李揚(yáng)凡，邵美琪，劉暢, 郭慶港，王培培，陳秀葉，蘇振賀，馬平?

1河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071000；2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071000；3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095

0 引言

【研究意義】隨著馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的提出，馬鈴薯在我國(guó)的種植面積逐年擴(kuò)大。由立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）引起的馬鈴薯黑痣病是馬鈴薯產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的主要土傳真菌病害[1]，由于馬鈴薯抗黑痣病品種較少、輪作倒茬在一些區(qū)域?qū)嵤├щy，造成土壤中黑痣病菌逐年積累，導(dǎo)致馬鈴薯黑痣病的發(fā)生逐年加重，發(fā)病嚴(yán)重地塊的發(fā)病率甚至可高達(dá)70%—80%[2]，嚴(yán)重影響了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。長(zhǎng)期以來，化學(xué)殺菌劑在防治馬鈴薯黑痣病中發(fā)揮主要作用。使用甲基立枯磷拌種或嘧菌酯溝施和拌種可以顯著降低馬鈴薯黑痣病的發(fā)生[3-4]。然而化學(xué)農(nóng)藥的大量不合理施用也帶來農(nóng)藥殘留、水土污染等一系列問題。因此，有必要尋求其他安全有效的防治措施。【前人研究進(jìn)展】活體微生物殺菌劑是防治作物土傳病害行之有效且對(duì)環(huán)境安全的措施之一，目前已經(jīng)開發(fā)出多個(gè)防治作物土傳病害的微生物殺菌劑。國(guó)內(nèi)外針對(duì)馬鈴薯黑痣病開展了生防菌的篩選工作，IKEDA等[5]研究發(fā)現(xiàn)，利用 104—105孢子/mL的寡雄腐霉（Pythium oligandrum）卵孢子處理薯塊，可以顯著降低馬鈴薯黑痣病的發(fā)生。寡雄腐霉通過定殖于馬鈴薯根際，降低根際黑痣病菌的數(shù)量，從而發(fā)揮生防效果；BEAGLE-RISTAINO等[6]發(fā)現(xiàn)綠色木霉（Trichodermaviride）T-1-R9孢子處理土壤可以抑制黑痣病菌菌核的萌發(fā)，降低土壤中絲核菌的數(shù)量，從而有效抑制馬鈴薯黑痣病的發(fā)生。枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）及其近緣種由于能形成耐逆、抗熱的芽孢而利于產(chǎn)品的創(chuàng)制和保存，因此成為研發(fā)微生物殺菌劑的重要資源；HUSSAIN等[7]篩選獲得一株抑制黑痣病菌生長(zhǎng)、有效防治馬鈴薯黑痣病的生防細(xì)菌——枯草芽孢桿菌HussainT-AMU菌株，證明該菌株主要通過產(chǎn)生脂肽類抗生素發(fā)揮防治黑痣病的作用，但該研究未明確脂肽類抗生素中具有抑菌活性的組分；馬龍等[8]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌QHZ-M1菌株對(duì)馬鈴薯黑痣病菌具有較強(qiáng)的抑菌活性；KHEDHER等[9]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌V26菌株可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和蛋白酶抑制馬鈴薯黑痣病菌的生長(zhǎng)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】明確生防細(xì)菌主要抑菌活性物質(zhì)有助于細(xì)菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化，但目前關(guān)于枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類抗生素對(duì)馬鈴薯黑痣病菌的拮抗活性和作用機(jī)制未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過生理生化和基因序列比對(duì)方法對(duì)生防細(xì)菌進(jìn)行鑒定，通過液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)明確生防細(xì)菌產(chǎn)生的主要抑菌活性物質(zhì)，通過real-time PCR技術(shù)分析解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）HMB33604菌株對(duì)馬鈴薯根際黑痣病菌數(shù)量的影響。明確生防細(xì)菌防治馬鈴薯黑痣病的作用機(jī)制，為生防細(xì)菌的定向發(fā)酵以及施用方式提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年12月至2020年3月在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 試驗(yàn)材料

供試馬鈴薯品種為荷蘭15號(hào)，該品種對(duì)黑痣病表現(xiàn)感病。馬鈴薯黑痣病菌（RhizoctoniasolaniAG-3）和供試土壤細(xì)菌由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室分離保存。

PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基：用于真菌的培養(yǎng)，1 L水中加入200 g新鮮馬鈴薯，煮沸30 min，雙層紗布過濾除去馬鈴薯殘?jiān)＿^濾液中加入葡萄糖20 g，瓊脂12 g，用水補(bǔ)足至1 L后121℃高壓滅菌30 min。LB液體培養(yǎng)基：用于細(xì)菌的培養(yǎng)，1 L水中含有胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，pH 7.0，121℃高壓滅菌30 min。LB固體培養(yǎng)基：用于細(xì)菌的培養(yǎng)，1 L水中含有胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂12 g，pH 7.0，121℃高壓滅菌30 min。BUG培養(yǎng)基：用于細(xì)菌Biolog分析時(shí)細(xì)菌的培養(yǎng)，稱取57 g的BUG 放入1 L蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min。IF-A接種液：購(gòu)自Biolog公司，用于細(xì)菌菌種Biolog的鑒定。

1.2 馬鈴薯黑痣病菌拮抗菌的篩選

通過平皿對(duì)峙法篩選對(duì)馬鈴薯黑痣病菌拮抗活性較強(qiáng)的拮抗細(xì)菌。將馬鈴薯黑痣病菌接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿。在菌落邊緣用打孔器打取直徑6 mm的菌塊，接種在直徑9 cm培養(yǎng)皿中PDA培養(yǎng)基中央。距離病原菌菌落邊緣2 cm的位置對(duì)稱點(diǎn)接供試細(xì)菌菌株，每個(gè)培養(yǎng)皿接4個(gè)細(xì)菌菌株，以只接種病原菌的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，27℃黑暗培養(yǎng)4 d，測(cè)量細(xì)菌抑菌帶寬度，根據(jù)抑菌帶寬度篩選拮抗活性較強(qiáng)的拮抗細(xì)菌。

1.3 馬鈴薯黑痣病生防菌的篩選

在溫室條件下采用盆栽接種試驗(yàn)方法篩選馬鈴薯黑痣病的生防菌。

拮抗菌株發(fā)酵液的制備：將拮抗菌株接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，按接種量1%轉(zhuǎn)接于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵液。利用梯度稀釋法測(cè)定發(fā)酵液中的菌體濃度（cfu/mL）。

拮抗菌株盆栽防治效果測(cè)定：用打孔器打取直徑6 mm的馬鈴薯黑痣病菌菌塊，接種在直徑9 cm的PDA培養(yǎng)基中央，25℃培養(yǎng)7 d后，用勻漿機(jī)充分打碎培養(yǎng)物后與干土混勻（1 皿病原菌﹕1.3 kg干土）制成菌土，其中干土為滅菌土與滅菌草炭按照1﹕1（v/v）混勻而成。將帶有兩個(gè)芽眼的薯塊在供試拮抗菌株發(fā)酵液中浸泡 1 h，然后種植于裝有1.3 kg菌土的花盆（150 mm×170 mm）中，每個(gè)處理種植10塊種薯，以無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基處理薯塊作為空白對(duì)照，以250 g·L-1嘧菌酯懸浮劑100倍稀釋液浸泡薯塊為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)處理 3次重復(fù)。將種植馬鈴薯的花盆置于 20℃、相對(duì)濕度 55%、CO2濃度為982.35 mg·m-3的人工氣候室中培養(yǎng)（光照﹕黑暗=16 h﹕8 h），25 d后調(diào)查馬鈴薯發(fā)病情況，并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

馬鈴薯苗期黑痣病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)病斑的橫向平均長(zhǎng)度總和占地下莖周長(zhǎng)的比例衡量發(fā)病嚴(yán)重度[10]。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：植株沒有病斑；1級(jí)：嚴(yán)重度為1%—25%；2級(jí)：嚴(yán)重度為26%—50%；3級(jí)：嚴(yán)重度為51%—75%；4級(jí)：嚴(yán)重度為76%—100%。病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值）×100；防治效果（%）=[（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)]×100。

1.4 生防細(xì)菌的分類鑒定

生防細(xì)菌的Biolog微生物系統(tǒng)鑒定參照Biolog微生物鑒定的廠家說明。生防細(xì)菌的分子鑒定采用改良的CTAB法提取HMB33604菌株基因組DNA[11]。首先擴(kuò)增 16S rDNA 基因[12]（27F：5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-CTACGGCTACCTTGT TACGA-3′）部分序列，通過序列比對(duì)初步確定細(xì)菌屬級(jí)水平的分類地位，然后通過對(duì)HMB33604菌株全基因組序列進(jìn)行分析，獲得看家基因gyrA（GenBank No：MW030640）、gyrB（GenBank No：MW030641）、rpoB（GenBank No：MW030639）和rpoC（GenBank No：MW030638）基因序列。利用CLUSTAL X（2.0）分別對(duì)gyrA、gyrB、rpoB、rpoC進(jìn)行 Alignment，將比對(duì)后的序列用EditPlus Text Editor v3.70（290）進(jìn)行拼接，最后利用 MEGA 5.05軟件通過鄰接法（neighbor-joining，NJ）進(jìn)行1 000次相似度重復(fù)計(jì)算構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]，根據(jù)聚類結(jié)果對(duì)HMB33604菌株進(jìn)行分子鑒定。

1.5 生防細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物的防病效果測(cè)定

將供試生防菌株接種于 5 mL液體 LB培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，按接種量2%轉(zhuǎn)接于 100 mL優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中（數(shù)據(jù)未發(fā)表），振蕩培養(yǎng)48 h后得到生防菌發(fā)酵液，菌體的發(fā)酵濃度為1×109cfu/mL。發(fā)酵液8 000 r/min離心20 min，收集上清并用細(xì)菌過濾器（0.22 μm，Biosharp）過濾除菌，過濾液即為無(wú)菌體上清液；發(fā)酵液8 000 r/min 離心20 min，棄上清，用滅菌水重新懸浮菌體至原有體積即為生防菌菌體懸浮液（1×109cfu/mL）。

將帶有芽眼的馬鈴薯薯塊分別在生防菌發(fā)酵液、上清液和菌體懸浮液中浸泡1 h，以無(wú)菌優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基浸泡馬鈴薯為空白對(duì)照，每個(gè)處理種植10塊種薯，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。馬鈴薯生長(zhǎng)條件同方法1.3，并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

1.6 生防細(xì)菌抑菌物質(zhì)的分離鑒定

利用鹽酸沉淀、甲醇溶解方法提取生防菌株脂肽類物質(zhì)[14]。將HMB33604菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。按1%接種量接入100 mL Landy培養(yǎng)基[11]中，30℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)液于4℃、8 000 r/min離心20 min，收集上清，并用6 mol·L-1的HCl調(diào)節(jié)pH為2.0，4℃靜置過夜。次日于4℃、8 000 r/min離心20 min，收集沉淀。沉淀物經(jīng)自然風(fēng)干后，用15 mL甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾后于4℃保存。

采用高效液相色譜（HPLC）對(duì)HMB33604菌株脂肽提取物中的活性物質(zhì)進(jìn)行分離和純化。色譜柱型號(hào)為SOURCE 25RPC ST 4.6/100。流動(dòng)相A液包含650μL三氟乙酸、20 mL乙腈和980 mL超純水。流動(dòng)相B液包含500 μL三氟乙酸、800 mL乙腈和200 mL超純水。檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，流速為1 mL·min-1。梯度洗脫過程為54 min內(nèi)流動(dòng)相A由100%到0%。手動(dòng)收集HPLC的各組分，在超凈工作臺(tái)中吹干后，用8 mL甲醇使其溶解，經(jīng)0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用UPLC-Triple TOF-MS/MS（AB Triple TOF TM 5600 system-MS/MS and SHIMADZU LC-30 AD）測(cè)定活性成分的分子量，根據(jù)測(cè)得的分子量對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行鑒定。分離色譜柱型號(hào)為C18色譜柱（Agilent，100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。色譜分離條件：柱溫 40℃，流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量4 μL。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化（ESI+）源；霧電壓（IS）5 kV；噴霧氣（GS1）50 psi；輔助加熱氣（GS2）50 psi；輔助加熱氣溫度350℃；TOF MS掃描質(zhì)合比范圍：m/z 200-400；采集模式：飛行時(shí)間全掃描質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜（TOF MS IDAMS-MS）模式；TOF MS觸發(fā)二級(jí)掃描范圍：m/z 50-4000；去簇電壓（DP）100 V；MS-MS碰撞能量（CE）Rolling collision energy。

用牛津杯法測(cè)定菌株脂肽提取物中不同組分對(duì)馬鈴薯黑痣病菌的抑菌活性。將直徑6 mm的黑痣病菌菌塊接種在直徑為9 cm培養(yǎng)皿中PDA培養(yǎng)基中央，距離真菌2 cm的位置放置牛津杯，每個(gè)牛津杯分別加入100 μL脂肽提取物的不同組分，以甲醇作為對(duì)照，25℃培養(yǎng)箱黑暗靜置培養(yǎng)10 d，比較HMB33604菌株脂肽提取物中不同組分對(duì)馬鈴薯黑痣病菌的抑菌活性。

1.7 生防菌處理后馬鈴薯根際黑痣病菌的定量檢測(cè)

采用 CTAB法提取黑痣病菌的基因組DNA，以RsTqF1（5′-AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT-3′）和 RsTqR1（5′-AATTCCCCAACTGTCTCACA AGTT-3′）[15]為特異性引物擴(kuò)增馬鈴薯黑痣病菌AG-3菌株中98 bp的ITS序列，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD-19T載體上并在大腸桿菌DH5α中進(jìn)行擴(kuò)繁。對(duì)含有PCR擴(kuò)增片段的 T載體進(jìn)行 10倍系列稀釋，然后進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，以質(zhì)粒DNA量（copies）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Real-time PCR擴(kuò)增采用20 μL體系：2×TransStart?Top Green SuperMix（+DyeⅡ）10 μL，引物為 RSTqF1和 RSTqR1 各 0.4 μL，DNA 模板 2 μL，超純水 7.2 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。

將調(diào)查病級(jí)后的馬鈴薯植株從花盆中拔出，用力抖落根上附著的土，用毛刷刷下來剩余的土即為馬鈴薯根際土。利用土壤基因組 DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取生防菌發(fā)酵液、上清液和菌體懸浮液處理馬鈴薯根際土壤總DNA，進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。根據(jù)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較不同處理根際馬鈴薯黑痣病菌的群體密度（copies/g土壤）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics Version 20進(jìn)行單因素方差分析，并且使用Duncan法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 馬鈴薯黑痣病生防細(xì)菌的篩選

通過平板對(duì)峙法對(duì)筆者實(shí)驗(yàn)室保存的2 106株土壤細(xì)菌進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，篩選得到61株對(duì)馬鈴薯黑痣病菌抑菌能力較強(qiáng)的拮抗菌株，抑菌帶在6—16 mm，抑菌率均＞70%（結(jié)果未列出）。在溫室條件下對(duì) 61株抑菌活性較強(qiáng)的拮抗細(xì)菌進(jìn)行馬鈴薯黑痣病的防治效果評(píng)價(jià)，獲得3株對(duì)馬鈴薯黑痣病具有較強(qiáng)防病效果的細(xì)菌（表1），其中 HMB33604菌株對(duì)馬鈴薯黑痣病的防治作用最強(qiáng)，達(dá)到 52.9%。其次是 HMB28363和HMB32830菌株，防治效果分別為45.9%和44.1%。因此，后續(xù)對(duì)HMB33604菌株開展進(jìn)一步研究。

表1 拮抗菌株對(duì)馬鈴薯黑痣病的防治效果Table 1 Biocontrol efficacy of antagonistic bacteria on potato black scurf

2.2 HMB33604菌株的鑒定

通過Biolog微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)HMB33604菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明HMB33604菌株與莫海威芽孢桿菌（Bacillusmojavensis）相似度最高，達(dá)到0.697。

擴(kuò)增HMB33604菌株的16S rDNA基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后通過 BLAST序列比對(duì)，HMB33604菌株的16S rDNA基因序列與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌以及莫海威芽孢桿菌的16S rDNA基因序列同源性均為100%，表明HMB33604菌株屬于芽孢桿菌屬細(xì)菌（圖1）。進(jìn)一步擴(kuò)增HMB33604菌株的gyrA、gyrB、rpoB和rpoC基因序列，通過多基因序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，HMB33604菌株與解淀粉芽孢桿菌 NBRC 15535T菌株聚類到一個(gè)分支（圖2）。上述結(jié)果證實(shí)，HMB33604菌株為解淀粉芽孢桿菌。

2.3 HMB33604菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)馬鈴薯黑痣病的防治效果

在溫室條件下測(cè)定了 HMB33604菌株發(fā)酵液（1×109cfu/mL）、上清液和菌體懸浮液（1×109cfu/mL）對(duì)馬鈴薯黑痣病的防治效果。結(jié)果顯示菌株發(fā)酵液和上清液對(duì)馬鈴薯黑痣病的防治效果分別為52.2%和66.4%，而菌體懸浮液對(duì)馬鈴薯黑痣病的防治效果僅為16.9%（表2），表明菌株HMB33604產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在防治馬鈴薯黑痣病中發(fā)揮主要作用。

表2 HMB33604菌株發(fā)酵液、上清液和菌體懸浮液對(duì)馬鈴薯黑痣病的防治效果Table 2 Control efficacy of fermentation broth, supernatant and bacterial suspension of strain HMB33604 on potato black scurf

2.4 HMB33604菌株抑菌物質(zhì)的分離鑒定

通過平板對(duì)峙法測(cè)定HMB33604菌株脂肽粗提物對(duì)馬鈴薯黑痣病菌的抑菌活性。結(jié)果顯示，脂肽粗提物對(duì)馬鈴薯黑痣病菌具有較強(qiáng)的抑菌活性（結(jié)果未列出）。將HMB33604菌株的脂肽粗提物進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果顯示，該菌株脂肽粗提物存在3個(gè)組分，即LPⅠ、LPⅡ、LPⅢ（圖 3）。將上述 3個(gè)組分進(jìn)行UPLC-Triple TOF-MS分析，獲得組分LPⅠ的[M+H]+分別為1 043.55、1 057.56、1 071.58和1 085.59，其中每個(gè)分子量相差14 Da，且與脂肪酸鏈長(zhǎng)度-CH2相等，分別為伊枯草菌素A（C14—C17）的分子量[16-18]；組分 LPⅡ的[M+2H]2+分別為 718.39、725.40、732.40、739.41、746.42和753.43的兩類信號(hào)，分別為泛革素A（C14—C18）和泛革素 B（C14—C17）的分子量[16-18]；組分 LPⅢ的[M+H]+分別為994.64、1 008.65、1 022.67、1 036.68和1 050.70，為表面活性素（C12—C16）的分子量[14,16,19-20]（圖4）。

以甲醇作為對(duì)照，采用牛津杯法測(cè)定HMB33604菌株脂肽提取物中的3個(gè)組分對(duì)馬鈴薯黑痣病菌的抑菌活性。結(jié)果表明HMB33604菌株脂肽提取物中組分LPⅠ和LPⅡ表現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌活性，證明伊枯草菌素A和泛革素是HMB33604菌株產(chǎn)生的主要抑菌活性物質(zhì)（圖5）。

顯微觀察脂肽提取物中抑菌活性組分對(duì)馬鈴薯黑痣病菌菌絲的影響，結(jié)果顯示，菌絲經(jīng)脂肽類抗生素泛革素處理后菌絲分支增多，菌絲細(xì)胞壁消解、菌絲斷裂。菌絲經(jīng)脂肽類抗生素伊枯草菌素A處理后菌絲出現(xiàn)纏繞變形和菌絲局部膨大成球的現(xiàn)象（圖6）。

2.5 HMB33604菌株對(duì)馬鈴薯根際土中馬鈴薯黑痣病菌數(shù)量的影響

利用質(zhì)粒濃度為 1×103—1×107copies/μL 5個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得出每個(gè)反應(yīng)體系中 DNA量（copies）的對(duì)數(shù)值（x）與對(duì)應(yīng)的 Ct（y）值呈線性關(guān)系，即標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.404x+45.797，相關(guān)系數(shù)為0.997，擴(kuò)增效率為96%（圖 7）。表明該引物特異性良好，適用于土壤中馬鈴薯黑痣病菌的定量檢測(cè)。

分別提取HMB33604菌株發(fā)酵液、上清液和菌體懸浮液處理的馬鈴薯根際土壤 DNA進(jìn)行 real-time PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果依據(jù)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，即獲得不同處理馬鈴薯根際的黑痣病菌數(shù)量。結(jié)果表明，與對(duì)照土壤中黑痣病菌的數(shù)量（13.6×106copies/g土壤）相比，HMB33604菌株發(fā)酵液和上清液處理可顯著降低馬鈴薯根際土壤中黑痣病菌的數(shù)量，分別降低60.3%（5.4×106copies/g土壤）和64.0%（4.9×106copies/g土壤）；而菌體懸浮液處理的馬鈴薯根際土壤中黑痣病菌的數(shù)量?jī)H降低 10.3%，與對(duì)照相比無(wú)顯著差異（圖8）。

3 討論

本研究通過平板對(duì)峙以及溫室盆栽試驗(yàn)，獲得一株有效防治馬鈴薯黑痣病的生防細(xì)菌，通過生理生化以及基因序列比對(duì)，該菌株被鑒定為解淀粉芽孢桿菌。解淀粉芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌的近緣種，而枯草芽孢桿菌類細(xì)菌是研發(fā)微生物殺菌劑的重要資源。國(guó)內(nèi)外針對(duì)馬鈴薯黑痣病開展了生防細(xì)菌的篩選工作，發(fā)現(xiàn)一些枯草芽孢桿菌類細(xì)菌可有效抑制黑痣病菌生長(zhǎng)，降低馬鈴薯黑痣病的危害。這些枯草芽孢桿菌類細(xì)菌主要通過分泌表面活性素、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶等抑菌活性物質(zhì)而發(fā)揮生防作用[7-9]。除了產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)外，枯草芽孢桿菌類細(xì)菌還可以通過競(jìng)爭(zhēng)作用（與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)位點(diǎn)與空間位點(diǎn)，減少病原菌侵入）和誘導(dǎo)抗性（誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性）等降低土傳病害的發(fā)生。對(duì)于以競(jìng)爭(zhēng)作用為主的生防菌，其根際定殖能力和根際的群體數(shù)量決定其生防效果，因此，通過施入一定濃度的菌體懸浮液即可達(dá)到理想的防治效果?？莶菅挎邨U菌K-106的菌體懸浮液對(duì)離體葉片上的油菜菌核病具有較好的防治效果，而發(fā)酵上清液則沒有明顯的防治效果，因此，認(rèn)為競(jìng)爭(zhēng)作用是菌株K-106防治油菜菌核病的主要作用機(jī)制[21]。有些生防菌通過產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)達(dá)到防治植物病害的目的，對(duì)于這種生防菌，發(fā)酵液或發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)的濃度和活性決定了其生防效果。趙新貝等研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌 TD-7菌株發(fā)酵液和發(fā)酵濾液對(duì)番茄灰霉病具有較好的防治效果，而菌體懸浮液則沒有明顯的防治效果[22]。因此，認(rèn)為該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在病害防治中發(fā)揮重要作用。本研究中，解淀粉芽孢桿菌HMB33604菌株發(fā)酵液和上清液對(duì)馬鈴薯黑痣病的防治效果分別為 52.2%和 66.4%，而菌體懸浮液對(duì)馬鈴薯黑痣病的防治效果僅為16.9%，推測(cè)HMB33604菌株主要通過分泌抑菌活性物質(zhì)來防治馬鈴薯黑痣病。進(jìn)一步通過real-time PCR方法分析了HMB33604發(fā)酵液、上清液以及菌體懸浮液對(duì)馬鈴薯根際病原菌數(shù)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株發(fā)酵液和上清液可顯著降低馬鈴薯根際土壤中黑痣病菌的數(shù)量，而菌體懸浮液處理的黑痣病菌的數(shù)量與對(duì)照無(wú)顯著差異。推測(cè)可能是HMB33604菌株發(fā)酵液和上清液中的抑菌物質(zhì)顯著降低了馬鈴薯根際土壤中的黑痣病菌數(shù)量，從而減輕馬鈴薯黑痣病的發(fā)生。

芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，其中報(bào)道和研究最多的為脂肽類抗生素伊枯草菌素、表面活性素和泛革素[23]。研究表明，泛革素作用于病原菌菌絲細(xì)胞壁的類脂層，造成病菌菌絲染色質(zhì)濃縮、DNA鏈斷裂，破壞細(xì)胞膜透性和結(jié)構(gòu)[24]，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)[25]；伊枯草菌素與靶細(xì)胞質(zhì)膜相互作用形成離子傳導(dǎo)孔，造成病菌菌絲原生質(zhì)泄露[24]，抑制植物病原真菌的生長(zhǎng)[26]。表面活性素本身沒有抑制病原真菌的活性，但可以增加泛革素[27]和伊枯草菌素[28]的抑菌活性。本試驗(yàn)從HMB33604菌株發(fā)酵液中分離純化到3類活性組分LPⅠ、LPⅡ和LPⅢ，經(jīng)質(zhì)譜分析后發(fā)現(xiàn)組分LPⅠ、LPⅡ和LPⅢ分別為伊枯草菌素A、泛革素和表面活性素，并通過牛津杯法測(cè)定3個(gè)組分對(duì)馬鈴薯黑痣病菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)菌株產(chǎn)生的伊枯草菌素A和泛革素顯著抑制馬鈴薯黑痣病菌菌絲生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌絲纏繞變形、分支增多、菌絲局部膨大成球、細(xì)胞壁消解、斷裂，造成細(xì)胞質(zhì)外漏?？莶菅挎邨U菌類細(xì)菌可以產(chǎn)生 10多種抑菌活性物質(zhì)，其基因組中約8%的基因序列與抑菌物質(zhì)的合成有關(guān)[29]。本研究通過鹽酸沉淀的方法提取脂肽類抗生素，但有些抑菌活性物質(zhì)不屬于脂肽類抗生素，采用此方法不能將全部抑菌物質(zhì)提取出來；另外，有些抑菌物質(zhì)只有在特定培養(yǎng)條件下才大量產(chǎn)生，因此，對(duì)于HMB33604菌株是否能夠產(chǎn)生其他抑菌物質(zhì)有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從2 106株土壤細(xì)菌中篩選獲得可穩(wěn)定、有效防治馬鈴薯黑痣病的解淀粉芽孢桿菌HMB33604菌株，該菌株主要產(chǎn)生3種脂肽類抗生素（伊枯草菌素、泛革素和表面活性素），其中，伊枯草菌素和泛革素是其產(chǎn)生的主要抑菌活性物質(zhì)，可導(dǎo)致馬鈴薯黑痣病菌菌絲畸形、斷裂等。HMB33604菌株發(fā)酵液和上清液顯著降低馬鈴薯根際土中黑痣病菌的數(shù)量，說明該菌株通過產(chǎn)生抑菌物質(zhì)降低黑痣病菌的數(shù)量，從而在馬鈴薯黑痣病有效防治中發(fā)揮重要作用。