王曉迪，冀順霞，申曉娜，劉萬學(xué)，萬方浩，張桂芬，呂志創(chuàng)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)研究室，北京 100193）

昆蟲作為自然界中數(shù)量最多的生物，與農(nóng)林牧的生產(chǎn)息息相關(guān)，科學(xué)家們也在不斷地對其進(jìn)行深入的研究，基因組信息是深入研究分子和遺傳機(jī)制以及進(jìn)化過程的重要基礎(chǔ)。近年來越來越多的昆蟲基因組被測序。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年12月底在NCBI數(shù)據(jù)庫中已有331個(gè)基因組完成組裝拼接[1]，截至2020年6月9日增至497種。隨著昆蟲基因組信息的日益完善，基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)為昆蟲學(xué)的研究開辟了新思路，為昆蟲的基因功能研究提供了新的技術(shù)支持。經(jīng)典的基因組編輯工具包括zinc-finger nucleases（ZFNs）技術(shù)[2,3]和transcription activator-like effector nucleases （TALENs）技術(shù)[4-6]，其已在果蠅Drosophila、家蠶Bombyx mori、蟋蟀Gryllulus等昆蟲的研究中獲得成功[7-11]。隨后發(fā)現(xiàn)了由RNA指導(dǎo)Cas蛋白進(jìn)行DNA識別及編輯的 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated（Cas）技術(shù)[12]，并廣泛應(yīng)用于臨床試驗(yàn)、動(dòng)植物、細(xì)菌、真菌等研究領(lǐng)域[13-19]。以上三種基因編輯技術(shù)作為功能基因組研究的重要工具在昆蟲的研究中已得到了應(yīng)用[20,21]，為今后進(jìn)行昆蟲功能基因組研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。為了防止雙鏈斷裂（double strand break，DSB）引起的潛在危害，保證基因組的完整性，近年來，一系列無DSB的單堿基編輯工具——胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editors，CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editors，ABE）和先導(dǎo)編輯（prime editing）已經(jīng)在多種物種中被廣泛開發(fā)，并對其編輯技術(shù)的精確性及廣適性進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

CRISPR/Cas系統(tǒng)最初是由日本大阪大學(xué)（Osaka University）于1987年在研究大腸桿菌EscherichiacoliK12體內(nèi)堿性磷酸同工酶的iap（Alkaline Phosphatase）基因的核苷酸序列時(shí)發(fā)現(xiàn)的，其中一段由重復(fù)短序列間隔排列組成的片段引起了研究者的注意[12]。2002年，Jansen等[22]將這段序列命名為clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）以此來反映這一簇有規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列的特征，并在研究中確定了四個(gè)CRISPR相關(guān)基因cas1、cas2、cas3和cas4，cas基因始終位于CRISPR位點(diǎn)附近，說明二者之間具有功能相關(guān)性。

研究證明，CRISPR基因座存在于大量細(xì)菌和古細(xì)菌中[22-26]。根據(jù)Cas基因核心元件序列的多樣性，將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為兩類六型[27]：第一類是多亞基效應(yīng)復(fù)合物，需要多個(gè)Cas蛋白相互作用[28,29]，才能發(fā)揮CRISPR系統(tǒng)的作用，包括類型I、類型III和類型IV，前兩種類型在古細(xì)菌中出現(xiàn)的頻率較高，類型IV較罕見；第二類是單蛋白效應(yīng)器，該復(fù)合物由一個(gè)單一的、大的、多結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)組成，CRISPR/Cas位點(diǎn)的組織結(jié)構(gòu)更簡單、更統(tǒng)一，其類型包括類型II、類型V、類型VI，該類系統(tǒng)中的Cas9、Cas12a（Cpf1）和Cas12b（C2c1）的靶向目標(biāo)是DNA，Cas13a（C2c2）、Cas13b的靶向目標(biāo)是RNA。Cas9基因最早是在 2007年噬菌體侵染嗜熱鏈球菌的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，研究發(fā)現(xiàn)該基因能很好地抵抗噬菌體的入侵，并證實(shí)了原核生物已進(jìn)化出基于核酸的“免疫系統(tǒng)”，其特異性由CRISPR間隔區(qū)的含量決定，而抗性由Cas酶機(jī)制提供[30]，隨后CRISPR/Cas9系統(tǒng)便在動(dòng)植物等的研究中被廣泛應(yīng)用。

在分子水平上，CRISPR的作用過程可以分為三個(gè)階段：整合新的間隔物到CRISPR陣列中，表達(dá)和處理CRISPR RNAs（crRNAs），以及CRISPR干涉[31]。第一階段，當(dāng)外源質(zhì)粒入侵時(shí)，識別PAM（Protospacer Adjacent motif）序列，將proto-spacer與CRISPR間隔序列同源的噬菌體基因序列[32,33]插入到CRISPR位點(diǎn)從而來抵抗入侵的質(zhì)粒和噬菌體，進(jìn)而使細(xì)胞快速適應(yīng)環(huán)境中的入侵者，因此這個(gè)階段被稱為CRISPR功能的適應(yīng)階段。其獲取間隔物的機(jī)制以及CRISPR如何識別噬菌體或質(zhì)粒DNA是入侵性的尚未明確。第二階段，一旦在CRISPR位點(diǎn)上建立了一個(gè)隔離子，它就為CRISPR通路的防御階段提供了特異性。這個(gè)過程的關(guān)鍵是由重復(fù)序列和間隔序列編碼的小crRNAs產(chǎn)生。為了進(jìn)行成功的防御，該CRISPR陣列被轉(zhuǎn)錄生成CRISPR-RNA，該RNA作為向?qū)NA（gRNA），用于識別與Cas蛋白結(jié)合的核糖核酸復(fù)合物中的互補(bǔ)外源DNA/RNA，從而降解靶標(biāo)，阻止入侵。第三階段，在Cas蛋白復(fù)合物的參與下進(jìn)行靶向和干擾入侵的噬菌體DNA序列[34-37]。通過這樣的過程細(xì)胞成功抵御了噬菌體或質(zhì)粒的入侵。

從2012年CRISPR/Cas9技術(shù)正式問世到現(xiàn)在，這一生物技術(shù)被廣泛應(yīng)用到人體臨床試驗(yàn)，動(dòng)植物、細(xì)菌、真菌等基因的研究上，解決了眾多科學(xué)問題。在對果蠅、家蠶、埃及伊蚊Aedesaegypti等昆蟲的研究中得到了充分應(yīng)用[38-47]。通過在 ATP依賴的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（白色）中產(chǎn)生一系列框移突變，證明了CRISPR/Cas介導(dǎo)的昆士蘭實(shí)蠅Bactroceratryoni眼色基因突變，產(chǎn)生經(jīng)典的白眼表型，為今后開發(fā)基因性菌株進(jìn)行蟲害防治提供了可能[48]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對棉鈴蟲Helicoverpazea基因組進(jìn)行編輯，采用核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）復(fù)合物，將合成的gRNA與經(jīng)過核定位信號設(shè)計(jì)的純化Cas9核酸酶結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對vermillion眼色基因的高效編輯，試驗(yàn)結(jié)果顯示胚胎注射2或4 μmol/L RNP復(fù)合物時(shí)突變率高，編輯效果更好[49]。中國科學(xué)院上海植物生理學(xué)與生態(tài)研究所利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了亞洲玉米螟OstriniafurnacalisArgonaute1突變體（OfAgo1），揭示了OfAgo1在亞洲玉米螟角質(zhì)層色素沉著中的作用[50]。研究發(fā)現(xiàn)，以加勒比果蠅Anaststrephasuspensa為研究對象，首先以外源性轉(zhuǎn)基因多聚泛素調(diào)控的EGFP（polyubiquitin-regulated EGFP，PUb-EGFP）為靶點(diǎn)，通過注射Cas9蛋白，實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯，使用單個(gè)sgRNA 進(jìn)行可遺傳的非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）敲除。在帶有PUb-DsRed標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因果蠅中，距離靶標(biāo)位點(diǎn)2～5個(gè)堿基處發(fā)現(xiàn)了多個(gè)缺失變異，種系間的突變效率可達(dá)29%。同時(shí)對其內(nèi)源性性別決定基因As-transformer-2（Astra-2）進(jìn)行敲除，根據(jù)兩性生殖形態(tài)，鑒定出G0雌蟲體細(xì)胞突變的頻率可達(dá)81%[51]。以CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)，通過卵細(xì)胞靶向肽配體（BtKV）與Cas結(jié)合注射到煙粉虱Bemisiatabaci雌性成蟲卵黃中，可實(shí)現(xiàn)對后代基因進(jìn)行有效且可遺傳的編輯，為今后煙粉虱等害蟲的防治提供了新的參考防治策略[52]。在不同昆蟲中建立CRISPR/Cas9系統(tǒng)，為蟲害管理提供了新的視角。2020年5月，西南大學(xué)馬三垣和夏慶友團(tuán)隊(duì)利用廣譜的piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，首次構(gòu)建了適合于昆蟲的CRISPR文庫構(gòu)建策略，并在家蠶細(xì)胞系中測試了其效果，結(jié)果顯示，測試的所有位點(diǎn)的敲除效率都達(dá)到了 100%[53]。該研究為家蠶和其他昆蟲的相關(guān)研究和應(yīng)用提供潛在的靶標(biāo)，并實(shí)現(xiàn)了一系列生物與非生物脅迫的陽性篩選，推動(dòng)了昆蟲基因編輯技術(shù)的研究和應(yīng)用。

2 堿基編輯系統(tǒng)

盡管CRISPR/Cas9技術(shù)迅猛發(fā)展，日益完善，但是傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要是通過gRNA的引導(dǎo)，使得Cas9蛋白結(jié)合到與gRNA互補(bǔ)配對的DNA鏈上，對目標(biāo)基因進(jìn)行切割形成DNA雙鏈斷裂（DSB），誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源重組（homologous recombination，HR）[54,55]，從而完成對基因的編輯。在編輯的過程中NHEJ與HR存在競爭，NHEJ是一種有效地創(chuàng)制基因敲除突變體的途徑，其發(fā)生頻率較高，但修復(fù)方式不夠精確，常常在靶點(diǎn)處產(chǎn)生堿基的插入或缺失（insertions/deletions，indels）；HR途徑是一種較為精確的修復(fù)方式，但效率非常低。因此在編輯的過程中往往達(dá)不到預(yù)期的基因修飾的目的，且不可避免地會對基因組造成損傷[56,57]。

堿基編輯是基因組編輯的一種形式，它使一個(gè)堿基對在目標(biāo)基因組位點(diǎn)上直接、不可逆地轉(zhuǎn)換為另一個(gè)堿基對，而不需要雙鏈DNA斷裂（DSBs）、同源定向修復(fù)（HDR）過程或供體DNA模板[58,59]。與引入點(diǎn)突變的基因組編輯方法相比，堿基編輯可以更有效地進(jìn)行堿基的精準(zhǔn)插入和刪除以及堿基之間的轉(zhuǎn)換。堿基編輯系統(tǒng)（Base editor）的誕生在保護(hù)了基因組的完整性的基礎(chǔ)上提高了編輯效率和精準(zhǔn)度，為基因修復(fù)提供了更加方便快捷的工具，有力推進(jìn)了基因組編輯的進(jìn)程。目前堿基編輯系統(tǒng)依據(jù)融合的不同堿基修飾酶分為兩類：一類是胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editors，CBE），另一類是腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editors，ABE）[60]。這兩類堿基編輯系統(tǒng)利用胞嘧啶脫氨酶或人工改造的腺嘌呤脫氨酶實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)位點(diǎn)的精準(zhǔn)編輯，使得C·T（G·A）或A·G（T·C）的替換更為精確[58,61,62]。

2.1 胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editors，CBE）

2016年，David R.Liu研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了CRISPR/Cas9和胞嘧啶脫氨酶的融合體，該融合體保留了gRNA的引導(dǎo)力，不誘導(dǎo)dsDNA斷裂，并介導(dǎo)胞嘧啶直接轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，從而影響了C·T（或G·A）的取代，基本原理如圖 1所示。由此產(chǎn)生的“堿基編輯器”在大約五個(gè)核苷酸（nt）的窗口內(nèi)轉(zhuǎn)換胞嘧啶，并能有效地糾正與人類疾病相關(guān)的各種點(diǎn)突變[58]。經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)，大鼠胞嘧啶脫氨酶（rAPOBEC1）融合到dCas9的N端，而不是C端，并表現(xiàn)出最高的脫氨酶活性，通過表達(dá)純化以及體外評估，確立了第一代堿基編輯器（BE1）為rAPOBEC1-XTEN-dCas9蛋白。此后該團(tuán)隊(duì)將UGI與BE1的C端融合，創(chuàng)建了第二代堿基編輯器（BE2，apobeci-xten-dcas9-UGI），降低了細(xì)胞在修復(fù)U·G異源DNA雙鏈反應(yīng)時(shí)對堿基編輯效率的影響；為進(jìn)一步提升堿基編輯效率，嘗試進(jìn)一步操縱細(xì)胞DNA修復(fù)來誘導(dǎo)對含有G真核錯(cuò)配修復(fù)（MMR）的未編輯鏈的修正，利用新合成的DNA中出現(xiàn)的缺口來直接移除并重建新鏈，從而產(chǎn)生了第三代堿基編輯器（BE3，APOBEC-XTEN-dCas9 (A840H) UGI）[58]。2017年David R.Liu實(shí)驗(yàn)室開創(chuàng)了四代堿基編輯器（BE4和SaBE4），它將基因編輯C·G-to-T·A之間的轉(zhuǎn)化效率提高了約50%，同時(shí)與BE3相比，將不需要的副產(chǎn)物的頻率降低了一半。將BE3、BE4、SaBE3或SaBE4融合到Gam中，結(jié)合DSBs的噬菌體Mu蛋白大大降低了堿基編輯過程中indel的形成，在大多數(shù)情況下降低到1.5%以下，并進(jìn)一步提高了產(chǎn)品的純度[59]。BE4、SaBE4、BE4-gam和SaBE4-gam代表了C·G-to-T·A堿基編輯的最新狀態(tài)，在未來的試驗(yàn)研究中會被充分利用?？梢哉f該堿基編輯技術(shù)顯著促進(jìn)了基因組編輯的范圍和有效性。

圖1 CBE系統(tǒng)工作原理示意圖[58]Fig.1 Schematic diagram of the function in CBE system

2016年，日本神戶大學(xué) Akihiko Kondo實(shí)驗(yàn)室將膿鏈球菌Streptococcuspyogenes的 dCas9（a nuclease-deficient mutant of Cas9）和來自七鰓鰻Lampetrajaponicum的配體PmCDA1進(jìn)行結(jié)合形成復(fù)合物（Target-AID），該復(fù)合物可以進(jìn)行高效的靶向特異性誘變，特異性點(diǎn)突變主要發(fā)生在5個(gè)堿基靶標(biāo)范圍內(nèi)的胞嘧啶上，在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中均能誘導(dǎo)插入和缺失（indel）。Target-AID通過脫氨酶介導(dǎo)的超突變，在不使用模板DNA的情況下，縮小了靶向核苷酸替換的范圍，從而擴(kuò)大了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯潛力，提高了堿基編輯的準(zhǔn)確性[63]。同年，Michael C.Bassik團(tuán)隊(duì)利用催化激活休眠的dCas9來招募hAID脫氨酶（hyperactive Activation induced deaminase）的變體，在有限的靶標(biāo)損傷下，對內(nèi)源靶標(biāo)進(jìn)行特異化誘變，從而產(chǎn)生多個(gè)不同的點(diǎn)突變文庫，與 Cas9產(chǎn)生的插入和刪除形成對比，此團(tuán)隊(duì)研發(fā)的CRISPR-X技術(shù)可用于同時(shí)突變多個(gè)基因組位置[64]。2017年，George M.Church實(shí)驗(yàn)室通過與ZF或TALE-DNA融合胞嘧啶脫氨酶生成可編輯的脫氨酶，實(shí)現(xiàn)原核細(xì)胞和真核細(xì)胞基因組位點(diǎn)的特異性脫氨，進(jìn)一步設(shè)計(jì)和優(yōu)化后可以將細(xì)胞內(nèi)特定的C·G堿基對轉(zhuǎn)化為T·A。大腸桿菌基因組達(dá)到高達(dá)13%的編輯頻率，優(yōu)化后的嵌合脫氨酶應(yīng)用于人類細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)這些新的酶可以在2.5%的細(xì)胞中產(chǎn)生位點(diǎn)特異性的單核苷酸轉(zhuǎn)移。與靶向核酸酶相比，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞毒性降低[65]。2020年5月11日，華東師范大學(xué)李大力課題組將非序列特異性的ssDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（single-stranded DNA-binding domain，ssDBD）與CBE進(jìn)行融合，通過篩選，發(fā)現(xiàn)將Rad51蛋白的ssDBD融合到APOBEC1與Cas9n之間能顯著提高堿基編輯活性，同時(shí)編輯窗口也大幅增加，且hyeA3A-BE4max可在不引起血紅蛋白γ基因啟動(dòng)子附近基因突變的情況下，特異性地實(shí)現(xiàn)C-to-T的轉(zhuǎn)化，展示了其在動(dòng)物模型中產(chǎn)生精確突變以此來治療人類疾病的能力[66]。2020年5月18日，左二偉研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測了脫氨酶ssDNA結(jié)合的重要氨基酸，在保證催化活性的前提下，對APOBEC1上的ssDNA結(jié)構(gòu)域相應(yīng)氨基酸進(jìn)行突變，篩選出了脫靶效率顯著降低的CBE突變體，并在此基礎(chǔ)上增加標(biāo)簽和核定位序列（FNLS），研究表明YE1-BE3-FNLS顯著降低了脫靶效應(yīng)并提高了編輯效率，是一種高精度、高活性單堿基編輯工具。這項(xiàng)研究成果有望應(yīng)用于遺傳病基因治療，推動(dòng)基因編輯臨床化應(yīng)用，在農(nóng)林牧領(lǐng)域也具有廣泛的應(yīng)用前景。

自堿基編輯系統(tǒng)產(chǎn)生后，已在細(xì)菌、動(dòng)物、植物物種中廣泛應(yīng)用[62,68,69]。胞嘧啶堿基編輯器（CBE）在基因敲除[70-77]、疾病模型[61,78-83]、疾病治療[84-90]、畜牧生產(chǎn)及大動(dòng)物模型構(gòu)建[91-94]以及植物[95-106]中均有大量成功應(yīng)用的例子，并且已經(jīng)帶來了很多的突破。但堿基編輯系統(tǒng)在無脊椎動(dòng)物包括昆蟲中的應(yīng)用上屈指可數(shù)，至今為止，只查閱到2018年西南大學(xué)夏慶友團(tuán)隊(duì)將剪輯編輯系統(tǒng)BE3應(yīng)用于家蠶中。該團(tuán)隊(duì)成功建立了家蠶 BE3堿基編輯系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了在家蠶基因組上的特定位點(diǎn) C·G-to-T·A 的替換，對Blos2和Yellow-e基因的堿基編輯效率分別為40%和51.2%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)BE3最多能同時(shí)編輯Yellow-e基因的4個(gè)堿基；通過引入無義突變的方式建立家蠶 BE3敲除體系，利用該體系高效敲除家蠶外源基因mCherry和Puromycin，以及內(nèi)源基因BmGAPDH和BmV-ATPaseB，其中mCherry和Puromycin編輯效率分別為66.2%和58.3%，驗(yàn)證了BE3作為家蠶基因敲除工具的普遍性；BE3能實(shí)現(xiàn)對EGFP基因多達(dá)14個(gè)C·G堿基對替換的同時(shí)編輯，且?guī)缀鯖]有觀察到indel[107,108]，該研究結(jié)果將為在其他無脊椎動(dòng)物尤其昆蟲中建立堿基編輯系統(tǒng)提供了參考范例，相信不久的將來BE3堿基編輯系統(tǒng)會在昆蟲領(lǐng)域中被普遍應(yīng)用。

2.2 腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editors，ABE）

2017年David R.Liu實(shí)驗(yàn)室通過對腺嘌呤脫氨酶定向改造，開發(fā)了腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)，當(dāng)它與催化受損的CRISPR/Cas9結(jié)合時(shí)，它可以作用于DNA。其基本原理如圖2所示，即脫氨酶與Cas9切口酶（Cas9n）的N末端融合，在gRNA引導(dǎo)下，使非靶鏈中的腺苷脫氨，暴露為單鏈DNA（single-stranded，ssDNA），然后將A轉(zhuǎn)化為肌苷（I）（A-to-I），最后，DNA聚合酶將I識別為G進(jìn)行復(fù)制，互補(bǔ)鏈上原來與腺嘌呤A互補(bǔ)的T將會變成C，進(jìn)而完成堿基置換過程[61]。經(jīng)過7輪進(jìn)化與改造開發(fā)了ABE7.10系統(tǒng)，該系統(tǒng)能有效地實(shí)現(xiàn) A·T-to-G·C（在人類細(xì)胞中約 50%）的替換，具有很高的產(chǎn)品純度（通?！?9.9%）和很低的 indels率（通?！?.1%）。ABEs比現(xiàn)有的基于 Cas9核酸的方法更有效、更直接地引入點(diǎn)突變，比Cas9更少地誘導(dǎo)脫靶基因組修飾，可以在人類細(xì)胞中修正或抑制基因突變[61]。第七代 ABEs 極大地?cái)U(kuò)展了基因編輯的范圍，結(jié)合CBE使得C·T、A·G、T·C和G·A之間的轉(zhuǎn)換成為可能，為今后人類細(xì)胞的基因治療以及其他動(dòng)植物基因的編輯提供了更加精確、快捷的編輯工具。

圖2 ABE系統(tǒng)作用原理示意圖[61]Fig.2 Schematic diagram of the function in ABE system[61]

ABE系統(tǒng)開發(fā)至今雖然并未查閱到其在昆蟲中的相關(guān)研究，但卻已成功應(yīng)用于各種動(dòng)物細(xì)胞系、人類胚胎、小鼠、大鼠、兔子、斑馬魚、水稻、小麥、擬南芥和油菜等[62,68]。例如，對水稻Oryzasativa的研究表明，應(yīng)用ABE-P1編輯系統(tǒng)能使其基因的編輯效率達(dá)到26%[109]；基于熒光示蹤的rBE14系統(tǒng)也能在水稻上實(shí)現(xiàn)高效編輯[110]。Hao等[111]研究表明 ABE系統(tǒng)既能用于研究水稻目標(biāo)氨基酸置換又能用來干擾miRNA的結(jié)合區(qū)域，同時(shí)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用經(jīng)過修飾的sgRNA突變體會增加堿基編輯的效率。同時(shí)，研究證明了ABE和 CBE系統(tǒng)可以同時(shí)對水稻基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯[112]。ABE系統(tǒng)在小麥Triticumaestivum、擬南芥Arabidopsisthaliana和甘藍(lán)型油菜Brassicanapus上也實(shí)現(xiàn)了50%以上的高效率編輯[106,113,114]。

3 先導(dǎo)編輯（prime editing）

2019年11月，David R.Liu團(tuán)隊(duì)在原有的基因編輯技術(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種新型的基因編輯技術(shù)——先導(dǎo)編輯[115]，此項(xiàng)技術(shù)相比于同源性導(dǎo)向的修復(fù)，提高了編輯效率以及產(chǎn)品純度；相比于堿基編輯，具有互補(bǔ)性優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)了堿基之間的顛換；在已知的Cas脫靶位點(diǎn)上，提供了比Cas核酸酶更低的脫靶率。先導(dǎo)編輯技術(shù)大大擴(kuò)展了基因組編輯的范圍和能力，原則上可以糾正大約89%的人類已知致病性基因變異。

先導(dǎo)編輯主要的復(fù)合物包括Cas9酶（被修飾成僅切割DNA的一條鏈）、逆轉(zhuǎn)錄酶（以RNA為模板產(chǎn)生新的DNA鏈），此外還需要一種特殊的gRNA——pegRNA（prime editing guide RNA），這種pegRNA不但能夠結(jié)合想要編輯的特定DNA區(qū)域，還會自帶“修改模板”，從而在精確編輯中發(fā)揮作用。其編輯的過程如圖3所示，即pegRNA將編輯信號發(fā)送到靶標(biāo)處，引導(dǎo)Cas9切割DNA的一條鏈；隨后反轉(zhuǎn)錄酶讀取RNA并將相應(yīng)的堿基連接到被剪切的DNA鏈的末端，與此同時(shí)將編輯序列從pegRNA轉(zhuǎn)移到靶標(biāo)DNA上；細(xì)胞中的核酸內(nèi)切酶切除舊的DNA片段，將新的堿基組合到基因組中；此時(shí)靶標(biāo)位點(diǎn)只剩下一條已編輯的鏈和一條未編輯的鏈；為解決錯(cuò)配問題，有利于已編輯過的DNA永久安裝，一個(gè)不同的gRNA指引Prime editor去剪切未編輯的鏈；剪切產(chǎn)生的缺口提示細(xì)胞以編輯過的鏈為模板，重新生成新的鏈，最終完成編輯[116]。

圖3 先導(dǎo)編輯系統(tǒng)工作原理示意圖[115]Fig.3 Schematic diagram of the function in prime editing[115]

先導(dǎo)編輯是一種“搜索和替換”的基因組編輯技術(shù)，它可以在不需要DSBs或供體DNA 模板的情況下，在人類細(xì)胞中介導(dǎo)目標(biāo)堿基的插入、刪除以及12種可能的堿基到堿基的轉(zhuǎn)換以及它們的組合。David R.Liu團(tuán)隊(duì)首先用一個(gè)編碼野生型M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶融合體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，該質(zhì)粒通過柔性接頭到達(dá)Cas9 H840A切口酶的任一末端，另一個(gè)質(zhì)粒編碼pegRNA，結(jié)果顯示pegRNA在8～15個(gè)堿基中的延伸導(dǎo)致在HEK3靶位點(diǎn)可檢測到堿基發(fā)生顛換，當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶融合到Cas9酶的C末端時(shí)編輯效率更高，同時(shí)編輯效率也取決于PBS序列的長度，試驗(yàn)結(jié)果顯示在HEK293T細(xì)胞中最大編輯效率可達(dá)0.7%～5.5%[115]?？茖W(xué)家將 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶與 Cas9 H840A的 C端的融合命名為 PE1（Prime editor 1）。將D200N+L603W+T330P引入到M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶中，經(jīng)過篩選，在原有的基礎(chǔ)上添加T306K和W313F，這種結(jié)合到 PE1中的五種突變逆轉(zhuǎn)錄酶（Cas9 H840A-M-MLV RT D200N＋L603W＋T330P＋T306K＋W313F）被命名為PE2。PE2比PE1更有效地進(jìn)行了定向插入和刪除，使得先導(dǎo)編輯的定點(diǎn)突變率提高了1.6～5.1倍。為進(jìn)一步優(yōu)化堿基編輯，使用Cas9切口酶對未編輯的鏈進(jìn)行切割，通過在HEK293T細(xì)胞的五個(gè)基因組位點(diǎn)測試，產(chǎn)生了 PE3，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了含有與編碼鏈匹配的間隔子的 sgRNAs，最大限度地減少DSB和indel的形成?？偟膩碚f，先導(dǎo)編輯提供了更加精確的方法進(jìn)行基因編輯，且在原有的只能進(jìn)行堿基轉(zhuǎn)換的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了創(chuàng)新性的突破，使得在基因治療等領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)有效、精確地將DNA序列插入到活細(xì)胞的目標(biāo)位置成為可能。

2020年，研究人員通過密碼子、啟動(dòng)子和編輯條件優(yōu)化，成功地將先導(dǎo)編輯技術(shù)應(yīng)用于水稻和小麥中，其編輯效率達(dá)到21.8%[117]。同年4月，首次報(bào)道了在人類HEK293T細(xì)胞8個(gè)位點(diǎn)中驗(yàn)證了先導(dǎo)編輯，并在小鼠體內(nèi)證明了先導(dǎo)編輯系統(tǒng)的多功能性，這是首次報(bào)道使用先導(dǎo)編輯在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生靶向的堿基轉(zhuǎn)換突變，這也為先導(dǎo)編輯在修復(fù)遺傳性疾病方面的潛力提供了數(shù)據(jù)支持[118]。試驗(yàn)研究顯示使用先導(dǎo)編輯技術(shù)對鐮刀細(xì)胞貧血癥的血紅蛋白基因進(jìn)行修復(fù)，有效率可達(dá)58%，僅有1.4%出現(xiàn)了以外的插入或缺失，同時(shí)先導(dǎo)編輯技術(shù)修復(fù)Tay-Sachs病的HEXA基因的有效率也達(dá)到了33%，意外插入和缺失只有0.32%，研究人員推斷該技術(shù)理論上可以修復(fù)75000種已知致病性人類遺傳變異的89%[119]。

4 堿基編輯系統(tǒng)的發(fā)展前景

2017年堿基編輯技術(shù)被Science雜志評為全球時(shí)代年度科學(xué)突破之一，2020年美國科學(xué)院公布未來10年農(nóng)業(yè)發(fā)展的五大方向中的“突破性的基因組學(xué)和精準(zhǔn)育種技術(shù)”是以基因編輯技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用作為核心技術(shù)導(dǎo)向，由此可見基因編輯系統(tǒng)的發(fā)展具有巨大的潛力。隨著CRISPR/Cas技術(shù)、胞嘧啶堿基編輯技術(shù)、腺嘌呤堿基編輯技術(shù)以及最近研發(fā)的先導(dǎo)編輯系統(tǒng)等基因編輯工具的不斷更新，編輯的范圍從原有的低精確度，到實(shí)現(xiàn)單堿基的轉(zhuǎn)換，再到可實(shí)現(xiàn)任意堿基之間的替換，不斷改進(jìn)的過程，indels也不斷降低，讓我們更加地堅(jiān)信在未來的基因治療、基因功能鑒定等方面會向著更加精準(zhǔn)化、有效化的方向展開，并將其應(yīng)用在動(dòng)植物，尤其是昆蟲的防治中去。堿基編輯技術(shù)在昆蟲中應(yīng)用，將為害蟲管理提供新的研究方向，以維持生態(tài)平衡為前提對有害生物等進(jìn)行有效防控，減少對農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的不利影響，保證農(nóng)林牧等產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。