王明禮，錢珊珊，李艾黎，姜瞻梅，侯俊財

(1.東北農業(yè)大學 食品學院，哈爾濱150030；2.東北農業(yè)大學 國資處，哈爾濱150030)

0 引 言

牛乳是日常膳食中常見的食品，被認為是母乳的良好替代品。盡管如此，近些年，牛乳在一些西方國家的消費量有降低的趨勢[1]。除飲食習慣外，造成這一現(xiàn)象的主要原因是乳及乳制品在食用后會出現(xiàn)胃腸道不適和呼吸道癥狀，嚴重者會休克甚至死亡[2]。牛乳過敏（Cow's milk allergy,CMA）是一種針對乳蛋白的異常免疫反應，由一種或多種乳蛋白與免疫機制的相互作用產生，同時也是嬰幼兒時期最常見的食物過敏類型[3-4]。針對牛乳過敏問題，現(xiàn)階段的研究聚焦在通過蛋白質改性技術和調節(jié)機體免疫過程以降低蛋白的致敏性。本文主要介紹牛乳中主要的致敏蛋白及其致敏機理，同時對近些年國內外降低牛乳致敏性方法進行綜述，為低致敏型乳制品開發(fā)提供理論參考。

1 牛乳過敏的發(fā)生

牛乳蛋白過敏的發(fā)生一方面是由于牛乳中蛋白組分和含量與母乳中蛋白的差異，另一方面則與機體的消化系統(tǒng)和胃腸黏膜的免疫能力密切相關。表位是引起免疫反應的主要原因，根據與抗體結合的氨基酸形式的不同，可以將其分為構象表位和線性表位[5]。構象表位是指蛋白質的空間結構通過折疊等聚集在一起，而在一級序列中距離較遠的氨基酸形成的表位，這種表位的形成主要依賴于蛋白質的空間結構，而線性表位是指抗體能夠連續(xù)識別的氨基酸序列形成的表位[6]。CMA患者中最常見的3種過敏原：α-酪蛋白（α-casein,α-CN），β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin,β-LG）和α-乳白蛋白（α-Lactalbumin,α-LA）[7]都含有能被機體免疫系統(tǒng)識別的構象表位或線性表位而表現(xiàn)出致敏性。牛乳酪蛋白組分中，4種蛋白組分以膠束的形式形成直徑在100～300 nm之間的球形有序聚集體[8]。乳酪蛋白由于與母乳中酪蛋白的組分、含量和結構上的差異而存在致敏性，不同哺乳動物酪蛋白之間的氨基酸序列同源性高達90%，因此具有廣泛的交叉過敏性[9]。在酪蛋白中，αs1-酪蛋白（αs1-casein,αs1-CN）是牛乳中含量最高的蛋白質，同時也是最具致敏性的蛋白質。β-LG主要以天然二聚體形式或單體的形式存在，由于其對蛋白酶和酸性條件水解的高度穩(wěn)定性以及在母乳中不存在等原因而具有致敏性[10]。α-LA通過4個二硫鍵保持結構穩(wěn)定的單體球狀蛋白，從牛到人和嚙齒類動物的序列分析發(fā)現(xiàn)α-LA氨基酸序列具有高達75%的同源性，也具有較高的交叉過敏性[11]。

通常，可以將CMA分為IgE介導、非IgE介導和兩者混合介導3種類型，其中以IgE介導的過敏反應居多[12]。對于IgE介導的免疫反應來說，當人體首次接觸牛乳過敏原時，牛乳蛋白被樹突狀細胞攝取、加工后提呈給初始CD4+淋巴細胞，在過敏原和其他細胞因子刺激下分化成Th1、Th2、Th17和Treg等不同的效應T細胞，而后刺激B細胞合成IgE抗體，IgE抗體通過特定的Fc受體與肥大細胞結合，隨后過敏原與受體結合的IgE結合，使機體處于致敏階段[13]。當機體再次接觸致敏乳蛋白時，乳蛋白與肥大細胞表面的IgE結合，使肥大細胞脫粒，釋放出組胺等活性物質，引起機體的過敏反應（如圖1）。

圖1 牛乳過敏的反應機理[13]

2 牛乳蛋白改性方法

現(xiàn)階段，一些應用于乳蛋白的改性方法主要有熱處理、加壓處理、射線、超聲、化學物質修飾、酶的作用、復合改性以及基因改性等。由于酪蛋白中缺少三級結構，致敏表位以線性表位為主，乳清蛋白含有穩(wěn)定的空間結構，既含有線性表又含有構象表位，因此，通過蛋白質改性技術，能夠使乳蛋白的三維結構發(fā)生變化，構象表位會隨空間結構的展開而丟失，只留下線性表位，線性表位在化學物質或生物成分的作用下被遮蔽或水解，達到降低致敏性的目的。

2.1 物理改性

2.1.1 熱處理

熱處理是較為常見的食物處理方式，通過熱處理可能會對牛乳的致敏性產生影響。一方面，熱處理誘導的蛋白結構修飾會引起表位片段化、掩蔽和解掩蔽等變化，使大部分的構象表位被破壞[14]；另一方面，乳蛋白會與乳中含有的乳糖等還原糖會在升溫過程中加速美拉德反應過程，產生的聚合物由于引入了糖分子，空間位阻和電荷作用修飾蛋白的抗原表位，對致敏性產生影響[15]。然而，對蛋白結構的改變，可能會潛在的促進蛋白的敏感性或暴露和形成新的致敏表位從而增加牛乳的致敏性[16]（如圖2）。因此針對不同類型的乳蛋白，通過熱處理可能會降低、增加和不影響致敏性。牛乳蛋白的致敏性差異不僅取決于加熱的溫度和時間，還取決于與其他食物基質成分的相互作用，所以熱處理可以作為生產低致敏性食品工藝中的一部分。

圖2 熱處理引起的食物過敏原的構象變化及其對免疫反應的影響

2.1.2 加壓改性

高壓加工是一種新型的非熱加工技術，較高的壓力能通過影響蛋白分子中的氫鍵、離子鍵和疏水鍵等相互作用去改變蛋白的高級結構，以調節(jié)其致敏性[17-18]。通過壓力處理能有效影響乳蛋白的致敏性，Bogahawaththa等[19]研究了脫脂牛乳在不同壓力處理后的變化，發(fā)現(xiàn)高壓通過硫醇/二硫鍵交互作用誘導形成蛋白聚集體，使蛋白質二級結構變化導致蛋白質變性，使蛋白質的免疫原性減弱。動態(tài)高壓微流化技術是一種涉及到強剪切力、高顛簸、迅速釋放壓力和氣穴作用等綜合作用的新型高壓技術[18]，現(xiàn)有的研究表明使用低于80 MPa的動態(tài)高壓處理會導致β-LG抗原性增加，而高于80 MPa的處理則會導致致敏性明顯降低[20]。

盡管許多研究都集中在壓力對牛乳的影響，但目前為止，加壓處理的牛乳產品尚未商業(yè)化生產，其中限制因素之一就是成本。此外，加壓處理還會影響牛乳的顏色，通過影響酪蛋白膠束的結構導致膠束發(fā)生不可逆變化，較小的膠束變得不透明，使牛乳的顏色從白色變成淡黃色[21]，這無疑也影響了消費者的購買欲望。

2.1.3 射線輻照改性

輻照技術是通過60Co-γ射線或電子束處理食物的方法，在輻照處理下，一方面牛乳溶液中的致敏蛋白會直接吸收輻照能，另一方面，輻照作用于食物中的水分子，產生能與致敏蛋白的氨基發(fā)生反應的·H和·OH等自由基，使牛乳溶液中共價鍵被破壞，引起蛋白質二級和三級構象的變化，減弱牛乳過敏原激發(fā)Th2型過敏反應的能力[22-23]。

α-LA和β-LG對γ射線的敏感性高于其他蛋白質，同時輻照對蛋白結構和免疫反應性的影響還取決于使用的劑量。Yang等[24]發(fā)現(xiàn)使用5k Gy輻照處理后，β-LG的聚集性增加，表面疏水性降低，β-LG誘導的Ca2+內流被抑制，減緩了IgE介導的過敏反應。先前的研究中表明使用劑量3 k Gy和10 k Gy輻照處理時，β-LG由于聚集體的形成降低了IgE結合能力，盡管更高劑量的處理也能破壞抗原表位，但也會導致牛乳風味變差和營養(yǎng)品質的下降[25]。盡管有了一些成果，但輻照處理技術還仍處于發(fā)展初級階段，其產物安全性研究也未開展研究。

2.1.4 超聲波處理

超聲處理在食物干燥、滅菌、過濾和肉嫩化等方面具有廣泛的應用，但在減少食物過敏原方面是一種新興技術。在乳制品系統(tǒng)中，高功率超聲通過液體介質時會產生空化效應，液體中溶解氣泡在超聲的影響下振蕩，隨著時間的推移兩個或多個氣泡可以通過合并而結合，當達到一定尺寸時會導致塌縮[26]，能量的釋放會增加介質中的溫度和壓力，這些作用誘導了蛋白天然結構的多種變化，例如：二級結構變化、分子內或分子間相互作用的產生和二硫鍵的重組等變化[27]，對牛乳的致敏性產生影響（如圖3）。與其他改性方式不同，日常食品加工中很少直接使用超聲波處理降低食物的致敏性，而是選擇與其他技術聯(lián)合使用或將超聲作為預處理過程，一些超聲波聯(lián)用技術如表1所示。

圖3 超聲波空化效應及應用

表1 超聲波復合改性技術

2.2 化學改性

2.2.1 糖基化

糖基化反應在牛乳中通常以美拉德反應的形式發(fā)生，通過美拉德反應能改變蛋白質的分子結構，引入的糖分子會對致敏表位進行修飾，得到致敏性較低的乳糖-β-乳球蛋白，牛乳中自身存在的乳糖與β-LG的反應可以增強其免疫原性。

除乳糖外，還可以利用一些低聚糖與乳蛋白的反應改善牛乳的致敏性[34]。Zhang等[35]對比了葡萄糖、麥芽糖和麥芽低聚糖與α-LA反應后的抗原性變化，發(fā)現(xiàn)糖基化反應可以顯著改變α-LA的結構，所有糖基化樣品的抗原性均隨反應時間而顯著降低。楊錚[36]探究了糖基化對β-LG與αs1-CN免疫原性的影響，發(fā)現(xiàn)采用低聚半乳糖與低聚殼聚糖均能有效降低β-LG與αs1-CN的抗原性。使用糖基化方法能夠有效的降低牛乳的致敏性，同時還克服了使用酶水解方式產生的苦味，推動了乳及乳制品的發(fā)展。但該處理能否獲得有效成果還取決于反應條件、反應程度以及糖類的數量和分子量，還有可能帶來不需要的顏色變化和風味化合物以及大量的蛋白質變性和聚集等不良后果。

2.2.2 其他化學修飾

除了利用糖基化反應外，還可以通過乙?；㈢牾；?、磷酸化和甲基化等（如表2）對蛋白質進行化學修飾，以改善牛乳品質。

表2 乙?；?、琥珀酰化和磷酸化處理對乳蛋白的影響

2.3 生物法改性

2.3.1 酶法水解

利用酶法改性最常見的方式就是使用各種蛋白水解酶進行酶水解，通過酶水解，蛋白構象表位迅速崩潰，線性表位被裂解，因此為了降低致敏性，可以選擇將牛乳蛋白水解為不會引起過敏的小肽和游離氨基酸，同時還能增加牛乳的吸收率[44]。由于直接對生牛乳進行水解比較困難，所以一般在水解前進行加熱、加壓等預處理，通過這些預處理過程能將蛋白的構象展開使酶水解過程更加徹底[45]。由于不同乳蛋白的致敏原表位不同，所以選擇恰當的酶仍然是酶法改性的關鍵，目前一些用于工業(yè)化生產的酶及作用位點如表3所示。

表3 一些工業(yè)生產酶及作用效果

2.3.2 發(fā)酵改性

乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）是牛奶微生物的組成部分，一些LAB菌株產生的蛋白酶能夠水解負責CMA蛋白質的致敏表位并降低免疫球蛋白的識別能力從而降低其致敏潛力。例如，Kordesedehi等[51]對從駱駝生乳樣品中分離的糞腸球菌進行試驗，發(fā)現(xiàn)其能夠水解αs1-CN中主要過敏原表位在內的許多位點，有效的降低了αs1-CN的致敏性。除LAB外，其他微生物、動物或植物的蛋白酶也能用于水解乳蛋白并降低其抗原性，但在水解過程中會產生一些苦味肽，這極大地影響了乳制品的開發(fā)和應用[52]。

2.3.3 酶法交聯(lián)

酶法交聯(lián)技術是利用酶催化蛋白質分子內或分子間通過形成共價鍵發(fā)生蛋白交聯(lián)的過程，在反應過程中，原有的過敏原蛋白的空間結構會隨之改變，原有的過敏表位參與交聯(lián)被破壞或被埋藏在蛋白分子內部，使蛋白致敏性降低，但近些年在這當面的研究相對較少。

程偉[53]探究了多酚氧化酶交聯(lián)對α-LA致敏原性的影響，發(fā)現(xiàn)α-LA交聯(lián)產物的IgG和IgE的結合能力均顯著降低。Wróblewska等[54]將轉谷氨酰胺酶添加到發(fā)酵的牛奶中制備成開啡爾飲品，發(fā)現(xiàn)在飲品中未檢測到β-LG與特異性抗體之間的反應。

2.4 基因技術

牛遺傳學一直致力于研究定量特征位點或與重要生物表型有關的遺傳變異，多年來一直是研究的活躍領域。在牛乳中使用轉基因方法主要是為了增加乳汁產量或改變乳汁成分，通過基因方式可以對乳蛋白過敏原表位的基因進行編碼，使之無法生成過敏原表位，基因重組也可以改變過敏原的基因序列，從而去除其過敏性[55]。Wei等[56]應用了精確的受精卵介導的基因組編輯以消除致敏性的β-LG，發(fā)現(xiàn)孕育的小牛由于缺失9個堿基對，產生了不含β-LG的乳汁，這證實了通過基因技術安全生產低反應原性牛乳的可行性。在山羊上采用類似的方法，通過核移植在引入人類乳鐵蛋白基因的同時，產生了完全去除β-LG的山羊乳，這使得生產含有高濃度人類乳鐵蛋白的牛奶成為可能[57]。

DNA甲基化（DNA methylation,DNAm）是一種表觀遺傳機制，是通過將S-腺苷蛋氨酸中的甲基添加到DNA鏈上實現(xiàn)的，DNAm的改變在T細胞分化和維持Th1/Th2平衡中起關鍵作用[58-59]。現(xiàn)有的研究表明IgE介導的CMA患兒具有更明顯的Th1和Th2細胞因子基因DNA甲基化模式，這都表明DNA甲基化可能是CMA防治的一個靶點[60]，但這一研究領域仍處于起步階段，仍需要大量的探究去確認。

3 調節(jié)免疫反應緩解致敏性

通過對蛋白的改性能有效降低機體識別能力與IgE的結合能力，最近的研究也表明腸道菌群和益生菌通過調節(jié)免疫反應同樣對過敏反應起作用。根據分泌的細胞因子的不同，將CD4+T細胞分為Th1和Th2兩個亞型，各種類型的亞型T細胞通過分泌不同的細胞因子共同調節(jié)機體的免疫反應，Th1型細胞主要分泌IFN-γ、IL-12等細胞因子，Th2型細胞主要分泌IL-3、IL-4、IL-5、IL-9和IL-13等細胞因子，這些細胞因子對肥大細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞和黏液生成細胞的分化、存活和活性等密切相關[61]。當CMA兒童接觸過敏原時，機體內T細胞活化后傾向于向Th2型分化，原本的Th1/Th2平衡被打破，Th2細胞分泌過多的IL-4會促進IgE的分泌水平，影響過敏反應[62]，此外，Treg/Th17的失衡也會誘發(fā)過敏癥狀。

3.1 腸道菌群與牛乳過敏

腸腔中定居著成千上萬種共生微生物，當人出生時這些微生物就定植在腸道中，但隨著人的生長，微生物的種類也發(fā)生著改變。當機體處于健康狀態(tài)時，腸道菌群會保持著動態(tài)平衡，但這種平衡被破壞，腸道菌群對先天性淋巴細胞調節(jié)發(fā)生紊亂導致過敏反應。與健康兒童相比，CMA兒童的腸道菌群失調，糞便細菌多樣性顯著降低[63]，梭狀芽孢桿菌綱和疣微菌科在腸道菌群中的豐度顯著增加，一些菌對T細胞受體信號傳導、IL-4信號傳導起著調節(jié)作用，所以菌群的變化對過敏性疾病有相關的作用[64]。Feehley等[65]用健康兒童和CMA兒童的糞便培養(yǎng)無菌小鼠，在小鼠中確定了一種可以防止食物過敏反應的梭狀芽胞桿菌，通過這種菌株小鼠對牛乳蛋白的反應性降低，這表明腸道細菌對調節(jié)飲食抗原的過敏反應也至關重要。

食物在腸道中代謝的產物能夠向機體一些信號，不同的膳食代謝后產生的營養(yǎng)物質不同，會產生不同的腸道菌群組成，調節(jié)不同的免疫應答[66]。膳食纖維消化后產生的短鏈脂肪酸能與G蛋白偶聯(lián)受體結合，促使腸上皮細胞激活炎性小體產生IL-18，以維持腸道的完整性和修復腸上皮細胞損傷，同時還能作用于樹突狀細胞，促進Th0細胞分化為Foxp3+Treg或促進Foxp3+Treg自身增殖[64]。Foxp3+Treg能夠分泌TGF-β、IL-10、IL-35維護口服耐受性或促進分泌IgA/IgG4型B細胞維護口服耐受性[66]。此外，胎兒從出生時免疫反應表現(xiàn)為Th2優(yōu)勢，出生后暴露于各種微生物下，導致免疫反應逐漸向Th1轉化，有利于維護免疫耐受及Th1/Th2的平衡[67]。

3.2 益生菌與牛乳過敏

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，現(xiàn)階段對益生菌的研究主要集中在乳桿菌屬和雙歧桿菌屬。當機體出現(xiàn)過敏癥狀時，腸道黏膜上皮細胞的形態(tài)可能沒有明顯的損傷，但是黏膜免疫屏障已經被破壞，腸道的通透性顯著增加[68]，益生菌能夠抑制病原菌生長和增加屏障功能，促進腸內抗原的降解/結構修飾，促使腸道內異常原生微生物菌群正常化，從而影響腸道微環(huán)境和免疫系統(tǒng)[69]。Basturk等[70]探究了鼠李糖乳桿菌和無乳飲食對CMA患者的效果，結果表明接受飲食4周后，食用益生菌試驗組的嬰兒在血便、腹瀉、鎮(zhèn)靜和腹脹癥狀方面有顯著改善（p≤0.001），粘液性糞便（p=0.038）和嘔吐（p=0.034）的癥狀顯著改善，這表明嬰兒在接受鼠李糖乳桿菌飲食后其過敏癥狀明顯改善。

益生菌調節(jié)牛乳過敏反應的作用還體現(xiàn)在其對Th1/Th2、Th17/Treg細胞平衡的調控。變應性炎癥的效應細胞受Treg細胞促進和抑制等功能的調控，Treg細胞抑制Th2細胞及其細胞因子的產生，產生的IL-10和轉化生長因子-β在抑制IgE的產生的同時，誘導非炎癥性免疫球蛋白IgG4的產生[61]。Zhang等[71]發(fā)現(xiàn)通過嗜酸乳桿菌KLDS 1.0738能有效改善過敏小鼠的Treg/Th17失衡，降低了β-LG的過敏癥狀。Wróblewska等[72]評估了一些潛在的益生菌對乳蛋白免疫活性的影響，發(fā)現(xiàn)益生菌會影響調節(jié)性細胞因子的分泌，使Th1/Th2平衡朝著Th1反應轉變，降低了過敏反應。益生菌能夠除了通過誘導Treg細胞生成，抑制Th2細胞極化，促進Th1細胞分化，還能促進樹突狀細胞的成熟和IgE的產生[73]（如圖4）。益生菌還能夠通過調節(jié)樹突狀細胞多表達MHC-Ⅱ、CD80和CD86等共刺激分子，調控樹突狀細胞的成熟和細胞因子的分泌，以調節(jié)機體黏膜免疫反應與耐受的平衡[74]。雖然益生菌能有效緩解過敏癥狀，但如今的研究還只是局限于動物實驗的基礎上，鮮有臨床的應用，所以下一步的研究應向臨床應用邁進。

圖4 副干酪乳桿菌L9減緩牛乳過敏的機制[75]

4 結束語

綜上所述，乳蛋白中存在的線性表位與構象表位是引起免疫學反應的基礎，可以通過物理方法、化學方法、生物方法和基因技術改變乳蛋白的不同結構，通過對構象的破壞以達到減緩牛乳過敏的目的。其中，通過酶法水解或發(fā)酵技術能有效降低牛乳的致敏性，與其他方式相比擁有較好的優(yōu)越性，有較好的市場前景。同時，與單一技術相比，多種技術復合使用時可以發(fā)揮協(xié)同作用展現(xiàn)出較好的抑制效果；例如，超聲與其他方式結合使用時由于協(xié)同作用，效果較單一技術應用時要好。通過腸道菌群和益生菌的作用可以調節(jié)Th1/Th2和Treg/Th17細胞失衡，降低IgE的產生，減緩過敏癥狀。但如何在能降低過敏反應的同時，開發(fā)更具安全、有效的脫敏技術，開發(fā)滿足人們營養(yǎng)與口感的新型乳制品仍需要進一步的深入研究和探討。