陸俞萍，肖 婉，房婉萍，強(qiáng) 勝，陳世國(guó)*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草研究室，南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所，南京 210095）

茶樹Camelliasinensis(L.) O.Kuntze是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]。我國(guó)的茶區(qū)主要分布在西南、華南、江北和江南地區(qū)，江南茶區(qū)因具有適宜茶樹生長(zhǎng)的溫度、濕度、土壤等生態(tài)條件，茶樹品種豐富，茶葉年產(chǎn)量約占全國(guó)總產(chǎn)量的30%，遠(yuǎn)高于其他3個(gè)產(chǎn)茶區(qū)，其中江蘇、浙江和安徽省是華東地區(qū)重要產(chǎn)茶區(qū)[2]。在茶園生產(chǎn)管理中，除病蟲害外，茶園雜草也是影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的一大影響因子[3]。茶園雜草會(huì)與茶樹爭(zhēng)肥、爭(zhēng)水、爭(zhēng)光[4,5]，間接影響茶樹的生長(zhǎng)發(fā)育，最終影響茶葉的品質(zhì)與產(chǎn)量，降低茶葉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。傳統(tǒng)人工除草或機(jī)械除草等方式缺乏高效性和可持續(xù)性，化學(xué)除草劑雖具有快速、高效、低成本等優(yōu)點(diǎn)，廣受農(nóng)民們的依賴，但廣泛使用會(huì)引發(fā)農(nóng)殘?jiān)黾?，雜草抗藥性上升，生物多樣性降低，水土流失加劇等諸多食品安全和生態(tài)環(huán)境問(wèn)題[6]。因此，生物防治具有良好的發(fā)展前景。生物防治就是利用生物種與種之間的關(guān)系，以某種生物去抑制另外一種生物的生長(zhǎng)繁殖的方法[7]。其中，開(kāi)發(fā)低毒、環(huán)保和高效的生物除草劑是最重要的方向。

生物除草劑是指利用自然界中的生物（包括動(dòng)物、植物和微生物）或其組織、代謝產(chǎn)物工業(yè)化生產(chǎn)的用于除草的生物制劑。根據(jù)美國(guó)環(huán)保署（Environmental protection agency，EPA）對(duì)生物農(nóng)藥的定義可將生物除草劑分為兩大類：一類是直接利用完整生物體或者部分活體組織開(kāi)發(fā)的制劑，稱為微生物除草劑；另一類是利用生物的次生代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)的制劑，稱為生物源除草劑。

目前，全世界已經(jīng)成功開(kāi)發(fā)的生物除草劑產(chǎn)品有 20 余個(gè)品種，其中Biochon、StumpOut、Camperico、雙丙氨膦鈉和Myco-Tech Paste已經(jīng)成為國(guó)際化的產(chǎn)品[8,9]。近年來(lái)，微生物除草劑因具有資源豐富、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，被人們廣泛關(guān)注，且已經(jīng)取得了一定成果。其中利用最多的是植物病原真菌，在全球范圍內(nèi)，市場(chǎng)上現(xiàn)有的13種源自微生物或天然分子的生物除草劑中有9種為真菌性生物除草劑[10,11]。目前，文獻(xiàn)已報(bào)道有近40多個(gè)屬，80多個(gè)種的真菌微生物具有防控雜草的能力，已經(jīng)或正在被考慮開(kāi)發(fā)為微生物除草劑[9]，包括交鏈孢菌屬Alternaria、殼單孢菌屬Ascochyta、尾孢霉屬Cercospora、刺盤孢菌屬Colletotrichum、葉黑粉菌屬Entyloma、鐮刀菌屬Fusarium、疫霉屬Phytophthora、柄銹菌屬Puccinia和核盤菌屬Sclerotinia等9個(gè)屬[12,13]。

本研究從利用真菌防控雜草的思路出發(fā)，篩選出可在茶園等經(jīng)濟(jì)作物田安全使用并具有較好防草效果的候選生防菌。通過(guò)采集江蘇、浙江和安徽3省共16個(gè)茶園危害嚴(yán)重的雜草患病植株，記錄發(fā)病癥狀，并分離雜草中的病原菌。通過(guò)柯赫氏法則和菌餅回接宿主驗(yàn)證，從采集的雜草患病樣本中分離篩選出致病力較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌株，利用形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定技術(shù)確定優(yōu)勢(shì)菌株的種類。查詢優(yōu)勢(shì)菌株的相關(guān)研究報(bào)道，最終確定茶園雜草生防菌的候選菌株，為將來(lái)開(kāi)發(fā)茶園生物除草劑提供資源儲(chǔ)備和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

茶園主要雜草病原樣本的采集：于2017年10月和2018年的6—11月在江蘇、浙江和安徽省的16個(gè)茶園，每個(gè)茶園按“W”型觀察30個(gè)田塊、每個(gè)田塊5 m×5 m調(diào)查主要發(fā)生雜草的種類，采集發(fā)病嚴(yán)重的主要雜草樣本帶回實(shí)驗(yàn)室。健康雜草離體葉片均采自江蘇省南京市各農(nóng)田及荒地。

1.2 茶園雜草病原菌的分離和純化

用相機(jī)（Canon, SX11S, Japan）拍照記錄感病雜草發(fā)病癥狀并鏡檢。參照方中達(dá)[14]所述的組織分離法分離出樣本中的植物病原菌，即取葉片病健交界處，剪切成5 mm×5 mm的小塊，依次用75%酒精、2%次氯酸鈉溶液和75%酒精表面消毒1 min，無(wú)菌水換洗3 次后接種于PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃黑暗培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每隔12 h觀察一次，一旦菌落長(zhǎng)出，及時(shí)轉(zhuǎn)接到新的PDA平板中，經(jīng)過(guò)單孢分離后獲得純化菌株。將成功分離純化的菌株保存在PDA斜面上，置于4 ℃冰箱保藏。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后記錄菌落形態(tài)；光學(xué)顯微鏡（ZEISS Axio imager M2）下觀察菌絲、分生孢子和分生孢子梗等形態(tài)特征并拍照。

鏡檢具體操作是將水瓊脂培養(yǎng)基或寄主汁液培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，使其厚度約為3 mm。用接種針將培養(yǎng)基劃成15 mm×15 mm的瓊脂方塊置于載玻片上，挑取少量菌絲接種于瓊脂塊中間，將載玻片放入用潤(rùn)濕脫脂棉保濕的培養(yǎng)皿中，28 ℃黑暗培養(yǎng)15 d后，用顯微鏡觀察菌株形態(tài)特征，根據(jù)《中國(guó)真菌志》初步確定病原菌的分類學(xué)地位。

1.3.2 分子鑒定 采用Fungal gDNA Isolation Kit（Biomiga）提取病原菌基因組DNA。以通用引物ITS1（5′?TCCGTAGGTGAACCTGCGG?3′）和 ITS4（5′?TCCTCCGCTTATTGATATGC?3′）特異性擴(kuò)增 ITS序列。25 μL PCR 擴(kuò)增體系為：TaqMaster Mix 9.5 μL，上下游引物各 1 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 12.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。擴(kuò)增后進(jìn)行電泳檢測(cè)，用OMEGA膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit-Spin Protocol）回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送生物公司進(jìn)行測(cè)序（生工生物工程（上海）股份有限公司）。用Biomax和DNAman軟件進(jìn)行序列分析，獲得完整的目的片段擴(kuò)增序列，將測(cè)序得到的ITS基因序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載同源性較高的序列或已知菌種序列，利用MEGA 7.0中neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.4 病原菌回接驗(yàn)證

用直徑為5 mm的打孔器從菌落邊緣打取菌塊，將菌餅接種在寄主葉片的背面，置于 28 ℃、12 h/12 h光暗交替培養(yǎng)箱（E?36HO, PERCIVAL公司，美國(guó)）培養(yǎng)4 d。拍照記錄葉片產(chǎn)生病斑的特征，測(cè)量病斑長(zhǎng)度，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。用上述組織分離法重新從接種葉片的病斑處分離病原菌，若與原接種菌株一致，則確認(rèn)為是該雜草的病原菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶園雜草病原菌采集、分離與致病性檢測(cè)

從江蘇、浙江、安徽省16個(gè)茶園共采集的114份雜草患病樣本，其葉片上均呈現(xiàn)葉片發(fā)黃、發(fā)黑等明顯病斑，個(gè)別葉片上具有粉狀孢子。從病葉樣本中共分離出214株真菌，用打孔器從菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅接種到寄主離體葉片上，其中能引起葉片病斑的有44株，病斑平均直徑大于10 mm的有10株（表1），這10株菌株分別來(lái)自江蘇、浙江和安徽3省7個(gè)茶園的6種患病雜草。同時(shí)，切取發(fā)病葉片病健交界處組織，進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，得到與茶園分離到的病原菌形態(tài)特征一致的菌株，確認(rèn)是該雜草的病原菌。

表1 本試驗(yàn)中的菌株信息Table 1 Strains used in experiments

2.2 致病菌株的鑒定

2.2.1 菌株 YZQN?1?9 形態(tài)學(xué)鑒定 該菌株分離于江蘇省揚(yáng)州市邗江區(qū)平山茶場(chǎng)一株患病牽牛，患病植株的葉片上有黃褐色點(diǎn)狀斑點(diǎn)。將其接種到健康牽牛的離體葉片上，初期出現(xiàn)點(diǎn)狀斑點(diǎn)，隨著病斑擴(kuò)大，呈暗褐色（圖1A）。該菌株在PSA培養(yǎng)基上菌落灰白色，背面黑色，邊緣有白色菌絲圈，菌絲致密（圖 1B）。菌絲黑褐色，具隔膜，隔膜褐色。在水瓊脂培養(yǎng)基上可以產(chǎn)孢，分生孢子器呈球狀，黑色，周圍有大量分生孢子（圖1C）。分生孢子無(wú)色，卵圓形，長(zhǎng)5～8 μm，寬2～3 μm（圖1D）。根據(jù)以上特征可初步判斷該菌株為荸薺莖點(diǎn)霉Didymellabellidis(Neerg.) Q.Chen & L.Cai。

2.2.2 菌株 YZQN?2?3形態(tài)學(xué)鑒定 該菌株也分離于江蘇省揚(yáng)州市邗江區(qū)平山茶場(chǎng)的患病牽牛?；亟拥诫x體牽牛葉片上，出現(xiàn)黃褐色點(diǎn)狀斑點(diǎn)（圖1E）。在PSA培養(yǎng)基上，菌落呈灰黑色，絨狀，較厚，邊緣白色，背面黑褐色（圖1F）。菌絲褐色，具隔膜。在水瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，分生孢子梗產(chǎn)生于菌絲中間或末端，直立或彎曲（圖1G）。分生孢子褐色，倒棍棒狀，頭尾相連呈鏈形，具3～8 個(gè)橫隔膜，1～4 個(gè)豎隔膜，長(zhǎng)22～40 μm，寬2～5 μm（圖1H）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，該病原菌初步鑒定為鏈格孢霉Alternaria alternate(Fr.) keissle。

圖1 接種YZQN-1-9和YZQN-2-3的葉片發(fā)病癥狀及病原菌的形態(tài)特征Fig.1 Symptoms of YZQN-1-9 and YZQN-2-3 strains and morphological characteristics of pathogens

2.2.3 菌株JSLWLM?1?3形態(tài)學(xué)鑒定 該菌株分離于江蘇省南京市溧水茶園的一株患病烏蘞莓，患病植株的葉片上有明顯的大面積黑色病斑。將其回接到健康烏蘞莓離體葉片上，初期出現(xiàn)點(diǎn)狀斑點(diǎn)，隨著病斑擴(kuò)大，呈現(xiàn)黑褐色（圖2A）。該菌株在PSA培養(yǎng)基上，菌落灰綠色，有年輪狀紋路，背面黑色，菌絲絨狀，質(zhì)地較厚（圖2B）。菌絲淡褐色，具隔膜。分生孢子梗較短，直立，產(chǎn)生于菌絲中間。在水瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，分生孢子長(zhǎng)度較短，隔膜數(shù)量較少，一般2～6個(gè)隔膜（圖2C）。在烏蘞莓汁液培養(yǎng)基上可大量產(chǎn)孢，分生孢子長(zhǎng)度較長(zhǎng)，隔膜數(shù)量多，5～11 個(gè)隔膜，分生孢子單生于分生孢子梗頂端，倒棍棒形，淡褐色，直立或彎曲，以裂解式脫落，長(zhǎng)79～132 μm，寬6～9 μm（圖2D）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，該病原菌初步鑒定為多主棒孢Corynesporacassiicola(Berk.M.A.Curtis) C.T.Wei。

2.2.4 菌株HZQQN?1?3形態(tài)學(xué)鑒定 該菌株分離于安徽省黃山市徽州區(qū)謝裕大生態(tài)茶園一株患病牽牛，患病植株的葉片具有黑色和黃色點(diǎn)狀病斑。將其接種到離體牽牛健康葉片，初期出現(xiàn)點(diǎn)狀斑點(diǎn)，隨著侵染時(shí)間的增長(zhǎng)，病斑逐漸擴(kuò)大，呈現(xiàn)黑褐色（圖2E）。在PSA培養(yǎng)基上，菌落白色，中間淡黃色，背面淡黃色，菌絲絮狀，質(zhì)地較厚（圖2F）。菌絲無(wú)色，具隔膜。分生孢子梗產(chǎn)生于菌絲中間，較短。在水瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，分生孢子簇生，無(wú)色，呈鐮刀狀，略彎，具3～5個(gè)隔膜，長(zhǎng)11～31 μm，寬2～3 μm（圖2G，H）。根據(jù)以上特征可初步判斷該菌株為木賊鐮刀菌Fusariumequiseti(Corda) Sacc.。

圖2 接種JSLWLM-1-3和HZQQN-1-3的葉片發(fā)病癥狀和病原菌的形態(tài)特征Fig.2 Symptoms of JSLWLM-1-3 and HZQQN-1-3 strains and morphological characteristics of pathogens

2.2.5 菌株TXQYZC?1?2形態(tài)學(xué)鑒定 該菌株分離于安徽省黃山市屯溪區(qū)茅山茶場(chǎng)的一株患病鴨跖草，患病鴨跖草的葉片發(fā)黃，表面具黑色點(diǎn)狀斑點(diǎn)。離體鴨跖草健康葉片接種該菌株后，出現(xiàn)黑色點(diǎn)狀斑點(diǎn)（圖3A）。菌株在PSA培養(yǎng)基上菌落初期白色，后期有紫色色素產(chǎn)生，菌絲延展，質(zhì)地較?。▓D3B）。在水瓊脂培養(yǎng)基上未產(chǎn)生厚坦孢子，只產(chǎn)生大量分生孢子，分生孢子著生于分生孢子梗頂端，卵形，無(wú)色（圖3C，D）。根據(jù)以上特征可初步判斷該菌株為再育鐮刀菌Fusariumproliferatum(Matsush.) Nirenberg ex Gerlach& Nirenberg。

2.2.6 菌株TXQYZC?1?4形態(tài)學(xué)鑒定 該菌株分離于安徽省黃山市屯溪區(qū)茅山茶場(chǎng)的一株患病鴨跖草，患病鴨跖草的葉片發(fā)黃，表面具黑色點(diǎn)狀斑點(diǎn)?；亟拥诫x體鴨跖草健康葉片，葉片表面出現(xiàn)黑褐色點(diǎn)狀斑點(diǎn)（圖3E）。菌株在PSA培養(yǎng)基上，菌落白色，中間淡黃色，背面淡黃色，菌絲絮狀，質(zhì)地較厚（圖3F）。菌絲無(wú)色，具隔膜。分生孢子梗產(chǎn)生于菌絲中間，較短。在水瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，分生孢子簇生，無(wú)色，呈鐮刀狀，略彎，具3～5個(gè)隔膜，多數(shù)4個(gè)，長(zhǎng)18～28 μm，寬2～4 μm（圖3G，H）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將分離的病原菌初步鑒定為木賊鐮刀菌Fusariumequiseti(Corda) Sacc.。

圖3 接種TXQYZC-1-2和TXQYZC-1-4的葉片發(fā)病癥狀和病原菌的形態(tài)特征Fig.3 Symptoms of TXQYZC-1-2 and TXQYZC-1-4 strains and morphological characteristics of pathogens

2.2.7 菌株JAGWC?2?7形態(tài)學(xué)鑒定 該菌株分離自安徽省六安市金安區(qū)的一株感病狗尾草，感病植株葉片完全發(fā)黃，葉片上有黑色成片病斑。將其接種到離體狗尾草健康葉片，初期呈現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，隨著時(shí)間增加，病斑進(jìn)一步擴(kuò)大，呈現(xiàn)黃褐色片狀病斑（圖4A）。菌株在PSA培養(yǎng)基上菌落顏色灰白色，菌絲絨狀，背面灰黑色（圖 4B）。菌絲黑褐色，具隔膜。在水瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，分生孢子梗直立或彎曲，產(chǎn)孢節(jié)處顏色加深。分生孢子簇生，黑褐色，具5～9個(gè)假隔膜，中部較寬，略彎曲，長(zhǎng)24～72 μm，寬8～15 μm（圖4C，D）。根據(jù)以上特征可初步判斷該菌株為狗尾草平臍蠕孢BipolarissetariaeShoemaker。

圖4 接種JAGWC-2-7和SYMT-1-5的葉片發(fā)病癥狀和病原菌的形態(tài)特征Fig.4 Symptoms of JAGWC-2-7 and SYMT-1-5 strains and morphological characteristics of pathogens

2.2.8 菌株SYMT?1?5形態(tài)學(xué)鑒定 該菌株分離于浙江省麗水市松陽(yáng)縣大木山騎行茶園的一株感病馬唐，感病植株葉片完全發(fā)黃，葉片上具黃褐色病斑?；亟拥诫x體馬唐健康葉片，葉片上出現(xiàn)黃褐色片狀病斑（圖4E）。菌株在PSA培養(yǎng)基上菌落呈灰綠色，邊緣白色，菌絲絨狀，較厚，菌落背面黑色（圖4F）。菌絲黑褐色，具隔膜。在水瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，分生孢子梗產(chǎn)生于菌絲的中間或末端。分生孢子互生或輪生于分生孢子梗產(chǎn)孢節(jié)處，直立或彎曲，具3個(gè)隔膜，中隔膜處最寬，兩端較窄，分生孢子長(zhǎng)23～28 μm，寬14～18 μm（圖4G，H）。根據(jù)以上特征可初步判斷該菌株為間型彎孢CurvulariaintermediaBoedijin。

2.2.9 菌株 ZJJMT?1?7形態(tài)學(xué)鑒定 該菌株分離于浙江省紹興市諸暨市十里坪茶園的一株感病馬唐，感病植株葉片發(fā)黃，葉尖枯萎卷縮。離體馬唐健康葉片接種該病原菌后，葉片上出現(xiàn)黃色病斑，并隨著時(shí)間增加，病斑進(jìn)一步擴(kuò)大，病斑呈現(xiàn)成片的黃褐色（圖5A）。其在PSA培養(yǎng)基上，菌落黑褐色，菌絲致密稀薄，具隔膜，黑褐色（圖5B）。在水瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，分生孢子梗產(chǎn)孢點(diǎn)具凸起（圖5C）。分生孢子3個(gè)隔膜，隔膜顏色較深，自基部數(shù)至第3個(gè)細(xì)胞最大，且使孢子呈彎曲狀，孢子兩端顏色較淺，分生孢子長(zhǎng)20～25 μm，寬7～12 μm（圖5D）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將分離的病原菌初步鑒定為新月彎孢Curvularia lunata（Wakker）Boedijin。

2.2.10 菌株ZJJMT?1?5形態(tài)學(xué)鑒定 該菌株分離于浙江省紹興市諸暨市十里坪茶園的一株感病馬唐?；亟拥诫x體馬唐健康葉片，葉片上出現(xiàn)黃褐色片狀斑點(diǎn)（圖5E）。菌株在PSA培養(yǎng)基上菌落呈黃綠色，菌絲絨狀，較厚，菌落背面黑色（圖5F）。菌絲黑褐色，具隔膜。在水瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，分生孢子梗產(chǎn)生于菌絲的中間或末端（圖5G）。分生孢子互生或輪生于分生孢子梗產(chǎn)孢節(jié)處，直立或彎曲，具3個(gè)隔膜，隔膜顏色深褐色，中隔膜處最寬，兩端較窄，兩端細(xì)胞顏色較淺，分生孢子長(zhǎng)21～32 μm，寬12～19 μm（圖5H）。根據(jù)以上特征可初步判斷該菌株為間型彎孢CurvulariaintermediaBoedijin。

圖5 接種ZJJMT-1-7和ZJJMT-1-5的葉片發(fā)病癥狀和病原菌的形態(tài)特征Fig.5 Symptoms of ZJJMT-1-7 and ZJJMT-1-5 strains and morphological characteristics of pathogens

2.3 分子生物學(xué)鑒定

利用ITS1克隆目的DNA片段，測(cè)序得到的ITS序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，從結(jié)果中下載同源性較高的序列構(gòu)建進(jìn)化樹結(jié)果顯示，菌株ZJJMT?1?5和SYMT?1?5與C.intermedia聚在一個(gè)較大的分支上，三者親緣關(guān)系最近，支持率為99%；菌株ZJJMT?1?7與C.lunata聚在一個(gè)較大的分支上，兩者親緣關(guān)系較近；菌株JAGWC?2?7與B.setariae聚在一個(gè)較大的分支上，兩者親緣關(guān)系最近；YZQN?2?3與A.alternata聚在同一支，支持率 100%，親緣關(guān)系很近；YZQN?1?9與D.bellidis聚在同一支上，支持率為100%；JSWLM?1?3與C.cassiicola聚在同一支，支持率100%，親緣關(guān)系很近；TXQYZC?1?2與F.proliferatum聚在同一支，支持率100%，親緣關(guān)系很近；HZQQN?1?3和TXQYZC?1?4與F.equiseti聚在同一支，支持率 98%，親緣關(guān)系很近。根據(jù) ITS序列同源性對(duì)比和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，可以判斷：ZJJMT?1?5和SYMT?1?5為間型彎孢；ZJJMT?1?7為新月彎孢；JAGWC?2?7為狗尾草平臍蠕孢；YZQN?2?3為鏈格孢菌；YZQN?1?9為荸薺莖點(diǎn)霉；JSWLM?1?3為多主棒孢霉；TXQYZC?1?2為再育鐮刀菌；HZQQN?1?3和TXQYZC?1?4為木賊鐮刀菌（圖6）。

圖6 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phyologenetic tree of strains based on rDNA-ITS sequence

3 討論

雜草一直是影響茶葉品質(zhì)和產(chǎn)量的元兇之一，它不僅會(huì)與茶樹爭(zhēng)肥、爭(zhēng)光、爭(zhēng)水，還是許多病原菌和茶樹害蟲的過(guò)渡寄主[17]。使用化學(xué)除草劑是目前防治最簡(jiǎn)單有效的方法，目前茶園可用的除草劑僅有6 類107 個(gè)產(chǎn)品，低于柑橘（8 大類478 個(gè)產(chǎn)品），遠(yuǎn)低于玉米（1878 個(gè)產(chǎn)品）、水稻（2273 個(gè)產(chǎn)品），其中草甘膦及其衍生物應(yīng)用最為廣泛[6]。但化學(xué)除草劑單一、過(guò)量的使用帶來(lái)了許多負(fù)面影響，包括土壤板結(jié)，茶葉品質(zhì)下降和農(nóng)殘超標(biāo)等[18]。隨著茶產(chǎn)業(yè)的建設(shè)和發(fā)展，公眾對(duì)茶葉的品質(zhì)與安全日益關(guān)注，研發(fā)出能夠代替化學(xué)除草劑防除茶園雜草的生物除草劑顯得十分迫切。

本研究從江蘇、浙江和安徽3省共16個(gè)茶園采集的114份雜草患病樣本中分離篩選出10株具有顯著致病力的菌株。通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定這10株菌株分別為莖點(diǎn)霉屬的荸薺莖點(diǎn)霉（1 株），鏈格孢屬的鏈格孢（1株），多主棒孢屬的多主棒孢（1株），鐮刀屬的木賊鐮刀菌（2株）、再育鐮刀菌（1株），平臍蠕孢屬的狗尾草平臍蠕孢（1株）和彎孢屬的間型彎孢（2株）、新月彎孢（1株）共8種真菌。

莖點(diǎn)霉屬Phoma隸屬于球殼抱目Sphaernpsidales，是農(nóng)作物、經(jīng)濟(jì)作物、林木、雜草等多種植物的重要病原菌，寄主范圍十分廣泛，危害茄科、十字花科、豆科等上百種植物，引起植株葉斑、褐斑、枯斑、葉枯、莖枯、枝枯、基腐、果腐等癥狀，輕則影響植株的生長(zhǎng)和發(fā)育，重則導(dǎo)致植物死亡，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)極大的壓力[19-21]。比如，甘藍(lán)莖點(diǎn)霉P.lingam引起十字花科蔬菜的黑莖或黑腳癥狀，引起植株產(chǎn)量下降品質(zhì)變劣，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[22]。草莖點(diǎn)霉P.herbarum能產(chǎn)生具有動(dòng)物細(xì)胞毒性、抗病毒、抗真菌以及植物致病活性的毒素 brefeldin A，抑制植物細(xì)胞的有絲分裂，影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育[23]。高粱莖點(diǎn)霉P.sorghina是高粱、水稻、美洲商陸等多種植物上的病原菌，該菌產(chǎn)生的頂環(huán)氧菌素對(duì)單子葉和雙子葉種子植物具有廣譜毒性[24]。向日葵莖點(diǎn)霉P.macdonaldii是向日葵黑莖病的病原，產(chǎn)生的Zinniol毒素可引起葉片和莖稈枯萎[25]。但巨口莖點(diǎn)霉P.macrostoma被廣泛應(yīng)用于防除草皮上的闊葉類雜草，如加拿大薊、蒲公英、田旋花、豬殃殃、蕁麻等[8]。據(jù)報(bào)道，荸薺莖點(diǎn)霉P.bellidis在英國(guó)、丹麥、意大利、荷蘭、瑞士等多個(gè)歐洲國(guó)家引起菊科植物病害[26,27]。此外，呂茹婧[28]在人工接種條件下，發(fā)現(xiàn)荸薺莖點(diǎn)霉P.bellidis可成功侵染至少包括菊科植物萵苣和生菜、莎草科植株荸薺、豆科大豆、錦葵科棉花、禾本科玉米、蓼科菠菜和十字花科小白菜在內(nèi)的7科8種植物。因此，荸薺莖點(diǎn)霉作為微生物除草劑的作物風(fēng)險(xiǎn)性較高，不建議做進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

鏈格孢屬Alternaria是半知菌暗色絲孢綱Hyphomycetes中重要的一類真菌，該屬真菌種類眾多，寄主范圍和地理分布廣泛，95%以上的種能兼性寄生在植物上，既是重要的植物病原菌，又是常見(jiàn)的腐生菌[29]。比如：馬鈴薯早疫病菌A.solani侵害馬鈴薯植株葉片、葉柄、莖以及塊莖，引起馬鈴薯早疫病[30]；黑斑病病原菌A.tenuissima造成番石榴Psidiumguajava葉片黑斑病[31]；長(zhǎng)柄鏈格孢菌A.longipes侵染煙草葉片，引起煙草赤星病，造成煙草嚴(yán)重?fù)p傷[32]，嚴(yán)重影響了作物的產(chǎn)量，給我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的損失。除此之外，鏈格孢屬真菌也是引起藥用植物病害的主要病原菌之一，可引起人參黑斑病、穿山龍黑斑病、蘆薈黑斑病、蒼術(shù)黑斑病、龍膽葉枯病、銀杏葉枯病等，影響藥用植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育，造成藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的降低[33]。鏈格孢A.alternata通常通過(guò)侵染植株根莖，造成其大小和重量的降低，在種子、谷物、水果和食物上造成斑點(diǎn)或腐爛，引起蘋果葉斑病，番茄莖潰爛，草莓黑斑病，日本梨黑斑病，紅辣椒果腐病，蕓豆葉斑病，甜菜葉斑病[34]，姜黃葉斑病[35]、茶樹葉斑病[36,37]等，造成經(jīng)濟(jì)作物的減產(chǎn)，嚴(yán)重威脅到農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。因此，該菌不適合直接開(kāi)發(fā)為防除多數(shù)經(jīng)濟(jì)作物田雜草的微生物除草劑。但鏈格孢菌可以產(chǎn)生大量不同類型的次生代謝物，是開(kāi)發(fā)生物源除草劑的重要庫(kù)源[38-41]。

棒孢屬Corynespora是以多主棒孢霉C.cassiicola為模式種建立的一個(gè)真菌屬，隸屬于半知菌亞門Deuteromycotuna絲孢目Hyphomycetales。多主棒孢霉是該屬內(nèi)發(fā)現(xiàn)最早、寄主最廣的種，能侵染熱帶及亞熱帶地區(qū)的蔬菜、水果、觀賞植物等引發(fā)葉斑病[42]。比如，侵染大戟科的木薯引起木薯棒孢霉葉斑病，植株葉片受損嚴(yán)重，造成產(chǎn)量下降[43]。引起橡膠樹棒孢霉落葉病，造成橡膠樹周年反復(fù)落葉甚至幼樹死亡，嚴(yán)重降低干膠產(chǎn)量[44,45]。還能引起棒孢霉葉斑病在茄科的茄子、煙草，葫蘆科的黃瓜、甜瓜等作物上流行性暴發(fā)，嚴(yán)重威脅到農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[46-49]。因而，多主棒孢霉作為微生物除草劑的安全風(fēng)險(xiǎn)較高，尤其不適合開(kāi)發(fā)為防除蔬菜、水果、觀賞植物地雜草的微生物除草劑。

鐮刀菌屬Fusarium隸屬于瘤座菌目Tuberculariales，以粉紅鐮刀菌Fusariumroseum為基礎(chǔ)建立起來(lái)的，是農(nóng)作物重要的病原菌之一，嚴(yán)重影響谷類作物的生長(zhǎng)發(fā)育和糧食生產(chǎn)。鐮刀菌屬種類繁多，至今已報(bào)道的鐮刀菌超過(guò)500 種，而且在植物中的寄主范圍很廣，可侵染多數(shù)植物并造成毀滅性傷害，如引起香蕉萎蔫病的尖孢鐮刀菌F.oxysporum、水稻惡苗病和甘蔗梢腐病的串珠鐮刀菌F.moniliforme、小麥赤腐病的禾谷鐮刀菌F.graminearum等[50]。木賊鐮刀菌F.equiseti是一種世界性分布的土壤真菌，通過(guò)入侵根部成為優(yōu)勢(shì)種，以破壞維管束組織來(lái)減少和阻止根部?jī)?nèi)生真菌的聯(lián)合[51]，是小麥、玉米、水稻等多種經(jīng)濟(jì)作物的病原菌，引起小麥根腐病和莖基腐[52,53]、玉米苗莖基腐病[54]、水稻立枯病[55]等，還可以感染諸如蘆筍、豇豆、菜籽油、大頭菜、洋蔥、布什豆、馬鈴薯、番茄、蠶豆、鷹嘴豆、豌豆、甜瓜等蔬菜瓜果類作物[56,57]。除此之外，木賊鐮刀菌還可以使一些觀賞植物及中藥材甚至真菌等感病[58]。但該菌株的菌絲體對(duì)惡性雜草麻葉蕁麻具有極強(qiáng)的防治效果，被證實(shí)具有除草潛力[59]。再育鐮刀菌F.proliferatum也是世界性的腐生真菌，可引起大蒜[60]、黨參[61]、苜蓿[62]、大豆[63]和藍(lán)莓[64]等經(jīng)濟(jì)作物發(fā)生根腐病?？琢顣缘萚65]研究表明，從列當(dāng)Broomrape中分離出的再育鐮刀菌，可有效防治寄生于煙草和向日葵的列當(dāng)，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用的潛力。

平臍蠕孢屬Bipolaris隸屬于子囊菌門Ascomycota，多孢菌目Pleosporales，是禾本科植物上常見(jiàn)的一類重要病原菌，同時(shí)也可寄生或腐生于豆科、天南星科、姜科、蕓香科、漆樹科、大戟科等近60 屬植物中，引起植物發(fā)生葉斑病、根腐病等病害[66]。狗尾草平臍蠕孢B.setariae可導(dǎo)致狗尾草、虎尾草、稗草、馬唐和椰子幼苗等葉斑病[67]，但對(duì)雀麥、大豆、花生、黃瓜、番茄、棉花等經(jīng)濟(jì)作物無(wú)明顯的致病作用，因此，狗尾草平臍蠕孢具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為狗尾草、馬唐等多種常見(jiàn)禾本科雜草的微生物除草劑潛力[68]。

彎孢屬Curvularia隸屬于鏈孢霉目Moniliales，也是多數(shù)禾本科植物的重要病原菌，主要引起葉斑病，如引起玉米彎孢葉斑病[69]和辣椒葉斑病的新月彎孢，引起黑麥草葉枯病[70]的間型彎孢。新月彎孢可引起水稻、甘蔗、小麥、玉米等的葉斑和苗枯病，這些病害在一定的條件下可能會(huì)變成某些作物的重要病害。但倪漢文等[71]從稗草中分離出的新月彎孢對(duì)稗草有強(qiáng)烈、快速的致病力，具有防除稗草的潛力。間型彎孢也是玉米彎孢葉斑病的病原菌之一，成為玉米高產(chǎn)種植潛在的威脅。但朱云枝等[72]通過(guò)對(duì)馬唐病原菌的分離與鑒定，篩選出了一株對(duì)玉米、水稻、小麥、大豆、棉花、花生等作物及草坪均表現(xiàn)安全，對(duì)馬唐致病力強(qiáng)的間型彎孢，為生物除草劑的研制提供了有潛力的候選菌株。

綜上所述，荸薺莖點(diǎn)霉、鏈格孢和多主棒孢霉會(huì)影響常見(jiàn)經(jīng)濟(jì)作物如棉花、大豆、蘋果、黃瓜等的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量，嚴(yán)重威脅到農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，故其作為微生物除草劑開(kāi)發(fā)的可能性較小，是一類經(jīng)濟(jì)意義較低的生防菌；木賊鐮刀菌、再育鐮刀菌、狗尾草平臍蠕孢、間型彎孢和新月彎孢能有效地防除特定雜草而對(duì)作物表現(xiàn)安全，是一類在農(nóng)業(yè)上具有重要經(jīng)濟(jì)意義的生防菌，有希望研發(fā)為微生物除草劑。