缺血性腦卒中是威脅人類(lèi)健康的主要疾病，具有高致死率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，而且其發(fā)病率仍在上升[1-3]。腦缺血損傷被認(rèn)為是缺血性腦卒中最基本的一個(gè)復(fù)雜發(fā)病機(jī)制，涉及多種生命活動(dòng)，如神經(jīng)元凋亡[4]、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[5]、促炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[6]，腦缺血導(dǎo)致局部血液阻塞，大量缺氧、缺糖從而造成大腦損傷。盡管目前對(duì)腦缺血損傷的治療有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但對(duì)于大量的腦缺血病人來(lái)說(shuō)，其治療效果仍不理想，究其原因主要是因?yàn)閷?duì)病理過(guò)程缺乏清晰的認(rèn)識(shí)。因此，闡明缺血性腦卒中的分子機(jī)制對(duì)于腦缺血損傷的有效治療具有重要意義。

microRNAs(miRNAs)是一種短的非編碼RNA，常見(jiàn)于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，主要與靶向信使RNA的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合，從而達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞的活動(dòng)[6]?，F(xiàn)有研究表明miR-19a-3p是miR-17-92的一個(gè)重要組成部分，與肺癌、胃癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌等疾病的發(fā)生有關(guān)。此外，miR-19a-3p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤組織中過(guò)表達(dá)，并與膠質(zhì)瘤病人的惡性程度密切相關(guān)，是膠質(zhì)瘤發(fā)生的重要因素之一。更重要的是，miR-17-92簇在小鼠神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，miR-17-92無(wú)論是在培養(yǎng)的缺血神經(jīng)前體細(xì)胞中還是在缺血?jiǎng)游锏男氖蚁聟^(qū)的過(guò)度表達(dá)都明顯促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，而miR-17-92、miR-18a和miR-19a-3p單個(gè)成分的抑制，阻礙了細(xì)胞增殖并增強(qiáng)細(xì)胞死亡[7]，miR-19a-3p在腦缺血損傷中的作用機(jī)制尚不確切。因此，本研究觀察大鼠體內(nèi)腦缺血神經(jīng)元損傷模型(I/R)和體外缺氧缺糖細(xì)胞模型(OGD)中miR-19a-3p在腦缺血損傷中的作用，以此闡明作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng) 神經(jīng)細(xì)胞：從新生sprague-dawley(SD)大鼠身上分離到原代神經(jīng)元細(xì)胞。用0.125%胰蛋白酶消化海馬組織10 min，分離離心后，將獲得的神經(jīng)元細(xì)胞接種于6孔板上，作用12 h。細(xì)胞維持在含2%B27、1%谷氨酰胺和阿糖胞苷的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于37 ℃下5% 的二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)。為了建立OGD模型，神經(jīng)元需在37 ℃、5%二氧化碳脫氧無(wú)糖Hanks平衡鹽溶液中培養(yǎng)。95% 氮?dú)馓幚?4 h，然后在常溫條件下培養(yǎng)即可。

星形膠質(zhì)細(xì)胞：從新生SD大鼠中分離出原代星形膠質(zhì)細(xì)胞。新皮質(zhì)解剖后用0.09%胰蛋白酶處理25 min；獲得的單個(gè)細(xì)胞離心接種于經(jīng)聚d-賴氨酸(sigma-aldrich)處理的6孔板中；用Eagle′s Minimal Essential培養(yǎng)基，10% FBS、21 mmol/L葡萄糖和10% EGF(Gibco，USA)37 ℃和5%二氧化碳培養(yǎng)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞。

1.2 大鼠缺血性腦卒中模型的建立 隨機(jī)抽取6只正常飼養(yǎng)大鼠，(8～10)周齡，體質(zhì)量(200±12)g，作為對(duì)照組；同時(shí)抽取6只正常建模缺血性腦卒中模型成年雄性SD大鼠，(8～10)周齡，體質(zhì)量(200±12)g，作為I/R模型組。I/R模型由廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院進(jìn)行腦動(dòng)脈阻塞建立而來(lái)，合格證號(hào)為SCXK2018-0008。所有大鼠均用濃度為100 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉。右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈尼龍線結(jié)扎90 min，自由活動(dòng)24 h后處死，并提取細(xì)胞按照1.1中描述方式處理后，分為OGD模型組及正常培養(yǎng)的空白對(duì)照組備用。

1.3 葡萄糖代謝變化測(cè)定 用葡萄糖攝取比色分析試劑盒評(píng)估葡萄糖的攝取和乳酸的產(chǎn)生。乳酸比色測(cè)定試劑盒為Sigma Aldrich，USA提供。

1.4 蛋白表達(dá)檢測(cè)(Western blot) 使用RIPA裂解緩沖液(Beyotime，上海，中國(guó))分離總提取蛋白，并使用BCA試劑盒(Beyotime)進(jìn)行檢測(cè)。20 μg蛋白質(zhì)通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離。隨后使用LDHA(1∶1 000，Abcam，美國(guó))、PKM2(1∶1 000，Abcam)、HK2(1∶1 000，Abcam)、Glut1(1∶1 000，Abcam)、PDK1(1∶1 000，Abcam)、Bim(1∶1 000，Abcam)、Bax(1∶1 000，Abcam)、caspase-9(1∶500，Abcam)、ADIPOR2(1∶1 000，Abcam)和GAPDH(1∶1 000，Beyotime)作為一級(jí)抗體，GAPDH作為對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 TUNEL染色 使用TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(Beyotime)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)。TUNEL染色后，用DAPI孵育細(xì)胞，使用熒光顯微鏡(Fluoview FV1000，Olympus，日本)成像，并在5個(gè)隨機(jī)場(chǎng)下計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 miR-19a-3p在神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá) 神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于缺血性腦卒中是兩個(gè)重要的組成部分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-19a-3p在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)是不同的，miR-19a-3p在神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)水平低于星形膠質(zhì)細(xì)胞(P<0.01)。詳見(jiàn)圖1。I/R大鼠體內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞以及體外培養(yǎng)的OGD神經(jīng)元細(xì)胞，miR-19a-3p表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。詳見(jiàn)圖2、圖3。表明miR-19a-3p可能參與或直接導(dǎo)致了缺血性腦卒中。

與神經(jīng)元細(xì)胞比較，＊P<0.01。

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。

與對(duì)照組比較,＊P<0.01。

2.2 I/R與OGD模型中糖代謝的抑制 缺血性腦卒中可導(dǎo)致細(xì)胞能量的喪失進(jìn)而促使細(xì)胞死亡。檢測(cè)I/R與OGD模型中糖酵解酶相關(guān)因子LDHA、PKM2、 HK2、 Glut1 和 PDK1的表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)葡萄糖攝取和乳酸的產(chǎn)生情況。I/R大鼠模型中，糖酵解酶相關(guān)因子LDHA、 PKM2、 HK2、 Glut1 和 PDK1表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.01)；葡萄糖的吸收水平和乳酸生成水平也低于對(duì)照組(P<0.01)?？梢?jiàn)保證葡萄糖代謝有助于改善缺血性腦損傷。詳見(jiàn)圖4～圖6。

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。

2.3 OGD模型中的細(xì)胞凋亡 用Tunel和Western Blot檢測(cè)OGD模型中誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白。細(xì)胞凋亡標(biāo)記物Bax、Bim和Caspase-9在OGD神經(jīng)元中被檢測(cè)到表達(dá)上調(diào)，但對(duì)照組中未檢測(cè)到(P<0.01)。詳見(jiàn)圖7。

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。

2.4 miR-19a-3p通過(guò)靶向脂聯(lián)素受體2抑制葡萄糖攝取并促進(jìn)神經(jīng)元凋亡 為了探究miR-19a-3p表達(dá)與葡萄糖代謝的關(guān)系，將miR-19a-3p或抑制劑轉(zhuǎn)染到OGD模型組，與對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞同時(shí)培養(yǎng)進(jìn)行對(duì)照，觀察其凋亡情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)miR-19a-3p轉(zhuǎn)染后，糖酵解酶的表達(dá)、葡萄糖攝取和乳酸生成均降低(P<0.01)。詳見(jiàn)圖8～圖10。

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。

2.5 脂聯(lián)素受體2介導(dǎo)miR-19a-3p在腦缺血損傷中的作用機(jī)制 在缺血性腦卒中時(shí)，脂聯(lián)素受體2是miR-19a-3p的功能效應(yīng)器，盡管實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了脂聯(lián)素受體2是miR-19a-3p的真正靶點(diǎn)，但此并不意味著miR-19a-3p在I/R損傷中的致病作用為脂聯(lián)素受體2介導(dǎo)的。為了確定這一點(diǎn)，用帶有靶點(diǎn)脂聯(lián)素受體2的siRNA，單獨(dú)或帶有miR-19a-3p抑制劑去轉(zhuǎn)染OGD神經(jīng)元。脂聯(lián)素受體2在對(duì)照組中沉默，而與miR-19a抑制劑共轉(zhuǎn)染則減輕了葡萄糖攝取和乳酸的產(chǎn)生(見(jiàn)圖11、圖12)，miR-19a-3p介導(dǎo)的缺血性腦損傷至少部分是由于脂聯(lián)素受體2的下調(diào)所引起的。

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a-3p在I/R和ODG模型中有著較高的表達(dá)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，miR-19a-3p的抑制有效緩解了I/R/OGD誘導(dǎo)的糖酵解酶表達(dá)、葡萄糖攝取和乳酸生成，同時(shí)可通過(guò)靶向脂聯(lián)素受體2調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡。因此，miR-19a-3p升高在腦缺血損傷發(fā)病中起著重要的作用。

星形膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細(xì)胞，與神經(jīng)元相互作用以維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)環(huán)境的穩(wěn)定性。腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、代謝儲(chǔ)備增強(qiáng)，神經(jīng)元凋亡延遲。miRNA異常表達(dá)水平與腦缺血受傷模型相關(guān)[8]。miR-19a-3p被發(fā)現(xiàn)于各種癌癥，尤其是星形細(xì)胞瘤，通常呈現(xiàn)過(guò)度表達(dá)水平[9]。此外，它的過(guò)度表達(dá)發(fā)生在培養(yǎng)的神經(jīng)缺血中祖細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞增殖[10]，這意味著miR-19a-3p具有發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的作用。本研究觀察到miR-19a-3p在星形膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，在神經(jīng)元中低表達(dá)，提示miR-19a-3p可能對(duì)神經(jīng)受損功能具有保護(hù)作用。

在腦缺血期間，由于完全停止缺血核心區(qū)的葡萄糖和氧氣供應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞遭受不可逆轉(zhuǎn)的損傷。因此，改善糖代謝和控制神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)改善腦缺血損傷具有重要意義。盡管本研究結(jié)果沒(méi)有顯示出具體的特異下游效應(yīng)器，但miR-19a-3p的修飾卻影響著糖酵解酶和神經(jīng)元凋亡過(guò)程。

ADIPOR2編碼脂聯(lián)素受體2，與心血管疾病、脂肪肝、糖尿病、糖尿病腎病和骨代謝紊亂有關(guān)。在每一種致病條件下，ADIPOR2的過(guò)度表達(dá)都能改善疾病的進(jìn)程。ADIPOR2過(guò)表達(dá)和缺血性中風(fēng)之間的相關(guān)性也已經(jīng)被證實(shí)[11]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)，并強(qiáng)調(diào)了檢驗(yàn)腺病毒介導(dǎo)的ADIPOR2在腦缺血損傷的體內(nèi)外模型中過(guò)表達(dá)將是一種可行的治療干預(yù)措施。最近有報(bào)道表明，在腦缺血腦損傷代謝中，星形膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元會(huì)相互作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞有待進(jìn)一步研究。此外，miR-19a-3p的其他靶點(diǎn)作用也需進(jìn)一步研究。