準(zhǔn)差相比較大，說(shuō)明相同造模條件下，予以聯(lián)合方法誘導(dǎo)建立模型的方法的穩(wěn)定性欠佳；試驗(yàn)組P值均>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；組間對(duì)照中，激素組與空白組對(duì)照，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.05)。TG分析結(jié)果顯示，直立+激素組的標(biāo)準(zhǔn)差相比最小，說(shuō)明相同造模條件下，予以聯(lián)合方法誘導(dǎo)建立模型的方法的穩(wěn)定性最佳，組間對(duì)照中空白組分別于激素組及直立+激素組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白組與直立組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 試驗(yàn)對(duì)血脂指標(biāo)的影響

2.2.2試驗(yàn)對(duì)血液流變學(xué)的影響 結(jié)果見(jiàn)表2。血流變?nèi)?.0分析結(jié)果顯示，激素組與直立+激素組的標(biāo)準(zhǔn)差相比較小，說(shuō)明相同造模條件下，予以激素及聯(lián)合激素方法誘導(dǎo)建立模型的方法的穩(wěn)定性更好；激素組與直立+激素組的均值相對(duì)較小，可見(jiàn)本方式對(duì)以上2組全血3.0數(shù)值的影響較大，組間對(duì)照直立+激素組P<0.05，具有顯著性差異，說(shuō)明直立聯(lián)合激素對(duì)全血3.0組有顯著影響，且P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余試驗(yàn)組P值均>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血流變?nèi)?0.0分析結(jié)果顯示，激素組與直立+激素組的標(biāo)準(zhǔn)差相比較小，說(shuō)明相同造模條件下，予以激素方法誘導(dǎo)建立模型的方法的穩(wěn)定性更好；組間比較各試驗(yàn)組P值均>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血流變?nèi)?00.0分析結(jié)果顯示，直立+激素組均值明顯高于其余3組，說(shuō)明本方法對(duì)全血100.0的影響較大，4組標(biāo)準(zhǔn)差中直立+激素組的數(shù)值最大，且與其他組差距明顯，說(shuō)明相同造模條件下，予以直立+激素方法誘導(dǎo)建立模型的方法的穩(wěn)定性較差；組間對(duì)照激素組P值<0.05，具有顯著性差異，說(shuō)明激素對(duì)全血100.0組有顯著影響，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，其他試驗(yàn)組P值均>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血流變?nèi)?80.0分析結(jié)果顯示，4組標(biāo)準(zhǔn)差中激素組的數(shù)值相比較小，說(shuō)明相同造模條件下，予以激素方法誘導(dǎo)建立模型的方法的穩(wěn)定性更好；且激素組的均值相對(duì)較小，說(shuō)明通過(guò)單純使用激素對(duì)全血180.0組有顯著影響，且具有意義，P<0.05，組間對(duì)照其他試驗(yàn)組P值均>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 試驗(yàn)對(duì)血液流變學(xué)的影響

結(jié)果表明，單純運(yùn)用直立方式建立大鼠股骨頭壞死較為困難，且對(duì)血液流變學(xué)及血脂影響較小，效果不佳；使用激素及激素聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠直立建立大鼠股骨頭壞死模型且對(duì)有一定效果，對(duì)血液流變學(xué)及血脂均具有一定影響；而激素聯(lián)合直立建立大鼠股骨頭壞死在4組里效果最佳，對(duì)血液流變學(xué)及血脂影響最大。

2.3 影像學(xué)變化CT結(jié)果所示，在試驗(yàn)進(jìn)行第8周時(shí)，每組取2只大鼠，4組動(dòng)物均未見(jiàn)骨缺血壞死表現(xiàn)。第16周時(shí)，空白組及直流組，均未見(jiàn)骨缺血壞死病變。激素組及激素+直立組，骨小梁密度不均勻增粗，斑片狀高密度硬化帶影,邊緣模糊，股骨頭前上部硬化周圍和邊緣部出現(xiàn)類圓形低密度區(qū),局部骨質(zhì)疏松(圖1)。

圖1 CT掃描橫斷面(左，16周)和矢狀位(右，16周)

2.4 病理學(xué)變化

2.4.1肝臟變化 小葉中央靜脈附近有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉中央?yún)^(qū)肝細(xì)胞(水樣變性)，胞漿疏松化，肝竇變窄(圖2A)。小葉中央靜脈增寬，小葉中央?yún)^(qū)肝細(xì)胞胞漿淡染，少量肝細(xì)胞脂肪變性，肝索排列基本整齊(圖2B)。小葉中央靜脈居中，肝細(xì)胞索排列整齊，以小葉中央靜脈為中心，向四周放射狀，匯管區(qū)可見(jiàn)，動(dòng)脈、靜脈、膽管(圖2C，D)。

A.激素+直立組；B.激素組;C.直立組;D.空白組

2.4.2空骨陷窩率 使用3%戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg)腹腔注射麻醉處死4組大鼠，經(jīng)后外側(cè)切口取雙側(cè)股骨頭，剔除股骨頭周圍肌肉和軟組織后，便可從感官上看出股骨頭外形有著細(xì)微改變和關(guān)節(jié)軟骨面變化，而后用刀將股骨頭從冠狀面劈為兩半，放到10%中性甲醛中固定7 d后再在5%硝酸溶液中浸泡3 d進(jìn)行脫鈣。使用針灸的針扎入股骨頭中，可完全扎入視為脫鈣完全。然后在用梯度乙醇脫水。經(jīng)乙醇常規(guī)梯度脫水和常規(guī)石蠟包埋，把股骨頭放到切片機(jī)上切出4 μm的連續(xù)切片，然后將切片后脫蠟，用蘇木精-伊紅進(jìn)行常規(guī)染色，將切片用OLYMPUSBX61正置顯微鏡分析切片結(jié)構(gòu)。利用高倍鏡鏡片分析每一切片，選擇5個(gè)觀察點(diǎn)統(tǒng)計(jì)出數(shù)量為50個(gè)骨細(xì)胞的空骨陷窩陽(yáng)性數(shù)，進(jìn)行空骨陷窩率計(jì)算。病理學(xué)把衡量激素性股骨頭缺血性壞死的確診技術(shù)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)是：在骨小梁中存在大量空骨陷窩的形成或者核固縮現(xiàn)象，存在著伴有周圍骨髓細(xì)胞壞死的現(xiàn)象，而試驗(yàn)中具有這種表現(xiàn)至少1處壞死病癥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可確診為股骨頭壞死(表3，圖3，4)。

A.空白組;B.直立組;C激素組;D.激素+直立組

表3 試驗(yàn)對(duì)股骨頭結(jié)構(gòu)的影響 %

結(jié)果說(shuō)明，單純建立直立或者激素動(dòng)物模型，相對(duì)空白組而言無(wú)明顯差異，而使用激素聯(lián)合直立2種方式建立模型的方式對(duì)模型動(dòng)物的空骨陷窩率及骨小梁面積百分比均有較大影響。

A.空白組;B.直立組;C激素組;D.激素+直立組

3 討論

據(jù)報(bào)道，激素性股骨頭壞死有著較高的致殘率，JONES等[2]發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素會(huì)誘發(fā)ONFH，但截止目前學(xué)者們還沒(méi)有一致的發(fā)病機(jī)制的研究。因此，能夠制備理想的ONFH的動(dòng)物模型，是探究ONFH病因及發(fā)病機(jī)制十分重要的手段，也是為今后臨床工作提供基礎(chǔ)依據(jù)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前建立股骨頭壞死動(dòng)物模型的方法主要有：直立法[3-5]、物理法[6-7]、化學(xué)法[8]和非創(chuàng)傷法[9-11]。

激素引起ONFH的機(jī)制尚未明確，目前3種假說(shuō)如脂肪代謝紊亂、血管內(nèi)凝血和骨質(zhì)疏松。激素影響內(nèi)分泌調(diào)節(jié)紊亂導(dǎo)致局部血脂增高，易堵塞微小血管，進(jìn)而導(dǎo)致ONFH。在足量的激素刺激下，股骨頭局部容易發(fā)生高凝狀態(tài)及血管內(nèi)凝血，很有可能導(dǎo)致ONFH。目前，醫(yī)學(xué)界對(duì)于ONFN的病理演變過(guò)程已具備一定的認(rèn)識(shí)，一般認(rèn)為，首先出現(xiàn)骨細(xì)胞的壞死，繼而通過(guò)血管再生，從而出現(xiàn)新骨的形成與死骨的吸收[12]。ONFN的病理改變主要是脂肪代謝紊亂。

目前,在激素造模動(dòng)物試驗(yàn)中，激素種類的選取以及激素用量尚未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，隨之導(dǎo)致的動(dòng)物模型壞死部位亦不確定性；當(dāng)前選擇四足動(dòng)物在ONFH建模中運(yùn)用較多，但其四足動(dòng)物與人類負(fù)重方式有著明顯的差異，因此如何使其與人類負(fù)重方式相接近需要進(jìn)一步探索，并通過(guò)一些人為干預(yù)采取雙足站立或許是一種解決方式。

在本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組(激素+直立組)用藥8周后未見(jiàn)股骨頭塌陷等;用藥16周后出現(xiàn)骨小梁密度不均勻增粗，斑片狀高密度硬化帶影,邊緣模糊，股骨頭前上部硬化周圍和邊緣部出現(xiàn)類圓形低密度區(qū),局部骨質(zhì)疏松。本研究也存在著一些不足：一方面研究的樣本量相對(duì)較少，應(yīng)用2～4倍的激素劑量后有個(gè)別出現(xiàn)不良反應(yīng)，因而在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析時(shí)說(shuō)服力較弱；另一方面試驗(yàn)組觀察的時(shí)間較短，不利于動(dòng)態(tài)觀察ONFH的病理和影像學(xué)變化。此外，四足動(dòng)物造模的最大限制在于其與人類髖關(guān)節(jié)負(fù)重模式有很大不同，因?yàn)榇笫笤诨紓?cè)疼痛情況下會(huì)采取保護(hù)性肢體回縮，同時(shí)給模型的建立提升了難度。