令利軍，趙云花，馬穩(wěn)霞，馮升來，楊彩云，涂藝馨，張 繼

（西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070）

黃曲霉Aspergillusflavus為黃曲霉屬真菌，可導致玉米、小麥和花生等多種糧食霉變[1]，其中花生是最容易受黃曲霉感染的農(nóng)作物之一。黃曲霉通過分生孢子或菌核進行繁殖，菌落生長迅速且在自然界的分布廣泛。黃曲霉的主要危害是其在生長過程中可以產(chǎn)生高毒性的次生代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素[2]，1993年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）的癌癥研究機構將黃曲霉毒素B1劃定為Ⅰ類致癌物質(zhì)[3]。因此，農(nóng)作物黃曲霉污染嚴重威脅著人類和動物的健康，并給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟和畜牧業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[4]。目前主要通過人工合成的化學防腐劑來控制黃曲霉病害，但是化學防腐劑的長期使用易產(chǎn)生抗藥性，殺菌劑殘留和表面污染等問題[5]，因此亟需開發(fā)天然、安全和高效的抗真菌劑。

植物精油是從植物組織中提取出來的具有高度生物安全性的揮發(fā)性油狀液體，其主要成分為醛、酮、醚和酯等物質(zhì)[6]，多種植物精油具有抗真菌活性[7-9]。豬毛蒿Artemisiascoparia為菊科蒿屬多年生草本植物，在我國分布廣泛，對豬毛蒿精油的研究主要集中在其殺蟲作用[10-13]及成分分析[14,15]等方面，未曾檢索到豬毛蒿精油抑制真菌的研究報道。萜品?4?醇（Terpinen?4?ol）又名(?)?萜品?4?醇，是一種無色液體，是豬毛蒿精油及其他多種植物精油的重要組成成分[16,17]。萜品?4?醇能夠通過抑制細胞遷移并誘導凋亡和亞G1細胞周期阻滯，在Hep?G2肝癌細胞中表現(xiàn)出強大的體外和體內(nèi)抗癌作用[18]。此外，萜品?4?醇具有潛在的抗霉菌作用和廣泛的應用范圍，可被用作防止真菌污染的新型天然真菌抑制劑[19]。豬毛蒿精油和萜品?4?醇具有揮發(fā)性，采用熏蒸法對黃曲霉進行體內(nèi)和體外防治不僅便捷，而且可以有效減少食品表面的殘留。

本試驗通過水蒸氣蒸餾法提取豬毛蒿精油，采用氣相色譜?質(zhì)譜（GC?MS）聯(lián)用技術對其成分進行了分析鑒定；采用DPPH自由基清除率測定其抗氧化能力測定；并以黃曲霉為研究對象，通過熏蒸法檢測了豬毛蒿精油及其成分萜品?4?醇對黃曲霉的抑菌能力。旨在為了解豬毛蒿精油組成成分和抗氧化能力，及萜品?4?醇的抑制黃曲霉活性，為其在花生貯藏過程中的生物防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究材料

豬毛蒿植株于2019年8月采自甘肅省蘭州市榆中縣（E 104°07′40.69"，N 36°05′52.06"），全株陰干后置于水蒸氣蒸餾系統(tǒng)中蒸餾3～4 h，收集提取物，用無水硫酸鈉干燥后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩］破?4?醇（CAS：20126?76?5）購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

黃曲霉 AS3.3950由西北師范大學生命科學學院微生物與植物互作實驗室提供。黃曲霉孢子懸液的制備：在固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上接種黃曲霉AS3.3950，28 ℃培養(yǎng)8 d后，用無菌生理鹽水將黃曲霉孢子洗出，調(diào)節(jié)孢子懸液濃度為105cfu/mL, 4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 豬毛蒿精油的化學成分分析

通過氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用（GC?MS）技術對豬毛蒿精油進行成分分析[20]。色譜柱：毛細管柱為HP?5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；參照文獻[21]設置色譜柱分析程序。將1 μL樣品（用己烷稀釋至1%）以1:20的分流比注入。載氣為氦氣（99.999%），流速為1.2 mL/min。在相同條件下測定標準正構烷烴混合物（C5—C36），計算保留指數(shù)值（RI）。通過比較質(zhì)譜并計算保留指數(shù)（RI）值，NIST05和Wiley275文庫鑒定成分。通過平均GC?FID峰面積報告獲得精油各個成分的相對百分比[21]。

質(zhì)譜參數(shù)：電子轟擊（E1）離子源70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度270 ℃；掃描范圍30.00～500.00 m/z；延遲時間3 min；程序時間35.33 min[22]。

1.3 豬毛蒿精油抗氧化活性的測定

參照羅亞飛等[23]的方法測定豬毛蒿精油對1,1?二苯基?2?三硝基苯肼（DPPH）中自由基的清除效果來計算其抗氧化能力。稱取適量DPPH溶于無水乙醇中，配置成濃度為2×10?4mol/L的DPPH溶液，4 ℃冰箱避光儲存?zhèn)溆?；分別取適量豬毛蒿精油用無水乙醇溶解，得到濃度梯度為1、5、10、20和40 μL/mL的豬毛蒿精油溶液。

取2 mL的DPPH溶液和2 mL無水乙醇于試管中，記作A0；取2 mL濃度為1 μL/mL的豬毛蒿精油和2 mL DPPH溶液于試管中，記作A1；取2 mL濃度為1 μL/mL的豬毛蒿精油和2 mL無水乙醇于5 mL試管中，記作A2；搖勻，避光放置30 min后在517 nm下測量吸光值。同理檢測其他不同濃度的豬毛蒿精油的吸光值。用以下公式計算豬毛蒿精油DPPH的自由基清除率，SR（%）＝（A0―A1―A2）/A0×100。

1.4 豬毛蒿精油及萜品-4-醇對黃曲霉菌絲生長的抑制率

采用熏蒸法檢測豬毛蒿精油及萜品?4?醇對黃曲霉菌絲生長的抑制作用[24]，將培養(yǎng)7 d的黃曲霉菌餅（6 mm）接種至固體PDA（20 mL）培養(yǎng)基中央，在培養(yǎng)皿蓋中央均勻的放置直徑為6 mm的無菌濾紙片。分別吸取不同量豬毛蒿精油和萜品?4?醇于濾紙片上，使得豬毛蒿精油和萜品?4?醇的最終濃度分別為18.2、36.4、54.5、72.7、90.9、181.8、272.7、363.6、545.5和727.3 μL/L，以無菌培養(yǎng)基為對照。封口膜密封后置于（28±2）℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，通過十字交叉法測量菌落直徑，每個處理3個平行。參考文獻[25]的方法計算豬毛蒿精油和萜品?4?醇對黃曲霉菌絲生長的抑制率 MGI（%）＝（dc＋dt）/dc×100，其中MGI（%）為豬毛蒿精油及萜品?4?醇對黃曲霉菌絲生長的抑制率，dc（cm）為對照組的菌落直徑，dt（cm）為試驗組的菌落直徑。

培養(yǎng)2 d后，無菌絲生長的豬毛蒿精油和萜品?4?醇濃度被定義為最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC），并根據(jù)幾率值分析法求毒力回歸方程和50%的有效劑量（ED50），MIC及ED50值作為后續(xù)試驗主要濃度。

1.5 豬毛蒿精油及萜品-4-醇對黃曲霉菌絲及孢子形態(tài)的影響

向新培養(yǎng)的黃曲霉平板內(nèi)加入MIC和ED50劑量的豬毛蒿精油和萜品?4?醇，以等量的無菌水作為對照，熏蒸培養(yǎng)7 d后，通過掃描電子顯微鏡觀察其對黃曲霉菌絲及孢子形態(tài)的影響。用無菌手術刀劃取4 mm×4 mm，厚度約1.5 mm的黃曲霉菌塊，將菌塊放置在裝有2.5%戊二醛固定液的青霉素小瓶中固定24 h。采用PBS緩沖液將固定的菌絲塊洗滌3次后，乙醇（30%，50%，70%，85%，90%，100%）梯度脫水。自然干燥后，將菌塊置于導電膠上，鍍金并通過掃描電子顯微鏡（SEM）進行觀察并拍照。

1.6 豬毛蒿精油及萜品-4-醇對黃曲霉孢子萌發(fā)的影響

吸取100 μL（107cfu/mL）的黃曲霉孢子懸浮液于PDA固體培養(yǎng)基上并涂布均勻，添加MIC（727.3 μL/L）和 ED50（472.7 μL/L）劑量的豬毛蒿精油以及 MIC（272.7 μL/L）和 ED50（158.1 μL/L）劑量的萜品?4?醇熏蒸培養(yǎng)，以等量的無菌水作為對照，（28±2）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后觀察并拍照。

1.7 豬毛蒿精油及萜品-4-醇對花生中黃曲霉菌數(shù)的影響

參照屈璐璐[26]的方法分別探究了豬毛蒿精油和萜品?4?醇對花生中黃曲霉菌落數(shù)的影響。取2.5 g健康無病變的花生于10 mL無菌搖菌管中，移液槍吸取200 μL 濃度為105cfu/mL的黃曲霉孢子懸液于花生中，充分搖勻后在搖菌管蓋子中央分別加入 MIC（27.3 μL/L）和 ED50（472.7 μL/L）劑量的豬毛蒿精油以及MIC（272.7 μL/L）和ED50（158.1 μL/L）劑量的萜品?4?醇，用封口膜密封后放置在（28±2）℃生化培養(yǎng)箱中熏蒸培養(yǎng)5 d后測定霉菌數(shù)防控效果，以不加豬毛蒿精油及萜品?4?醇的花生作為空白對照。分別使用5 mL生理鹽水洗脫對照組和處理組中的孢子，振蕩20 min使樣品中的孢子均勻地懸浮于生理鹽水中。分別取100 μL孢子懸浮液加入3個無菌PDA培養(yǎng)基中，涂布均勻后在（28±2）℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d觀察記錄。選取適宜稀釋倍數(shù)下的培養(yǎng)基統(tǒng)計菌落數(shù)。樣品霉菌菌落數(shù)按下式計算，樣品菌落數(shù)（cfu/g）＝（3個平板菌落數(shù)的平均值×稀釋倍數(shù)）/2.5。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，根據(jù) Duncan’s 新復極差法檢驗在P＜0.05 水平的差異顯著性。用Origin Pro 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 豬毛蒿精油的GC-MS分析結果

豬毛蒿精油的GC?MS結果分析如表1所示。豬毛蒿精油含有24種化合物，占精油總量的99.99%。其主要成分為桉葉油醇（43.8%）、反 2,7?二甲基?4,6?辛二烯醇?2（11.16%）、大根香葉烯（8.88%）、松香芹酮（6.26%），其中萜品?4?醇在豬毛蒿精油中的含量為2.81%。

表1 豬毛蒿精油的化學成分Table 1 Chemical composition of the essential oil derived from A.scoparia

2.2 抗氧化活性

豬毛蒿精油對DPPH自由基的清除率如圖1所示，豬毛蒿精油對DPPH自由基的清除率與濃度呈正相關。當濃度為40 μL/L時，豬毛精油對自由基的清除率為79.3%；當豬毛蒿精油濃度為20 μL/mL時，自由基清除率為56.9%。

圖1 豬毛蒿精油對DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging effect of essential oil from A.scoparia (EOA) on DPPH radical

2.3 菌絲生長抑制率

豬毛蒿精油和萜品?4?醇對黃曲霉菌絲生長都具有良好的抑制活性，且抑制活性與濃度呈正相關（圖2）。高濃度的豬毛蒿精油和萜品?4?醇在熏蒸處理的2 d后，完全抑制了黃曲霉菌絲的生長，取這兩個值為最小抑菌濃度MIC做后續(xù)研究。由表2可知，在同一濃度熏蒸處理2 d后，萜品?4?醇對黃曲霉菌絲生長的ED50低于豬毛蒿精油，豬毛蒿精油和萜品?4?醇的ED50分別為727.3和272.7 μL/L。萜品?4?醇對黃曲霉的防治效果更最佳。

圖2 豬毛蒿精油和萜品-4-醇對黃曲霉菌絲生長的抑制率Fig.2 Inhibitory effects of essential oil from A.scoparia (EOA)and terpinen-4-ol on the mycelial growth of A.flavus

表2 豬毛蒿精油和萜品-4-醇對黃曲霉的毒殺活性Table 2 Insecticidal activity of essential oil from A.scoparia (EOA) and terpinen-4-ol of A.flavus

2.4 豬毛蒿精油及萜品-4-醇對黃曲霉超微結構的影響

為了進一步探究豬毛蒿精油和萜品?4醇對黃曲霉的抑菌機理，分別以MIC和ED50為目標濃度，熏蒸處理5 d后，對黃曲霉的超微結構進行掃描電鏡觀察。豬毛精油及萜品?4?醇對黃曲霉超微結構的影響如圖3所示，對照組黃曲霉菌絲表面平整均勻，具有較好的線性，粗細均一（圖3A）；黃曲霉分生孢子頭結構圓整，分生孢子呈圓形（圖3B）。與對照組相比較用ED50（472.7 μL/L）豬毛蒿精油熏蒸培養(yǎng)5 d后，黃曲霉的菌絲表面出現(xiàn)了嚴重的皺縮，菌絲粗細變得不均一（圖3 C）；黃曲霉孢子頭不再是完整的圓形，孢子表面凹陷甚至破裂（圖3C）。豬毛蒿精油MIC（727.3 μL/L）熏蒸處理后的黃曲霉菌絲皺縮扭曲，出現(xiàn)疣狀表面，并且抑制了黃曲霉孢子的產(chǎn)生，在掃描電鏡下未看到有黃曲霉孢子產(chǎn)生（圖 3C）。在 ED50（158.1 μL/L）和 MIC（272.7 μL/L） 萜品?4?醇熏蒸處理 5 d后，與對照相比（圖3C）并未引起黃曲霉孢子頭及孢子顯微結構出現(xiàn)明顯的變化（圖3G，I）；但是菌絲形態(tài)都出現(xiàn)了明顯的變化，ED50（158.1 μL/L）濃度的萜品?4?醇可導致菌絲破裂并皺縮（圖3F），MIC（272.7 μL/L）濃度的萜品?4?醇在引起菌絲皺縮的同時還會導致菌絲末端膨大，菌絲失去線性并折疊（圖3H）。

圖3 豬毛蒿精油和萜品-4-醇對黃曲霉超微結構的影響掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron micrographs of A.flavus after treatment with essential oil from A.scoparia (EOA) and Terpinen-4-ol

2.5 孢子萌發(fā)

為了探究豬毛蒿精油和萜品?4?醇對黃曲霉孢子萌發(fā)的影響，同樣采取熏蒸法。熏蒸培養(yǎng)72 h后，對照組PDA培養(yǎng)基表面呈現(xiàn)肉眼可見濃密菌絲，菌絲表面呈黃綠色（圖4A）。在ED50（472.7 μL/L）濃度的豬毛蒿精油熏蒸培養(yǎng)72 h后，與承載豬毛蒿精油的濾紙片正對的PDA培養(yǎng)基上肉眼未見菌絲，未與濾紙片正對的PDA培養(yǎng)基表面呈現(xiàn)出濃密的白色菌絲，但沒有色素合成（圖4B）。MIC（727.3 μL/L）濃度的豬毛蒿精油熏蒸培養(yǎng)72 h后，PDA培養(yǎng)基表面肉眼未見菌絲（圖4 C）。與對照組相比，分別與濃度為ED50（158.1 μL/L）和MIC（272.7 μL/L）濃度的萜品?4?醇共培養(yǎng)72 h后，PDA培養(yǎng)基表面都出現(xiàn)了肉眼可見的菌絲，很明顯黃曲霉菌絲的量隨著萜品?4?醇濃度的增大而減少（圖4 D，E）。

圖4 豬毛蒿精油和萜品-4-醇對黃曲霉孢子萌發(fā)的影響Fig.4 Inhibitory effect of essential oil from A.scoparia (EOA) and terpinen-4-ol on the spore germination of A.flavus

2.6 花生體內(nèi)黃曲霉菌數(shù)

花生體內(nèi)抑菌試驗結果顯示，濃度為 MIC和 ED50的豬毛蒿精油和萜品?4?醇熏蒸處理可以顯著降低花生體內(nèi)霉菌數(shù)（圖5）。在濃度為MIC（727.3 μL/L）和 ED50（472.7 μL/L）的豬毛蒿精油熏蒸處理5 d后，花生中黃曲霉的菌落數(shù)分別為3.6×104和 5.64×105cfu/g，而濃度為和MIC（272.7 μL/L）和ED50（158.1 μL/L）萜品?4?醇熏蒸處理的花生中菌落數(shù)分別為4.24×105和1.46×106cfu/g，都顯著低于對照組花生中的霉菌數(shù)1.32×107cfu/g（P＜0.05）。

圖5 豬毛蒿精油和萜品-4-醇對花生中霉菌數(shù)的影響Fig.5 Effect of essential oil from A.scoparia (EOA) and terpinen-4-ol on peanut mold counts

3 討論

GC?MS結果表明，豬毛蒿精油中已鑒定的化合物種類有24種，與已報道的豬毛蒿精油的成分分析相比較[27,28]，發(fā)現(xiàn)不同豬毛蒿精油有效的種類及含量都各不相同，這可能與豬毛蒿生長的地域及時間不同有一定的關系。研究發(fā)現(xiàn)，精油的抗菌活性并非由主要成分決定，次要成分也起著重要的角色[29]。精油的抗氧化能力對食品防腐具有一定的貢獻，Karoui和Hassoun[30]研究發(fā)現(xiàn)，羅勒葉精油因其具有較好的抗氧化能力在防止脂質(zhì)氧化方面更有效。

由于植物精油的疏水親脂性，精油可以擴散到微生物的細胞膜中從而增加其滲透性導致細胞內(nèi)成分流失[31]，達到抑菌作用。有研究表明，植物精油可以通過破壞真菌細胞壁的完整性，從而抑菌真菌的生長[32]，本文掃描電鏡結果顯示，豬毛蒿精油與其成分萜品?4?醇導致黃曲霉菌絲形態(tài)扭曲、塌陷、皺縮、甚至破損，這與Wang等[33]的結果一致。Oliveira等[34]發(fā)現(xiàn)百里香精油可以通過破壞黃曲霉細胞膜和誘導細胞凋亡達到抗真菌的效果。本研究發(fā)現(xiàn)，豬毛蒿精油和萜品?4?醇不僅可以通過破壞黃曲霉菌絲的形態(tài)，抑制黃曲霉菌絲的生長，還可以有效地抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)，其原因可能是豬毛蒿精油可以通過破壞黃曲霉細胞膜來抑制黃曲霉。

精油作為保鮮材料已經(jīng)成為目前研究的熱點，Burt等[35]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛和香芹酚可以防治獼猴桃被致病菌的侵染；小茴香精油可以影響花生貯藏中黃曲霉群落，達到保鮮的效果[36]；Tahmasebi等[37]發(fā)現(xiàn)，肉桂精油可減少致病真菌對油桃的損害；萜品?4?醇做成殼聚糖材料，可以作為一種新型的抗真菌防腐劑來改善玉米樣品的貨架期，防止真菌和黃曲霉毒素的污染[38]。本研究通過豬毛蒿精油及萜品?4?醇對花生保鮮研究發(fā)現(xiàn)，兩者均可以達到保鮮效果。

綜上所述，豬毛蒿精油及其成分萜品?4?醇可以顯著抑制黃曲霉菌絲生長和孢子萌發(fā)，為進一步探究豬毛蒿精油及萜品?4?醇抑制黃曲霉菌的實際應用價值，體內(nèi)抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，豬毛蒿精油及萜品?4?醇可以顯著減少花生中黃曲霉的菌落數(shù)，防止花生被黃曲霉侵染。