周亞兵 蔣思韻 王利維 華麗

摘要 目的：基于氣道IL-17/IL-23炎癥介質(zhì)軸，探討人參皂苷Rg1對PM2.5哮喘大鼠肺損傷保護(hù)機(jī)制。方法：采集并分離交通相關(guān)大氣細(xì)顆粒物PM2.5，利用卵白蛋白致敏和激發(fā)建立幼齡哮喘大鼠模型，再給予PM2.5氣管滴注建立PM2.5哮喘肺損傷模型，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測定血清和肺泡灌洗液IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1含量，RT-PCR檢測RORγt mRNA表達(dá)，并行肺組織病理和電鏡分析。結(jié)果：成功建立PM2.5氣管滴注哮喘大鼠模型;哮喘大鼠模型血清和肺泡灌洗液IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1表達(dá)量增大（P<0.01），肺組織RORγt mRNA表達(dá)量增加（P<0.01）;經(jīng)PM2.5氣管滴注后，模型組大鼠血清和肺泡灌洗液IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1含量進(jìn)一步增加，RORγt mRNA表達(dá)量進(jìn)一步上升（P<0.01）;經(jīng)皂苷Rg1干預(yù)后，呈現(xiàn)劑量依賴性下調(diào)血清和肺泡灌洗液IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1水平，下調(diào)RORγt mRNA表達(dá)量。結(jié)論：人參皂苷Rg1呈劑量依賴性改善PM2.5致哮喘大鼠肺氣道炎癥反應(yīng)、改善肺損傷。

關(guān)鍵詞 哮喘;大氣顆粒物2.5;輔助性T細(xì)胞17;白細(xì)胞介素-17;白細(xì)胞介素-23;維A酸相關(guān)孤兒受體γt;人參皂苷Rg1

Abstract Objective：Based on the airway IL-17/IL-23 inflammatory factor axis，to explore the protective mechanism of Ginsenoside Rg1 on lung injury in PM2.5 asthmatic rats.Methods：PM2.5 was isolated and sensitized by ovalbumin，and then PM2.5 was intratracheal instilled to establish PM2.5 asthmatic lung injury model.The levels of IL-17a，IL-6，IL-23 and TGF-β1 in serum and BALF were measured by ELISA.The expression of RORγt mRNA was detected by RT-PCR，and the lung tissue pathology and electron microscopy were analyzed.Results：The asthmatic rat model of PM2.5 was established successfully; The expression of IL-17a，IL-6，IL-23 and TGF-β1 in serum and BALF of asthmatic rats increased（P<0.01），and the expression of RORγt mRNA in lung tissue increased（P<0.01）; After PM2.5 intratracheal instillation，the contents of IL-17a，IL-6，IL-23 and TGF-β1 in serum and BALF of model group were further increased，and the expression of RORγt mRNA was further increased（P<0.01）;After intervention with saponin Rg1，IL-17a，IL-6，IL-23，TGF-β1 in serum and BALF were decreased in a dose-dependent manner，and RORγt mRNA expression was down regulated.Conclusion：Ginsenoside Rg1 can improve airway inflammation and lung injury induced by PM2.5 in a concentration dependent manner.

Keywords Asthma; atmospheric particulate matter 2.5; helper T cell 17; IL-17;IL-23;retinoic acid related orphan receptor γt; ginsenoside Rg1

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.004

大氣顆粒物PM2.5（Particulate Matter 2.5），因其粒徑小、比表面積大、組成復(fù)雜，易富集有毒有害物質(zhì)，隨呼吸可進(jìn)入肺泡深部，甚至透過呼吸膜進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)[1]。研究已證實(shí)PM2.5與呼吸、心腦血管及免疫系統(tǒng)的疾病關(guān)系密切，兒童機(jī)體發(fā)育尚未完善，更易受到PM2.5的危害[2-4]，導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)損傷和功能缺陷，影響肺功能，導(dǎo)致兒童哮喘患病率和癥狀嚴(yán)重程度增加[5-7]。Th17作為重要炎癥細(xì)胞，在多種炎癥反應(yīng)疾病中發(fā)揮重要作用;IL-23具有激活記憶T細(xì)胞向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能;維A酸相關(guān)孤兒受體γt（Retinoid Acid-related Orphan Receptor Gamma t，RORγt）是Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵核因子及Th17細(xì)胞譜系特異性轉(zhuǎn)錄激活因子，可誘導(dǎo)調(diào)控IL-17高水平分泌，誘導(dǎo)多種細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)而導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)哮喘發(fā)病[8]。人參皂苷Rgl（Ginsenoside-Rgl，G-Rgl）具有抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)、抗纖維化和神經(jīng)保護(hù)作用[9]，對膿毒癥肺損傷有修復(fù)作用[10]，那么，皂苷Rg1對PM2.5損傷哮喘大鼠肺氣道是否有修復(fù)保護(hù)作用？本實(shí)驗(yàn)成功建立PM2.5氣管滴注亞急性損傷哮喘大鼠模型，以TH17細(xì)胞的分化和調(diào)節(jié)為主軸，探討人參皂苷Rg1對PM2.5哮喘大鼠肺損傷保護(hù)機(jī)制，以期尋找藥物作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

雄性2周齡無特定病原體（SPF）級Wistar大鼠100只，體質(zhì)量（50±5）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[合格證號SYXK（滬）2012-0002]，飼養(yǎng)于新華醫(yī)院清潔級動(dòng)物中心[SYXK（滬）2013-0031]，所有操作均嚴(yán)格按照中國倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則進(jìn)行。飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度光照12 h/12 h明暗交替環(huán)境。

1.1.2 藥物 人參皂苷Rg1（Sigma公司，美國，貨號：18826）。

1.1.3 試劑與儀器

雞卵白蛋白（Sigma公司，美國，貨號：A21772）;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒，大鼠IL-17a（貨號：BMS635）、IL-6（貨號：ERA31RB）、IL-23（貨號：ERA28RB）、IL-22（貨號：ERA27RB）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）（貨號：BMS623-3）、TRIzol試劑盒（貨號：15596018），以上試劑盒均購自美國Invitrogen 公司。兔抗鼠抗體RORγt多克隆抗體（Takara公司，日本，貨號：RR037A）;定量PCR儀及配套分析軟件（Roche公司，美國，型號：96LightCycler）;大氣顆粒物大流量采樣器（型號：Anderson G-2.5）、酶標(biāo)儀（型號：MultiskanTM FC），以上購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與分組

1.2.1.1 大氣顆粒物PM2.5制備 在市區(qū)某建筑物樓頂（高度10 m，周圍無明顯污染源），大流量采樣器采集大氣顆粒物，將吸附細(xì)顆粒物的濾膜裁剪為1 cm×3 cm大小，浸入去離子水中，超聲振蕩30 min×3次，洗脫細(xì)顆粒物，振蕩液用6層紗布過濾，濾液在低溫離心機(jī)4 ℃下10 000 r/min，離心半徑8 cm，離心20 min，將濃縮上清液及底層顆粒物合并冷凍真空干燥，低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 二步法建立PM2.5亞急性損傷哮喘大鼠模型

第1步：建立大鼠哮喘模型：雄性2周齡Wistar大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，在第1天和第7天腹腔注射卵清蛋白（OVA）（1 mg）和氫氧化鋁凝膠（50 mg）混合液共1 mL致敏;在第14天置于半透明霧化吸入箱中，超聲霧化吸入1%OVA激發(fā)，30 min/次，隔天1次，連續(xù)7 d。最后1次激發(fā)24 h內(nèi)記錄各組模型鼠發(fā)病情況，以大鼠出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促、腹肌抽搐、口唇發(fā)紺為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。

第2步：氣管滴注法建立PM2.5再損傷哮喘大鼠模型：符合哮喘標(biāo)準(zhǔn)大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，共72只，采用氣管滴注法將PM2.5混懸液注射到支氣管深部染毒，PM2.5滴注劑量為5 mg/（kg·bw），用前超聲振蕩5 min混勻，隔天氣管滴注染毒1次，維持21 d。另設(shè)生理鹽水滴注哮喘大鼠作為對照（A組）。

1.2.1.3 分組方法 將PM2.5亞急性損傷哮喘大鼠分為3組：PM2.5亞急性損傷哮喘組（A+PM組）、人參皂苷Rg1低劑量組（L-Rg組）、高劑量組（H-Rg組）。另設(shè)同齡正常對照組（N組）、哮喘組（A組），各組8只。

1.2.2 給藥方法

Rg1低劑量組（PM+Rg-L組）、高劑量組（PM+Rg-H組），分別按照10 mg/kg、20 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)腹腔內(nèi)注射;PM2.5亞急性損傷哮喘對照組（PM+A組）、正常對照組（N組）、哮喘組（A組）予以等體積生理鹽水腹腔內(nèi)注射。1次/d，連續(xù)給藥14 d，第15天處死采集標(biāo)本。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 肺組織病理學(xué)及電子顯微鏡觀察

最后一次給藥后，水合氯醛[10%，3 mL/（kg·bw）]麻醉大鼠，取各組大鼠右肺上葉，多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度4～6 μm，HE染色，中性樹膠封固，光鏡下觀察支氣管、肺泡及肺泡隔炎性細(xì)胞浸潤情況。另取標(biāo)本用于電子顯微鏡觀察氣道上皮，肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮細(xì)胞、肺泡間質(zhì)變化。

1.2.3.2 血清TGF-β1、IL-6、IL-17a、IL-23水平測定

分離血清，采用雙抗體夾心ELISA法測定，按照連續(xù)倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，混捕獲微球，制備細(xì)胞因子檢測抗體，然后將樣本與檢測抗體混勻，室溫避光孵育1 h，洗滌后全自動(dòng)酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度值（A450）并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 肺泡灌洗液IL-6、IL-17a、IL-23水平測定

左肺行肺泡灌洗液，暴露氣管，剪一斜口，插入帶有聚乙烯管的肺灌洗針頭，結(jié)扎固定;磷酸緩沖液（PBS）按35 mL/（kg·bw）?？偡稳萘俊?.6（右肺占總肺容量的60%）的灌洗量進(jìn)行肺灌洗;同時(shí)輕輕按壓胸腔，緩慢抽出氣管內(nèi)PBS再重新緩慢注入，如此反復(fù)灌洗3次，回抽率>85%，得到支氣管肺泡灌洗液。用雙抗體夾心ELISA法測定，按照連續(xù)倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，然后將樣本與檢測抗體混勻，室溫避光孵育1 h，洗滌后全自動(dòng)酶標(biāo)儀450 nm波長處，測定吸光度值（A450）并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.4 RT-PCR檢測肺組織RORγt mRNA表達(dá)

右下肺組織置于凍存管中，液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，采用TRIZOL法提取肺組織總RNA，取5 μL逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以2.5 μL cDNA為模板，分別應(yīng)用各組上下游引物行PCR擴(kuò)增，引物序列：RORγt上游5′-AGTGTAATGTGGCC-3′，下游5′-GCTGCTGTTGCAGTTGTTTCT-3′，以相對表達(dá)量2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量，采用Roche軟件分析RT-PCR條帶平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），多組間比較采用方差分析（方差齊性），多組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

經(jīng)卵蛋白致敏激發(fā)后，哮喘組（A組）大鼠均出現(xiàn)喘息、呼吸急促、點(diǎn)頭呼吸、弓背、前肢縮抬等哮喘癥狀。經(jīng)PM 2.5氣道滴注后，PM+A組喘息、呼吸急促、點(diǎn)頭呼吸、弓背、前肢縮抬等癥狀更加明顯。經(jīng)人參皂苷Rg1干預(yù)后，人參皂苷Rg1低、高劑量組（PM+Rg-L組、PM+Rg-H組）癥狀均改善。

2.2 人參皂苷Rg1對PM2.5哮喘大鼠肺組織病理的影響

N組大鼠氣管黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列整齊，肺泡結(jié)構(gòu)正常，無明顯滲出，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤（圖1-a）。哮喘組支氣管管腔變窄，管壁增厚，黏膜脫落，平滑肌增生，炎性細(xì)胞明顯浸潤，呈團(tuán)塊狀聚集，肺泡擴(kuò)張（圖1-b）。經(jīng)PM2.5損傷哮喘組管壁明顯增厚，管腔變窄，肺泡塌陷，部分肺泡破裂融合，肺間質(zhì)反應(yīng)性增生明顯，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞明顯增多（圖1-c）。經(jīng)人參皂苷Rg1干預(yù)后，大鼠管壁變薄，吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量減少（圖1-d、e）。

2.3 PM2.5亞急性損傷哮喘大鼠肺電鏡結(jié)果

N組肺組織電鏡結(jié)構(gòu)氣管管腔完整，肺泡結(jié)構(gòu)常，無明顯滲出物，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤（圖2-a）。A組管腔變窄，管壁增厚，平滑肌增生，炎性細(xì)胞明顯浸潤，呈團(tuán)塊狀聚集（圖2-b）。經(jīng)PM2.5損傷哮喘組可見大氣顆粒物沉積于管腔和肺泡，部分肺泡破裂融合，肺間質(zhì)反應(yīng)性增生明顯，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞明顯增多（圖2-c）。經(jīng)人參皂苷干預(yù)后，大鼠管壁變薄，吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量減少（圖2-d、e）。

2.4 人參皂苷Rg1對PM2.5哮喘大鼠血清IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1的影響

與N組比較，經(jīng)卵蛋白激發(fā)誘導(dǎo)后，A組血清IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1的表達(dá)量增大（P<0.01）;經(jīng)PM2.5氣管滴注后，PM+A組大鼠血清IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1進(jìn)一步增加（P<0.01）;經(jīng)人參皂苷Rg1干預(yù)后，可明顯下調(diào)血清IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1水平，PM+Rg-H組下降更為顯著（P<0.01）。見表1。

2.5 人參皂苷Rg1對肺泡灌洗液IL-17a、IL-6、IL-23的影響

與N組比較，經(jīng)卵蛋白激發(fā)誘導(dǎo)后，A組肺泡灌洗液IL-17a、IL-6、IL-23表達(dá)量增高（P<0.01）;經(jīng)PM2.5氣管滴注后，PM+A組大鼠肺泡灌洗液IL-17a、IL-6、IL-23水平進(jìn)一步增加（P<0.01）;經(jīng)人參皂苷Rg1干預(yù)后，可明顯下調(diào)IL-17a、IL-6、IL-23水平，PM+Rg-H組下降更為明顯（P<0.01）。見表2。

2.6 人參皂苷Rg1對肺組織RORγt mRNA表達(dá)的影響

RORγt是Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素，TGF-β、IL-6通過誘導(dǎo)RORγt表達(dá)，啟動(dòng)RORγt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。A組大鼠經(jīng)卵蛋白激發(fā)后，肺組織RORγt mRNA表達(dá)量增加（P<0.01）;經(jīng)PM2.5氣管滴注14 d后，RORγt mRNA表達(dá)量進(jìn)一步上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。經(jīng)人參皂苷Rg1干預(yù)后，RORγt mRNA表達(dá)量下調(diào)，PM+Rg-H組下降更為明顯（P<0.01）。見表3。

3 討論

我國PM2.5主要來源于燃煤、機(jī)動(dòng)車尾氣、土壤沙塵、建筑塵、冶煉塵等，其中機(jī)動(dòng)車尾氣已經(jīng)超越燃煤成為城市PM2.5主要來源[11]。北京、上海、深圳機(jī)動(dòng)車尾氣PM2.5分別占到31.1%、29.2%和41%[12]。PM2.5顆粒直徑小，會(huì)以更高的速率穿透呼吸道并沉積在肺泡中，其所包裹的毒性物質(zhì)如有機(jī)物（OM）、硫酸鹽（SO42-）、硝酸鹽（NO3-）、銨鹽（NH4+）和礦塵等，可致應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及過敏反應(yīng)[13]。Meta分析我國1989—2014年文獻(xiàn)顯示PM2.5每增加10 μg/m3，呼吸系統(tǒng)疾病死亡率增加0.50%[14]。歐洲空氣污染影響隊(duì)列研究（ESCAPE）證實(shí)住宅附近PM2.5每增加5 μg/m3，兒童FEV1降低1.77%[15]。居住地距離主干道越近兒童，F(xiàn)VC降低越明顯[16]。

Th17細(xì)胞是一種不同于Thl和Th2的CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。TGF-β、IL-6作為誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，通過激活STAT3（Signal Transducer and Activator of Tranions 3）信號通路，活化Th17細(xì)胞分化關(guān)鍵核因子RORγt，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化和IL-17分泌[17-21]，進(jìn)而誘導(dǎo)更多細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，促進(jìn)氣道內(nèi)炎性細(xì)胞募集和激活，導(dǎo)致哮喘發(fā)病[22]。IL-17共6個(gè)亞型，其中IL-17a是重要的炎癥介質(zhì)，能引起組織壞死、器官衰竭，與哮喘氣道炎癥反應(yīng)的急性加重正相關(guān)[23]。IL-23是由活化的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞等產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)，促進(jìn)活化的Th17細(xì)胞生長和增殖，缺乏IL-23的小鼠體內(nèi)幾乎檢測不到Thl7細(xì)胞存在[24]，IL-23能保持Th17細(xì)胞穩(wěn)定分泌IL-17a、IL-17f和IL-22等炎癥介質(zhì)[8，25]。

本研究顯示卵白蛋白激發(fā)哮喘大鼠血清和肺泡灌洗液IL-17a、IL-23、TGF-β1、IL-6增加;經(jīng)PM2.5氣管滴注后哮喘大鼠血清和肺泡灌洗液IL-17a、IL-23、TGF-β1、IL-6進(jìn)一步增加;肺組織RORγt mRNA表達(dá)量上升。推測PM2.5及其有毒成分通過刺激TGF-β1、IL-6增高，來促進(jìn)Th17細(xì)胞分化;同時(shí)通過激活STAT3-RORγt-IL-17/IL-23信號通路，上調(diào)RORγt mRNA和蛋白高表達(dá)，誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th17分化，釋放IL-17、IL-23炎癥介質(zhì)。IL-23具有穩(wěn)定維持Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17a等炎癥介質(zhì)作用，可持續(xù)增強(qiáng)致炎效應(yīng)，促進(jìn)氣道重塑，肺組織支氣管充血水腫，黏膜細(xì)胞脫落以及炎性細(xì)胞浸潤等癥狀，最終導(dǎo)致哮喘發(fā)作或者加重。這與其他臨床報(bào)道結(jié)果一致，哮喘患者BALF中IL-17、TGF-β明顯增加，且在暴露于過敏原時(shí)，水平進(jìn)一步迅速增加，提示IL-17、TGF-β是氣道重塑和氣道炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，并與哮喘嚴(yán)重程度存在一定相關(guān)性[26-27]。

人參性平味甘微苦，有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津安神之功效，主要含有皂苷（Ginsenoside，GS）、多聚糖、多肽、聚炔醇和脂肪酸等活性成分。其中，皂苷Rgl為四環(huán)三萜類衍生物，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)、抗纖維化和神經(jīng)保護(hù)作用等功效[28-30]。有研究證明Rg1對內(nèi)毒素導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用，對肺缺血再灌注損傷具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡作用[10，31-32]，改善肺組織肺泡結(jié)構(gòu)和肺間質(zhì)炎性浸潤，對膿毒癥肺損傷有修復(fù)作用[33-34]。

本研究顯示經(jīng)皂苷Rg1干預(yù)后，可明顯下調(diào)PM2.5哮喘大鼠血清和肺泡灌洗液IL-6和TGF-β1含量，RORγt mRNA表達(dá)量下調(diào)，進(jìn)而抑制IL-17a、IL-23的表達(dá)和釋放，以上結(jié)果隨著Rg1劑量上升而下降更為顯著，并改善肺泡結(jié)構(gòu)，減輕肺間質(zhì)炎性浸潤，說明皂苷Rg1呈劑量依賴性對于PM2.5致哮喘大鼠肺損傷，具有抑制氣道炎癥反應(yīng)、改善肺損傷的作用。因此，人參皂苷Rg1有望用于PM2.5致氣道損傷的有效藥物。

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（2020-09-20收稿 責(zé)任編輯：徐穎）