應(yīng)文偉，王建峰，丁振山，陳 星，何宇輝，王愛軍，周曉峰★

（1.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院泌尿外科，北京 100029；3.北京大學(xué)第一醫(yī)院 泌尿外科，北京 100034）

在世界范圍內(nèi)，膀胱癌（BCa）在癌癥中死亡率排名第九[1]。盡管手術(shù)等治療的方法已有很大改善，但膀胱癌的復(fù)發(fā)率仍然很高，預(yù)后很差[2]。導(dǎo)致膀胱癌發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制尚不清楚，越來越多的證據(jù)表明，某些lncRNA 在膀胱癌的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。例如，MALAT1 通過特異性抑制miR-125b 并激活靶基因Bcl-2 和MMP-13 來促進(jìn)膀胱癌[3]。Wang 等研究發(fā)現(xiàn)BCAR4 在膀胱癌中高表達(dá)，進(jìn)一步研究表明BCAR4 促進(jìn)膀胱癌的發(fā)展[4]。Xiong 等報(bào)道，NRON 表達(dá)的增加可促進(jìn)膀胱癌的增殖、轉(zhuǎn)移和EMT 過程[5]。

近年來，越來越多的研究人員探究了MIR100HG 與肺癌[6]、乳腺癌[7]、大腸癌[8]和其他腫瘤之間的關(guān)系。但MIR100HG 與膀胱癌發(fā)展之間的關(guān)系尚未確定。在本研究擬探討MIR100HG在膀胱癌中的表達(dá)模式，并在體外細(xì)胞及裸鼠體內(nèi)驗(yàn)證MIR100HG 對膀胱癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

樣本來自2016年2月～6月中日友好醫(yī)院確診的5 例膀胱癌患者。同時(shí)取10 例的20 個(gè)樣本用做驗(yàn)證。研究得到中日友好醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均簽署了知情同意書，并且了解研究的所有細(xì)節(jié)。將所有收集的組織樣品在RNAlater中冷凍并儲(chǔ)存在-80℃。至少2 名病理學(xué)家參與了病理診斷。

1.2 RNA 提取和qRT-PCR

TRIzol 試劑盒（購自Invitrogen）用于從組織樣品和膀胱癌細(xì)胞中提取總RNA。根據(jù)制造商的指南，PrimeScript RT 預(yù)混液（購自TaKaRa）用于反轉(zhuǎn)錄。然后，使用一步TB Green PrimeScript RT-PCR 試劑盒（購自TaKaRa）在ABI 7500 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（Thermo 公司）上進(jìn)行了定量實(shí)時(shí)PCR（qRT-PCR）。引物序列設(shè)計(jì)如下：MIR100HG 正向，5'-TGCCAGCAGCCATGAGAA-3'，反向，5'-TTGTGAGGTGGAGGAAGGAG-3'；GAPDH 正向，5'-GTCTTCACCACCATGGAGAA-3'，反向，5'-TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-3'。GAPDH 被用作內(nèi)參。MIR100HG 和GAPDH 在不同的孔中擴(kuò)增并一式三份。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡

RIPA 裂解緩沖液用于從細(xì)胞中提取總蛋白。將提取的蛋白質(zhì)與上樣緩沖液混合，通過SDSPAGE 分離，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，然后用5%脫脂牛奶溶液封閉1h。將膜與一抗：α- tubulin（購自Proteintech，11224 -1 -AP，1 ∶5000）、HNRNPA2B1抗體（購自Abcam，31645，1∶2000），4℃過夜，在室溫下用辣根與過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育1h。使用ECL 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測信號(hào)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

人膀胱癌細(xì)胞系EJ 和5637 購自中國科學(xué)院細(xì)胞系（中國上海）。在補(bǔ)充有10%胎牛血清和100U/ml 青霉素和鏈霉素的RPMI-1640（均購自Gibco）完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)5637 和EJ 細(xì)胞。將細(xì)胞在37℃下在具有5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)

通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）測定法（購自Dojindo Molecular Technologies）分析細(xì)胞的增殖能力。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的膀胱癌細(xì)胞系接種到96 孔板中。進(jìn)一步孵育1d、3d 和5d 后，將10μl CCK-8溶液添加到相應(yīng)的孔中2h。最后，通過酶標(biāo)儀在450nm 波長下測量每個(gè)孔的光密度（OD）值。該測定在3 個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中一式兩份進(jìn)行。

1.6 侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)

遷移實(shí)驗(yàn)在具有8μm 孔徑聚碳酸酯膜的24孔Transwell 小室中進(jìn)行（購自BD 公司），侵襲實(shí)驗(yàn)在Matrigel 涂層的Transwell 小室中進(jìn)行（購自BD 公司）。簡而言之，將轉(zhuǎn)染的膀胱癌細(xì)胞（5×104個(gè)/孔）用無血清培養(yǎng)基接種到上腔室中，并將含15%FBS 的培養(yǎng)基添加到下腔室中。溫育24h 后固定、染色、計(jì)數(shù)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)

用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素和碘化丙啶（購自Invitrogen 公司）處理5637 細(xì)胞。室溫下黑暗中染色15min 后，將0.3ml 結(jié)合緩沖液添加到每個(gè)制備管中。用FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（BD公司）測量細(xì)胞凋亡率。

1.8 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)

該研究得到中日友好醫(yī)院動(dòng)物保護(hù)與福利委員會(huì)的批準(zhǔn)。皮下注射腫瘤細(xì)胞到每組6 只小鼠的側(cè)面皮下，注射后4 周處死小鼠。游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長度（L）和寬度（W），腫瘤體積（V）＝（L×W 2）×0.5。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

取3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA MIR100HG在膀胱癌中下調(diào)

首先，對5 例患者的臨床樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）（其中男3例、女2 例，年齡68±12.24 歲），根據(jù)|log2Ratio|≥1 和q＜0.05 篩選差異表達(dá)基因。分析結(jié)果顯示，篩選出1752 個(gè)差異表達(dá)基因，其中1243 個(gè)上調(diào)而509 個(gè)下調(diào)（圖1A，彩插二）。隨后，我們對10 例患者的20 個(gè)樣品進(jìn)行了qRT-PCR 驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)MIR100HG 的表達(dá)顯著下調(diào)（FC＝0.4，P＜0.01，圖1B、C，彩插二）。通過探索基于從TCGA 數(shù)據(jù)庫中提取的數(shù)據(jù)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫（starBase，http：//starbase.sysu.edu.cn/），分析膀胱癌中MIR100HG 的水平。與正常樣本相比，MIR100HG在膀胱癌組織中呈下降趨勢（FC＝0.16，P＜0.01；圖1D，彩插二），與我們先前的研究結(jié)果一致。我們進(jìn)一步對患者臨床特征進(jìn)行分析，MIR100HG 的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度或TNM 分期無關(guān)（均P＞0.05）。

圖1 MIR100HG在膀胱癌中的表達(dá)情況

2.2 LncRNA MIR100HG在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

通過qRT-PCR 檢測MIR100HG 在人膀胱上皮細(xì)胞系（SV-HUC-1）和5 種人膀胱癌細(xì)胞系（5637、EJ、BIU-87、SW780 和UM-UC-3）中的表達(dá)情況。我們觀察到，與人膀胱上皮細(xì)胞系相比，MIR100HG 在人膀胱癌細(xì)胞系5637、EJ 和BIU-87 中的表達(dá)水平顯著降低，而在SW780 和UMUC-3 細(xì)胞中，MIR100HG 的表達(dá)顯著增加（P＜0.01，圖2A）。為了研究MIR100HG在膀胱癌細(xì)胞中的功能，我們建立了穩(wěn)定表達(dá)MIR100HG 的5637 和EJ 細(xì)胞。結(jié)果表明，MIR100HG 的表達(dá)水平顯著高于對照5637 細(xì)胞或空載體5637 細(xì)胞（命名為pLOV 細(xì)胞，P＜0.01；圖2B）。

圖2 MIR100HG在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.3 LncRNA MIR100HG 過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖

為探究MIR100HG 對體外膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響，我們分別進(jìn)行了CCK-8 和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，過表達(dá)MIR100HG 顯著抑制了5637 和EJ 膀胱癌細(xì)胞的增殖（P＜0.01，圖3A、B），但對膀胱癌細(xì)胞的凋亡沒有影響（P＞0.05，圖3C-F）。

圖3 過表達(dá)MIR100HG 對膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.4 LncRNA MIR100HG 過表達(dá)抑制膀胱癌侵襲

行Transwell 實(shí)驗(yàn)以檢測MIR100HG 對膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力的影響。結(jié)果表明，過表達(dá)MIR100HG 顯著抑制了膀胱癌細(xì)胞的侵襲（P＜0.01；圖4A，彩插二），但對膀胱癌細(xì)胞的遷移能力沒有影響（P＞0.05；圖4B，彩插二）。

圖4 過表達(dá)MIR100HG抑制膀胱癌侵襲

2.5 HNRNPA2B1 的表達(dá)與lncRNA MIR100HG相關(guān)

用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Starbase 分析可能與MIR100HG 相互作用的RNA 結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）。隨后，我們對MIR100HG的潛在目標(biāo)進(jìn)行了初步篩選，共發(fā)現(xiàn)51 個(gè)目標(biāo)（表1 示前5 個(gè)）。利用在線數(shù)據(jù)庫GEPIA（gepia.cancer-pku.cn/）和UniProt（https：//www.uniprot.org/）逐一比較這51 個(gè)目標(biāo)，發(fā)現(xiàn)HNRNPA2B1 可能與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在過表達(dá)MIR100HG 的細(xì)胞中，HNRNPA2B1 的蛋白質(zhì)水平被下調(diào)（圖5A，彩插二）。這表明HNRNPA2B1 的表達(dá)可能與MIR100HG有一定相關(guān)性。

表1 RBP-MIR100HG 相互作用的前5 個(gè)目標(biāo)

圖5 MIR100HG與HNRNPA2B1相關(guān)性和裸鼠的體外腫瘤形成情況

2.6 LncRNA MIR100HG 過表達(dá)抑制裸鼠的腫瘤形成

我們使用皮下異種移植小鼠模型，評(píng)估MIR100HG 對裸鼠體內(nèi)腫瘤生長的影響。分別注射5637 細(xì)胞和過表達(dá)MIR100HG 的5637 細(xì)胞到BALB/c Nu 小鼠的腋側(cè)。注射后4 周，與對照組相比，MIR100HG 過表達(dá)組的腫瘤體積和重量顯著降低（圖5B、C，彩插二）。表明MIR100HG 在體內(nèi)抑制膀胱癌腫瘤的生長。

3 討論

膀胱癌預(yù)后不良和復(fù)發(fā)的問題，仍然是臨床上的主要挑戰(zhàn)。膀胱癌的病因涉及多種致癌基因和抑癌基因的變化。我們的研究證明了MIR100HG在膀胱癌中的作用。

3.1 LncRNA MIR100HG在膀胱癌中的表達(dá)模式及功能

越來越多的證據(jù)表明，MIR100HG 在各種人類腫瘤類型中均具有基因拷貝數(shù)變異。Yu 等進(jìn)行了2 個(gè)非小細(xì)胞肺癌微陣列數(shù)據(jù)集的微陣列基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)與正常肺組織相比，MIR100HG在腫瘤組織中的表達(dá)水平降低了[6]。相反，Lu 等報(bào)道了在結(jié)腸直腸癌中MIR100HG 高表達(dá)，并與西妥昔單抗耐藥有關(guān)[8]。Su 等人在骨肉瘤中，還發(fā)現(xiàn)MIR100HG 高水平表達(dá)，它通過LATS1 和LATS2的表觀遺傳沉默和Hippo 通路失活促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展[9]。在急性巨核細(xì)胞白血病原始細(xì)胞中，MIR100HG 也呈現(xiàn)高水平表達(dá)。另外，Emmrich 等人的研究首次發(fā)現(xiàn)MIR100HG 在骨髓性白血病的發(fā)展中充當(dāng)造血和致癌的調(diào)節(jié)劑[10]。所有這些結(jié)果充分證明了MIR100HG 與腫瘤細(xì)胞存活密切相關(guān)。

根據(jù)上述文獻(xiàn)，我們想確定MIR100HG在膀胱癌中是否也有差異表達(dá)。我們對膀胱癌臨床樣品中MIR100HG 的表達(dá)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果表明，MIR100HG 在腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織，并且在公共數(shù)據(jù)庫獲得了一致的結(jié)果。

3.2 LncRNA MIR100HG 對體外和體內(nèi)膀胱癌細(xì)胞功能的影響

我們構(gòu)建了體外穩(wěn)定過表達(dá)MIR100HG 的膀胱癌細(xì)胞，進(jìn)行了增殖、凋亡、遷移和侵襲等功能測定，發(fā)現(xiàn)MIR100HG 過表達(dá)顯著抑制了膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲。在裸鼠體內(nèi)研究中，我們也發(fā)現(xiàn)MIR100HG 的高表達(dá)抑制腫瘤發(fā)生。

有文獻(xiàn)表明，GATA6 蛋白與MIR100HG 之間的雙重負(fù)調(diào)控環(huán)是西妥昔單抗耐藥的基礎(chǔ)[8]。為在公共數(shù)據(jù)庫確定與MIR100HG 相互作用的潛在RBP，我們發(fā)現(xiàn)HNRNPA2B1 的表達(dá)可能與MIR100HG 有關(guān)。