薛剛 劉杰 許利軍 石建 凌博凡

摘要 目的：研究扶正消積膠囊在體外對人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖抑制及凋亡的影響。方法：MTT實驗檢測扶正消積膠囊對BGC-823細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀檢測其對BGC-823細(xì)胞凋亡的影響;Real Time-PCR、Western blotting實驗檢測其凋亡相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果：與空白組比較，BGC-823細(xì)胞的增殖能被扶正消積膠囊顯著抑制（給藥24 h），此抑制率隨給藥劑量的增加而上升，在劑量為5 mg/ mL時，其抑制率達(dá)86.71%，且這種抑制呈劑量依賴關(guān)系。Annexin V/PI雙染法聯(lián)合流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示扶正消積膠囊能誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞凋亡，BGC-823細(xì)胞早期凋亡率隨給藥劑量的增加，在給藥劑量分別為2.5 mg/mL、5 mg/mL時，BGC-823細(xì)胞早期凋亡率分別達(dá)到15.76%、38.25%;Western blotting、Real Time-PCR結(jié)果表明，Procaspase-3、9蛋白酶表達(dá)隨劑量的增加而明顯減小，Bcl-2、Bcl-xl、Survivin 3種基因表達(dá)隨給藥劑量的增加而下降，Bax基因表達(dá)則相反。結(jié)論：扶正消積膠囊能通過激活caspase級聯(lián)反應(yīng)抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

關(guān)鍵詞 扶正消積膠囊;BGC-823胃癌細(xì)胞;腫瘤;增殖;凋亡

Abstract Objective：To investigate the influence of Fuzheng Xiaoji Capsule on the proliferation inhibition of human gastric cancer cell BGC-823 and its apoptosis.Methods：Effects of Fuzheng Xiaoji Capsule on proliferation of BGC-823 cells were investigated with MTT assay.Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis while the effect of apoptosis related gene of Fuzheng Xiaoji capsule on BGC-823 cell was measured by real time-PCR and Western blotting.Results：MTT assay showed that the BGC-823 cells were inhibited by Fuzheng Xiaoji Capsule compared with control group，after treated on 24 h.The inhibition rate increases with the increase of dose，which is dose dependent.At the dose of 5 mg/mL，the inhibition rate reached 86.71%（P<0.05）.Flow cytometry demonstrated that Fuzheng Xiaoji Capsule could induce the apoptosis of BGC-823 cells.The early apoptosis rate of BGC-823 cells increased with the dose of the drug.At the dose of 2.5 mg/mL and 5 mg/mL，respectively，the early apoptosis of BGC-823 cells reached 15.76% and 38.25% respectively.By the results of Western blotting and real time-PCR，the expression of caspase-3、caspase-9 was significantly lower as the dose increased.Also，it could reduce the activity of Bcl-2，Bcl-xl，Survivin and increase the activity of Bax.Conclusion：Fuzheng Xiaoji Capsule could inhibit the proliferation of BGC-823 cells and induce their apoptosis.The possible mechanism was through activation of caspase cascade reaction.

Keywords Fuzheng Xiaoji Capsule; BGC-823 human gastric cancer cell; Cancer; Proliferation; Apoptosis

中圖分類號：R273文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.005

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，也是我國常見的惡性腫瘤之一，在我國西北以及東部沿海地區(qū)胃癌發(fā)病率高居首位[1-3]。手術(shù)仍是目前治療胃癌的主要手段，術(shù)后化療在胃癌治療中占重要地位，不良反應(yīng)是大多數(shù)胃癌患者無法完成既定化療療程的主要原因。近年來，中醫(yī)藥在治療胃癌方面取得重大進(jìn)展，尤其是在改善臨床癥狀、提高生命質(zhì)量、延長生存時間等方面療效肯定[4-5]。臨床工作中，中藥與化療相結(jié)合既能提高化療效果，亦能減輕化療不良反應(yīng)。

扶正消積膠囊為如皋市中醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有益氣健脾、解毒消積、活血通絡(luò)、抗癌止痛之功效。多年的臨床使用發(fā)現(xiàn)，扶正消積膠囊治療各類腫瘤具有相當(dāng)好的療效，因而我們以胃癌細(xì)胞為目標(biāo)進(jìn)行實驗，探討扶正消積膠囊治療胃癌的相關(guān)分子機(jī)制[6-7]，進(jìn)一步為扶正消積膠囊臨床治療打下堅實的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株BGC-823，購買自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，培養(yǎng)液用1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清以及1%雙抗），孵箱環(huán)境：37 ℃以及含5%CO2。

1.1.2 藥物 扶正消積膠囊（組成：黃芪、白花蛇舌草、水紅花子、黨參、生大黃、三棱、炒薏苡仁、莪術(shù)、蜈蚣、炙鱉甲、西洋參、參三七、全蝎），如皋市中醫(yī)藥院內(nèi)制劑;蘇藥制字Z04001609，生產(chǎn)批號：100614。

1.1.3 試劑與儀器 1640培養(yǎng)液（Gibco公司，美國，貨號：2058872）;胎牛血清（常州四季青公司，貨號：22011-8612）;四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（Biosharp公司，貨號：BS186）;流式凋亡試劑盒（凱基公司，貨號：KGA107）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本，貨號：RR820A）;β-actin一抗（Sigma公司，美國，貨號：MAB1501）;Caspase-3一抗（貨號：SC-2375）、Caspase-9一抗（貨號：SC-2146）、Bax一抗（貨號：SC-2314）、Bcl-2一抗（貨號：SC-2319），以上購自美國Santa cruz公司;山羊抗鼠二抗（貨號：20180515）、山羊抗兔二抗（貨號：20180536），以上購自北京中杉生物技術(shù)公司;全自動酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國，型號：00099192）;超速離心機(jī)（型號：ZCKP20181200100019）、流式細(xì)胞儀（型號：ZCKP020200300100413）、ABI熒光定量PCR儀（型號：ZCKP0201301001001331）、伯樂凝膠成像儀（型號：ZCKP020130100100132），以上購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT實驗 將細(xì)胞接種于96孔板，每孔8×103個細(xì)胞，培育12 h，待細(xì)胞貼壁后，觀察組給予扶正消積膠囊，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選擇劑量依次為5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL，0.625 mg/mL;另設(shè)1個陰性對照組，含1‰DMSO的1640培養(yǎng)液，對照組不加任何藥物，培養(yǎng)24 h后，向96孔中每孔加入120 μL 1640培養(yǎng)液，其中含MTT 20 μL，培養(yǎng)箱中培育4 h后，棄上清液，酶標(biāo)儀490 nm波長測量96孔板每孔的吸光值，計算扶正消積膠囊對BGC-823細(xì)胞增殖的抑制率，抑制率=（1-觀察組/對照組）×100%，實驗重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均值，繪制成柱狀圖。

1.2.2 Annexin-V/PI雙染法 消化下貼壁細(xì)胞，接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿3×105個細(xì)胞，放置培養(yǎng)箱，待細(xì)胞貼壁后給藥，設(shè)2個給藥組劑量分別為5 mg/ mL、2.5 mg/mL，1個5-FU陽性對照組50 μg/ mL，1個不加任何藥物的空白對照組。24 h后，離心收集消化下來的細(xì)胞，每組中加入Binding Buffer 500 μL，重懸各管，向各管中加入5 μL PI以及5 μL Annexin-V，隨后在暗室中避光振蕩約10 min，在流式細(xì)胞儀中檢測各藥物劑量的胃癌細(xì)胞凋亡情況。

1.2.3 RT-PCR實驗 消化下貼壁細(xì)胞，接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿，給藥方法同上，24 h后，提取各劑量組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計計算出所提取RNA質(zhì)量，經(jīng)TaKaRa RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄完成后，根據(jù)Primer Premier 3.0軟件分別設(shè)計PCR引物。見表1。隨后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。將PCR Forward Primer（10 μmol/L）、Power SYBR Green（2×）、PCR Reverse Primer（10 μmol/L）、dH2O體系混合，7500Fast PCR儀行擴(kuò)增反應(yīng)，先是預(yù)變性：95 ℃ 30 s，循環(huán)1次;然后PCR：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次，最后進(jìn)行融解曲線分析：95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s，循環(huán)1次，實驗中設(shè)置3個復(fù)孔，提煉出不同標(biāo)本Ct值。公式△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參照基因Ct值（內(nèi)參為β-actin），△△Ct=觀察組△Ct-對照組△Ct，得出各劑量組標(biāo)本RQ值（RQ=2-△△Ct）。結(jié)果繪制成柱狀圖。實驗重復(fù)3次，取3次實驗平均值。

1.2.4 Western Blotting實驗 將消化下來的胃癌細(xì)胞接種于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿，給藥方法同上，給藥24 h后，提取各組劑量相關(guān)蛋白，隨后用Bradford法進(jìn)行蛋白劑量測量，不同劑量組各取20 μg蛋白經(jīng)SDS PAGE分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，有蛋白一面向上放入預(yù)先配制好的5%牛奶封閉液中封閉1 h，再向塑封膜里加入一抗，放置于4 ℃冰箱過夜，次日取出PVDF膜，濾紙貼角稍吸干，PBST溶液洗去一抗，加入二抗，室溫孵育1 h后，同上洗去二抗，向PVDF膜上滴入ECL液，予暗室中進(jìn)行發(fā)光，最后得出Western Blotting條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組兩兩比較采用q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 扶正消積膠囊對人胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖抑制 經(jīng)MTT實驗檢測，結(jié)果顯示不同劑量的扶正消積膠囊作用于BGC-823細(xì)胞24 h后，在劑量為5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL時，其對BGC-823細(xì)胞抑制率分別達(dá)到（86.71±4.2）%，（68.44±5.3）%，（43.16±3.8）%，（25.63±2.9）%。見圖1。與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果亦顯示，扶正消積膠囊對BGC-823細(xì)胞的增殖抑制率隨著給藥劑量的增加而增加，在劑量為5 mg/mL時，其對BGC-823細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到一個峰值，呈劑量依賴關(guān)系。

2.2 扶正消積膠囊對人胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡的影響 通過MTT試驗，我們檢測出不同劑量扶正消積膠囊作用胃癌細(xì)胞BGC-823 24 h的抑制率，據(jù)此，我們選用一個高劑量5 mg/mL、中劑量2.5 mg/mL以及用常見的化療藥物5-FU作為陽性對照組作為檢測藥物劑量，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡結(jié)果示：扶正消積膠囊在作用于人胃癌細(xì)胞BGC-823 24 h后，BGC-823細(xì)胞早期凋亡率隨著給藥劑量的增加，從6.12%增加到15.76%、38.25%（P<0.05），而5-FU陽性對照組早期凋亡為14.43%，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 扶正消積膠囊對于胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR實驗結(jié)果表明，扶正消積膠囊作用于人胃癌細(xì)胞BGC-823 24 h后，Bcl-2、Bcl-xl、Survivin mRNA的表達(dá)隨劑量的上升而下降，Bax mRNA的表達(dá)則相反，表明扶正消積膠囊能下調(diào)Bcl-2、Bcl-xl、Survivin mRNA的表達(dá)，上調(diào)Bax mRNA的表達(dá)。見表2。

2.4 扶正消積膠囊對胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 Western Blotting實驗結(jié)果表明，通過流式細(xì)胞儀檢測扶正消積膠囊對BGC-823細(xì)胞早期凋亡，結(jié)果顯示扶正消積膠囊能誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡，據(jù)此，運(yùn)用Western Blotting實驗探討其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。在給藥24 h后，與對照組比較，5 mg/mL、2.5 mg/mL劑量組Procaspase-3、9蛋白酶表達(dá)量隨給藥劑量的增加而明顯減小，Bax蛋白條帶表達(dá)量隨著給藥劑量的上升明顯增高，Bcl-2蛋白表達(dá)則相反。根據(jù)實驗結(jié)果可以得出，扶正消積膠囊其能激活Caspase-3、9活性以及上調(diào)Bax蛋白表達(dá)下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，從而引起B(yǎng)GC-823細(xì)胞凋亡。見圖3、圖4。

3 討論

細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)節(jié)的自主調(diào)控過程，在腫瘤的個體發(fā)育以及發(fā)病機(jī)制中有著非常重要的作用，過度增殖加上細(xì)胞凋亡程序的紊亂，是導(dǎo)致惡性腫瘤產(chǎn)生的主要原因[8]。探索腫瘤發(fā)病的機(jī)制以及尋找有效治療腫瘤的方法是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點。根據(jù)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制，目前治療腫瘤有效的方法之一則是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程的再啟動，因而目前很多學(xué)者重點研究腫瘤細(xì)胞凋亡信號通路的調(diào)控機(jī)制。根據(jù)凋亡信號的來源認(rèn)為細(xì)胞凋亡是受細(xì)胞內(nèi)外因子調(diào)控的[9-10]：外在的死亡受體介導(dǎo)通路;內(nèi)在線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）介導(dǎo)的凋亡通路。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（Caspase）引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡過程的中心環(huán)節(jié)，在多種癌細(xì)胞如胃癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、宮頸癌等發(fā)現(xiàn)該基因的都存在異常表達(dá)[11-14]。作為最重要的細(xì)胞凋亡途徑執(zhí)行因子之一，Caspase-3蛋白通過上游的啟動因子Caspase蛋白酶原（Procaspase）切割特異性底物，激活下游Caspase蛋白，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15-16]。此外，目前研究亦證實了凋亡基因中存在非Caspase依賴的信號通路，Bcl-2家族蛋白就是其中一員[17-18]。根據(jù)結(jié)構(gòu)以及功能不同將其家族成員分為促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bad、Bim等）凋亡誘導(dǎo)因子和抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bel-xL、Bcl-W等）凋亡誘導(dǎo)因子2種類型[19-20]。有學(xué)者研究二者之間關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Bcl-2家族蛋白成員間的相互作用對Caspase-3、Caspase-9凋亡通路起調(diào)控作用[21]。據(jù)此，為研究扶正消積膠囊誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，我們選擇探討其對線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路（Caspase-3、Caspase-9）以及Bcl-2家族蛋白（Bax、Bcl-2）的這2種蛋白表達(dá)的影響。

“扶正消積”概念取自中醫(yī)治療疾病的思想：祛邪扶正、調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽平衡。本實驗以此為理念，探討本院院內(nèi)制劑扶正消積膠囊其對胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)扶正消積膠囊能抑制BGC-823細(xì)胞增殖，通過流式細(xì)胞儀聯(lián)合Annexin-V/PI雙染法實驗結(jié)果顯示，扶正消積膠囊對胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞早期凋亡率從6.12%增加到15.76%、38.25%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，呈劑量依賴關(guān)系;在基因蛋白檢測方面，結(jié)果表明：Bcl-2、Bcl-xl、Survivin基因表達(dá)則下降，Bax基因蛋白的表達(dá)隨著給藥劑量的上升而上調(diào);Caspase上游基因Procaspase-3、9蛋白酶表達(dá)隨著劑量的增加而明顯減小，這個結(jié)果表明Caspase-3、9活性成分被剪切下來，從而激活Caspase-3、9表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

通過本次扶正消積膠囊作用于BGC-823胃癌細(xì)胞體外實驗，發(fā)現(xiàn)扶正消積膠囊能顯著抑制BGC-823胃癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡;其可能機(jī)制為激活Caspase通路以及下調(diào)Bcl-2、Bcl-xl、Survivin蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)。

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（2020-03-15收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）